于德陽 馬儷珍

摘 要：為提高革胡子鯰魚（Clarias gariepinus）副產物的附加值，以鯰魚頭/魚排為基料進行美拉德反應，制備魚味調味料。將鯰魚頭/魚排經(jīng)過高壓浸提、酶解、發(fā)酵等過程，分別得到酶解液（enzymatic hydrolysate，EH）、發(fā)酵液（fermentation broth，F(xiàn)B）、基于酶解的發(fā)酵液（fermentation broth based on enzymatic hydrolysis，F(xiàn)BEH），固定美拉德反應的溫度（100 ℃）、時間（2.5 h）、pH值（5.5～7.0）和添加物，在此基礎上分別添加不同量EH、FB、EH∶FB、EHFB進行單因素試驗，于280 nm和420 nm波長處測定美拉德反應產物（Maillard reaction products，MRPs）

吸光度（A280 nm和A420 nm），分別表示MRPs中低分子質量香味中間體和類黑精的相對含量，并對MRPs做感官評定。結果表明，在美拉德反應體系中分別添加50% EH、40% FB、EH∶FB=3∶1（V/V）、40% EHFB時，制備得到4 種MRPs的A280 nm和A420 nm值均達到最大值，其中以40% EHFB為最優(yōu)，該條件下制備所得MRPs的A280 nm和A420 nm分別為0.855和0.185，表明低分子質量香味中間體和類黑精生成量較高;感官評定結果也表明，40% EHFB條件下制備所得MRPs顏色呈棕紅色，光澤度較好，肉香味濃郁，無刺激味和腥味，感官評分最高（9.0）。

關鍵詞：鯰魚頭/魚排;酶解;發(fā)酵;美拉德反應

Preparation of Maillard Reaction Products from Catfish Heads/Bones

YU Deyang， MA Lizhen*

（College of Food Science and Biotechnology， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract： In order to increase the added value of catfish by-products， Maillard reaction products （MRPs） were prepared from catfish heads/bones for use as a seasoning ingredient. The starting material was extracted with water in an autoclave， and the extract was fermented with a commercial starter culture directly or after enzymatic hydrolysis. Different amounts of the fermented extract， the hydrolyzed extract and their mixture as well as the fermented hydrolysate separately underwent Maillard reaction at 100 ℃ for 2.5 h at pH 5.5–7.0. Absorbance values at 280 （A280 nm） and 420 nm （A420 nm） of the resulting MRPs were determined， which respectively represent the relative contents of low-molecular-mass aroma intermediates and melanoidin in the MRPs， and sensory evaluation was performed as well. The results showed that the optimal levels of the hydrolyzed extract， the fermented extract and their mixing ratio as well as the fermented hydrolysate that provided maximum A280 nm and A420 nm were 50%， 40%， 3：1 （V/V） and 40%， respectively， Among these， the fermented hydrolysate at 40% was the best， and the MRPs prepared with it exhibited A280 nm and A420 nm of 0.855 and 0.185， respectively indicating the production of low-molecular-mass aroma intermediates and melanoids at high levels; the sensory evaluation results showed that the MRPs had a bright brown-red color and a strong fatty aroma without irritating or fishy odor， and scored highest （9.0 points）.

Keywords： catfish heads/bones; enzymatic hydrolysis; fermentation; Maillard reaction

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210406-091

中圖分類號：TS254.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）06-0010-05

引文格式：

于德陽， 馬儷珍. 基于鯰魚頭/魚排制備美拉德反應物的研究[J]. 肉類研究， 2021， 35（6）： 10-14. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210406-091.? ? http：//www.rlyj.net.cn

YU Deyang， MA Lizhen. Preparation of maillard reaction products from catfish heads/bones[J]. Meat Research， 2021， 35（6）： 10-14. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210406-091.? ? http：//www.rlyj.net.cn

美拉德反應也稱羰氨反應，是羰基化合物（如還原糖）和氨基化合物（如氨基酸、肽和蛋白質等）在加熱時發(fā)生一系列氧化、環(huán)化、脫水、聚合等反應，能產生多種美拉德反應產物（Maillard reaction products，MRPs），是廣泛存在于食品加工中的非酶促褐變反應。美拉德反應過程復雜，底物、pH值、反應溫度和時間等因素都會影響反應結果，對食品的顏色和風味具有重要影響[1-2]。目前，國內更多的是以肉蛋白、植物蛋白、氨基酸和還原糖為基料研究美拉德反應。研究方向主要為美拉德反應產生的香味揮發(fā)性物質，MRPs中還原酮、呋喃、類黑精等揮發(fā)性物質的抗氧化活性以及MRPs的生物學活性等[3-4，5-8]。張勝男等[9]以海參腸為基料，優(yōu)化還原糖和氨基酸的種類和用量以及反應溫度、時間及pH值等美拉德反應條件，得到的MRPs顯著提高了海參腸的利用價值。徐浩等[10]采用河蜆軟體酶解制得的河蜆酶解液進行美拉德反應，制備河蜆酶解物MRPs，顯著提高了河蜆酶解物的抗氧化能力。陳啟航等[11]以金槍魚蒸煮液為基料，經(jīng)過酶解、發(fā)酵后進行美拉德反應，最終得到金槍魚風味海鮮調味料。葉夢迪等[12]以花蟹酶解液為原料液制備蟹味香精MRPs，結果表明，美拉德反應可顯著增加酮類、醛類、呋喃類、吡嗪類、醚類等化合物的種類與含量。朱文慧等[13]以鱈魚骨泥為氨基化合物來源，與葡萄糖發(fā)生美拉德反應，結果表明，影響美拉德反應的主次因素為葡萄糖添加量>反應溫度>反應時間>起始pH值。

革胡子鯰魚（Clarias gariepinus），又稱胡子鯰、塘虱魚、肥魚、胡子鮑、勃魚、生仔。鯰魚副產物包括魚頭、魚皮、魚骨和碎魚肉，這些副產物中含有豐富的蛋白質和鈣[14]，粗脂肪含量達16.6%，而脂肪及脂類物質的熱降解，對肉類風味物質的形成具有重要作用[15]。魚頭和魚頭酶解物中均含有豐富的氨基酸[16]，為美拉德反應提供了原料基礎。在美拉德反應最后階段生成的褐色含氮聚合物類黑精在420 nm波長處有吸收，可檢測420 nm處吸光度間接反映類黑精的生成量[17]。因此，為獲得特定香味的MRPs，本實驗以鯰魚頭/魚排為基料，經(jīng)高壓浸提后，分別進行酶解和發(fā)酵得到酶解液（enzymatic hydrolysate，EH）、發(fā)酵液（fermentation broth，F(xiàn)B），

并在酶解液基礎上再發(fā)酵得到基于酶解液的發(fā)酵液（fermentation broth based on enzymatic hydrolysis，F(xiàn)BEH），分別以不同添加量的EH、FB、EH∶FB、FBEH為美拉德反應底物，研究其對MRPs中間產物和褐變程度的影響，進而為鯰魚頭/魚排等副產物的綜合利用尋求有效的利用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

革胡子鯰魚，體質量1 000～1 500 g，體長30～35 cm，天津市徳仁農業(yè)發(fā)展有限公司提供，在30 min內從工廠養(yǎng)魚池運送到天津農學院食品加工車間。

復合蛋白酶（4×105 U/g）、風味蛋白酶（3.6×105 U/g）

南寧東恒華道生物科技有限公司;SHI-59發(fā)酵劑（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌）

意大利薩科公司;無水葡萄糖 秦皇島驪驊淀粉有限公司;D-木糖、VB1、牛磺酸、半胱氨酸、半胱氨酸鹽酸鹽 河北華恒化工有限公司;氫氧化鈉 天津鵬坤化工有限公司;蘋果酸 濰坊英軒實業(yè)有限公司;所用試劑純度均為分析純。

1.2 儀器與設備

高壓滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司;

WND-100型高速組織搗碎機 蘭溪市偉能達電器有限公司;

ATY124精密分析天平 日本島津公司;THZ-98AB型恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司;ZWY-240全溫型多振幅軌道搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;調溫電熱器 南通利豪實驗儀器有限公司;SX-GO7102型節(jié)能箱式電爐 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司;SDX-1全自動風冷速凍箱 天津市特斯達食品機械科技有限公司;FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京譜析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鯰魚頭、魚排高壓浸提及美拉德反應底物制備

1.3.1.1 魚骨肉泥的制備

將鯰魚宰殺后，去除鰓、內臟，剔除魚骨兩側魚肉，得到鯰魚頭和魚排。將鯰魚魚頭和魚排清洗干凈，用絞肉機（5 mm篩板）絞碎后得到魚骨肉泥，裝入自封袋包裝，每袋500 g，放入速凍箱（-30 ℃）快速冷凍1 h，然后在-18 ℃冷凍貯存?zhèn)溆?。?jīng)測定，所得魚骨肉泥蛋白質含量13.64%、脂肪含量16.6%、水分含量38.93%。

1.3.1.2 浸提液的制備

參照楊婉琳[18]的方法并加以修改，取500 mL錐形瓶，按魚骨肉泥、蒸餾水料液比為1∶2（m/V）加入魚骨肉泥、蒸餾水，封口后放入高壓滅菌鍋中高壓浸提（120 ℃、2 h），浸提液冷卻至常溫，備用，共15 份。

1.3.1.3 EH、FB、EHFB的制備

SHI-59發(fā)酵劑菌粉用無菌生理鹽水配制成質量濃度10 g/100 mL發(fā)酵菌液。取1.3.1.2節(jié)浸提液5 份，按錐形瓶內容物質量的0.02%無菌操作接種SHI-59發(fā)酵劑，在35 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)24 h，發(fā)酵結束后用雙層細紗布過濾，得到FB，備用。

取1.3.1.2節(jié)浸提液10 份，用氫氧化鈉調整pH值至7.5，按照1 200 U/g（以魚骨肉泥質量計，下同）添加復合蛋白酶，55 ℃酶解2 h（攪拌槳轉速180 r/min），然后再加入720 U/g風味蛋白酶，55 ℃繼續(xù)酶解1 h，最后升溫至95 ℃滅酶10 min，冷卻至常溫，5 份用雙層細紗布過濾，得到EH，備用;其余5 份不經(jīng)過濾，按錐形瓶內容物質量的0.02%無菌操作接種SHI-59發(fā)酵劑，在35 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)53 h，發(fā)酵結束后用雙層細紗布過濾，得到FBEH，備用。

美拉德反應底物的制備過程如圖1所示。

1.3.2 單因素試驗設計

為考察美拉德反應底物的影響，固定美拉德反應的溫度（100 ℃）、時間（2.5 h）和pH值（美拉德反應體系初始pH值用質量分數(shù)10%蘋果酸水溶液調節(jié)至5.5，反應1 h后用2 mol/L NaOH調節(jié)pH值至7.0，繼續(xù)反應1.5 h）、添加物（按反應體系質量計，添加酵母提取物2.5%、甘氨酸0.3%、木糖1%、葡萄糖2%、半胱氨酸鹽酸鹽0.5%、半胱氨酸0.25%、丙氨酸0.2%、?；撬?.2%、VB1 0.3%），僅改變美拉德反應底物種類、底物比例及添加量，即FB、EH、EHFB添加量分別為20%、30%、40%、50%、60%（每組均用蒸餾水補足至100%），以及EH、FB體積比分別為5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1（不添加蒸餾水）。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 低分子質量香味產物含量測定

用去離子水將MRPs按體積稀釋400 倍，用紫外-可見分光光度計在280 nm波長處測定溶液吸光度（A280 nm），MRPs中低分子質量香味物質含量用A280 nm反映，A280 nm越大，表示低分子質量香味產物生成量越大[19-20]。

1.3.3.2 類黑精含量的測定

褐色的類黑精是美拉德反應的重要產物，為褐變程度提供了一個可視化的測量手段，根據(jù)Yu等[21]的方法稍作修改，用去離子水將MRPs按體積稀釋400 倍，用紫外-可見分光光度計在420 nm波長處測定溶液吸光度（A420 nm），MRPs中類黑精含量用A420 nm反映，A420 nm越大，代表類黑精含量越高。

1.3.4 感官評價

為綜合考察MRPs的氣味和滋味，對其進行感官評價。采用康樂等[22]的方法并加以修改，由經(jīng)訓練有風味評定經(jīng)驗的6 位感官評定員（男性、女性各3 位），根據(jù)評價標準（表1）對樣品進行評定，采用10 分制。將去離子水（30 ℃）按體積比1∶100稀釋樣品，取2 mL稀釋樣品溶液于口中，使其充滿口腔，咀嚼10 次，進行滋味（鮮味、醇厚感及苦味）、氣味（肉香、刺鼻味、腥味）評分;去離子水（30 ℃）按體積比1∶10稀釋樣品，觀察稀釋樣品溶液進行顏色評分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗均重復3 次，結果取平均值。采用Excel 2016軟件進行圖表制作;采用IBM SPSS Statistics 19軟件采用方差分析進行差異顯著性分析，顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 FB添加量對MRPs的影響

小寫字母不同，表示相同指標不同組間差異顯著（P<0.05）。圖3～5同。

由圖2可知，不同F(xiàn)B添加量下MRPs A280 nm均遠高于A420 nm，表明美拉德反應以形成低分子質量香味中間體為主，褐色的類黑精含量相對較低。隨著FB添加量的增加，A280 nm和A420 nm均呈先緩慢上升后略降低的趨勢，F(xiàn)B添加量50%時，A280 nm和A420 nm均達到最大值，F(xiàn)B添加量繼續(xù)增加至60%時，A280 nm和A420 nm開始降低，但差異不顯著。這可能由于這些小分子物質隨反應程度的加深不斷環(huán)化并加成形成大分子物質，使得香味動態(tài)平衡減弱，這與童彥等[23]的研究結果基本一致。因此，選擇FB添加量50%為宜。

2.2 EH添加量對MRPs的影響

由圖3可知，隨著EH添加量的增加，A280 nm和A420 nm均呈先升高后降低的趨勢。當EH添加量為40%時，A280 nm和A420 nm均達到最大值，但EH添加量為30%～50%時A420 nm差異不顯著。這可能是由于隨著美拉德反應的進行，體系中的葡萄糖和木糖等還原糖逐漸被耗盡，因此低分子質量香味中間體和類黑精產生量逐漸下降[24]。因此，綜合考慮，選擇EH添加量以40%為宜。

2.3 EH和FB體積比對MRPs的影響

由圖4可知，EH和FB體積比為5∶1～3∶1時，A280 nm和A420 nm呈顯著上升趨勢（P<0.05）;當EH和FB體積比為2∶1～1∶1時，A420 nm顯著降低（P<0.05），A280 nm呈降低趨勢，但差異不顯著。這是因為同時添加EH和FB，隨著FB比例的增加，反應體系pH值降低，而較低的pH值會影響美拉德反應速率，使低分子質量香味中間體生成量相對降低[25];同時隨著FB比例的增加體系中含硫化合物增多，硫離子通過結合糖基胺的裂解產物從而阻斷發(fā)色基團的生成，抑制高級MRPs類黑精的形成[26]。因此，EH、FB體積比以3∶1為宜。

2.4 EHFB添加量對MRPs的影響

由圖5可知，EHFB添加量為20%～50%時，A280 nm和A420 nm均呈先緩慢增加后降低的趨勢（P<0.05）。當EHFB添加量為40%時，A280 nm和A420 nm均達到最大值，表明此時反應體系中低分子質量香味中間體和類黑精生成量最高。但EHFB添加量繼續(xù)增加50%時，A280 nm和A420 nm顯著降低（P<0.05），EHFB添加量60%時雖有所上升，但仍低于40%時。這是由于隨著EHFB添加量的增加，反應體系pH值降低，在酸性條件下氨基質子化阻止了葡基胺的形成，進而阻礙了美拉德反應進程，導致美拉德反應速率降低[27]。因此，綜合分析，選擇EHFB添加量以40%為宜。

2.5 最佳添加量下不同底物對MRPs感官品質的影響

分別以50% FB、40% EH、EH∶FB體積比3∶1、40% EHFB為底物制備MRPs，對4 組MRPs進行感官評價，同時測定4 組MRPs溶液A280 nm和A420 nm進行驗證。

由表2可知，40% EHFB組感官得分最高，其次是EH∶FB（3∶1，V/V）、50% FB組和40% EH組;EH∶FB（3∶1，V/V）、50% FB組和40% EH組顏色略淺，且光澤度較暗，肉香味相對較淡，略有刺鼻味和腥味，而40% EHFB組呈棕紅色，光澤度相對較好，肉香味濃郁，無刺激味和腥味;這與A280 nm和A420 nm驗證結果一致。50% FB組反應體系pH值略低，使美拉德反應速率變慢;而40% EH組反應體系中游離氨基酸含量過低，可提供的氨基數(shù)量較少從而影響了美拉德反應褐變程度[28]。EHFB經(jīng)酶解后再加入微生物發(fā)酵劑（SHI-59），微生物作用使蛋白質分解為氨基酸等呈味物質[29]，有利于風味的形成及美拉德反應的進行。綜合考慮，40% EHFB作為反應底物所制備的MRPs最優(yōu)。

3 結 論

固定反應體系的溫度（100 ℃）、時間（2.5 h）、pH值（5.5～7.0）和添加物（酵母提取物2.5%、甘氨酸0.3%、木糖1%、葡萄糖2%、半胱氨酸鹽酸鹽0.5%、半胱氨酸0.25%、丙氨酸0.2%、?；撬?.2%、VB1 0.3%），在此基礎上，分別添加50% EH、40% FB、EH∶FB=3∶1（V/V）、40% EHFB進行美拉德反應，所得MRPs A280 nm和A420 nm均達到最大值，其中以40% EHFB最優(yōu)，此條件下所得MRPs A280 nm為0.855、A420 nm為0.185;感官評定結果表明，40% EHFB為底物時，MRPs呈紅棕色有光澤，具有飽滿濃郁的肉香氣，無苦味、腥味、硫化物味等不良氣味。

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