陳思韻，馮鐘文，龐麗君，黃瑀莘，韋定一，孔令軍，何 赟，韋錦斌

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室,廣西 南寧 530021)

酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)作為酒精性肝病中的一種，是以黃疸和進(jìn)行性炎癥性肝損傷為特征的臨床綜合征[1]，短期死亡率高[2]。在我國酒精性肝病已成為繼病毒性肝炎后的第二大肝病，而AH是肝病發(fā)展的重要演變過程，如果不進(jìn)行干預(yù)，后續(xù)可能演變成肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌[3]。目前臨床上對AH仍沒有理想有效的治療藥物[4]，由于其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，大大限制了新藥的研發(fā)。因此，進(jìn)一步研究和尋找有效的藥物進(jìn)行治療，延緩甚至阻斷肝硬化和肝癌等肝臟疾病的發(fā)展與預(yù)后，具有十分重要的意義。

我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)[5]，積雪草酸(asiatic acid，AA)可以通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的程度而顯著改善高脂飼料誘導(dǎo)的脂肪肝疾病。然而，AA對AH的保護(hù)作用目前尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種探索中醫(yī)藥干預(yù)疾病機(jī)制的方法，從生物分子網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)與功能來認(rèn)知中藥藥性[6]，將網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)的思想和方法應(yīng)用于中藥藥理學(xué)研究[7]。在一定程度上為探究AA是否作用于酒精性肝炎以及作用機(jī)制的研究，提供了一種新的思路。因此，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理的預(yù)測和體內(nèi)大鼠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法來探究AA對AH疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)及潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料SPF級，體質(zhì)量(180±20) g，雄性SD大鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可證：SCXK桂2014-0002)。本研究所有的動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。積雪草酸(純度>98%，廣西卓一生物技術(shù)有限公司)。水飛薊賓膠囊(天津天士力圣特制藥有限公司)；TNF-α試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；ADH、ALDH、GSH試劑盒(南京建成生物研究所)。

1.2 積雪草酸靶點(diǎn)預(yù)測用PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索積雪草酸的SMILES結(jié)構(gòu)，分別輸入到STITCH(http://stitch.embl.de/)和SEA數(shù)據(jù)庫(http://sea.bkslab.org)的搜索欄中，檢索得到化合物積雪草酸的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。依托PharmMapper數(shù)據(jù)庫(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/)搜索關(guān)鍵詞“Asiatic acid”得到積雪草酸的預(yù)測靶點(diǎn)，3個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的化合物預(yù)測靶點(diǎn)取并集為積雪草酸最終預(yù)測靶點(diǎn)。

1.3 酒精性肝炎靶點(diǎn)預(yù)測分別在OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)和GeneCards(人類基因信息數(shù)據(jù)庫http://www.genecards.org/)搜索關(guān)鍵詞“Alcoholic hepatitis”，下載疾病預(yù)測靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，篩選出相關(guān)度高的靶點(diǎn)。

1.4 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)將疾病和化合物靶點(diǎn)進(jìn)行比對，運(yùn)用基迪奧生物網(wǎng)站(https://www.omicshare.com/)制作Venn圖，篩選出共同靶點(diǎn)。將共同靶點(diǎn)輸入到String數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)中，限定物種為homo sapiens(智人)，獲得靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5 富集分析共同靶點(diǎn)將上述共有靶點(diǎn)輸入到Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)進(jìn)行GO功能富集分析，再利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析，制作DAVID富集分析圖，觀察通路與靶點(diǎn)相互作用的關(guān)系，查詢富集分析后的相關(guān)通路。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組與造模60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為6組，分別為正常組(A組)、積雪草酸陰性對照組(B組)、模型組(C組)、水飛薊賓組(D組)、積雪草酸低劑量(E組)和積雪草酸高劑量組(F組)，每組各10只。C、D、E和F組每日灌胃給予階梯式改良[8]食用酒精灌胃法建立AH模型，即1-3周給予30%乙醇5.0 g·kg-1·d-1，4-6周35%乙醇6.0 g·kg-1·d-1，7-8周40%乙醇7.0 g·kg-1·d-1，9-10周40%乙醇8.0 g·kg-1·d-1，11-12周40%乙醇,9.0 g·kg-1·d-1，13-24周40%乙醇,10.0 g·kg-1·d-1。從13周至24周，B和F組灌胃積雪草酸8 mg·kg-1，E組灌胃積雪草酸4 mg·kg-1，D組灌胃水飛薊賓26.25 mg·kg-1，每日1次。治療結(jié)束后，所有大鼠麻醉處死，收集的血樣和肝臟組織均存于-80 ℃冰箱。

1.7 血清檢測AST和ALT活性大鼠腹主動(dòng)脈取血于醫(yī)用10 mL采血管內(nèi)，離心后取上清液，采用全自動(dòng)血生化儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)血清水平，嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。

1.8 肝臟檢測ADH和ALDH活性[9]收集到的肝臟用生理鹽水進(jìn)行清洗，以肝臟(mg) ∶生理鹽水(mL)按照1 ∶9的比例在玻璃勻漿器研磨肝臟組織直至無明顯組織碎屑的混懸液,離心取上清，制得的肝勻漿按照試劑盒說明書檢測乙醇脫氫酶(ADH)和乙醛脫氫酶(ALDH)活性。

1.9 肝臟檢測TNF-α和GSH活性將上述方法制得的肝勻漿按照腫瘤壞死因子α (TNF-α)和谷胱甘肽(GSH)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.10 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測肝組織中NF-κB信號通路蛋白的表達(dá)將大鼠肝臟從-80 ℃冰箱中取出，每組約取100 mg肝組織置于研缽中用液氮研磨至粉末，按照說明書加入蛋白裂解液(RIPA高效裂解液 ∶PMSF ∶蛋白酶抑制劑 ∶磷酸酶抑制劑=100 ∶1 ∶1 ∶1)制備勻漿離心后取上清液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取適量的蛋白質(zhì)樣品在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離，并使用濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)移后，膜用TBST沖洗3次。后經(jīng)p-IKKα/β、IKKα/β、p-IκBα、IκBα、NF-κB p65和p-NF -кB p65 (1 ∶1 000 Proteintech)一抗在4 ℃下過夜。全蛋白以GAPDH作為內(nèi)對照。次日，用熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶10 000 Licor)室溫避光孵育1 h，再TBST沖洗3次，后置于Odyssey紅外成像系統(tǒng)(LI-COR Bioscience, Lincoln, NE)中掃描，用ImageJ分析軟件進(jìn)行密度掃描定量。

1.11 病理學(xué)檢查每只SD大鼠于肝左葉同一部位取大小約100 mg的肝組織，10%福爾馬林固定，石蠟包埋。每張切片厚度為5 μm，進(jìn)行蘇木精-伊紅( HE)染色，在顯微鏡下觀察肝組織的病理變化。

2 結(jié)果

2.1 積雪草酸與酒精性肝炎靶點(diǎn)分別在PharmMapper數(shù)據(jù)庫搜索得到199個(gè)，SEA數(shù)據(jù)庫搜索得到21個(gè)和STITCH數(shù)據(jù)庫得到10個(gè)積雪草酸靶點(diǎn)，取并集后得到225個(gè)不同的積雪草酸預(yù)測靶點(diǎn)。Gencards數(shù)據(jù)庫中篩選評分在20以上的靶點(diǎn)，檢索到215個(gè)酒精性肝炎的潛在靶點(diǎn)，OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到525個(gè)基因靶點(diǎn)，并集后得到696個(gè)酒精性肝炎預(yù)測靶點(diǎn)。

2.2 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果比對積雪草酸與酒精性肝炎預(yù)測靶點(diǎn)，篩選出共同靶點(diǎn)24個(gè)(Tab 1)。在基迪奧生物網(wǎng)站繪制Venn圖(Fig 1)。建立共同靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 2)。該網(wǎng)絡(luò)線條越粗表示靶點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)度越大，圖中各靶點(diǎn)間關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，其中以CASP3、GRB2、ESR1、MET、STAT1、JAK2、EGFR的關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)。提示這些靶點(diǎn)可能是積雪草酸對酒精肝炎發(fā)揮療效的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

Tab 1 The overlapping targets of asiatic acid and alcoholic hepatitis

Fig 1 Venn diagram of asiatic acid and alcoholic hepatitis

Fig 2 Target interaction network diagram

2.3 富集分析結(jié)果Metascape和DAVID數(shù)據(jù)庫富集分析共同靶點(diǎn)，共得到12個(gè)GO功能條目(Fig 3)，20條KEGG信號通路(Fig 4)。可以發(fā)現(xiàn)GO功能中腺體發(fā)育和肌肉細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控表達(dá)突出。hsa05200:Pathways in cancer 通路均排在Metascape和DAVID富集分析結(jié)果的第一位，且富集基因：STAT1、CDH1、CASP3、RARB、GRB2、PPARG、MET、MMP9、EGFR，均為關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的靶點(diǎn)基因，可以推測該通路對AH有一定的作用。Pathways in cancer通路的子通路眾多，NF-κB信號通路是Pathways in cancer通路的中心通路，可與多條子通路相連，且NF-κB信號通路是經(jīng)典的炎癥通路[10]，其表達(dá)的升高往往能反映出肝細(xì)胞的炎癥和損傷程度。

Fig 3 Metascape enrichment analysis diagram

Fig 4 David enrichment analysis diagram

2.4 AA對AST和ALT活性影響AST和ALT是肝細(xì)胞內(nèi)重要的功能酶，也是肝損傷程度最敏感的指標(biāo)[11]。與正常組比較，模型組中大鼠血清AST及ALT活性顯著升高，水飛薊賓和AA治療后AST及ALT活性明顯降低，而AA對正常大鼠的AST及ALT活性幾乎沒有影響。研究表明，積雪草酸可以降低大鼠的肝損傷程度(Tab 2)。

Tab 2 Comparison of serum liver function indexes of

2.5 AA對ADH和ALDH活性影響ADH和ALDH是重要的酒精代謝酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組大鼠比較，模型組中大鼠ADH和ALDH活性明顯降低，AA低劑量和高劑量組治療后ADH和ALDH活性明顯回升，而AA對正常大鼠 ADH和ALDH活性幾乎沒有影響。研究結(jié)果表明，積雪草酸可以提高酒精代謝酶的活力(Tab 3)。

Tab 3 Comparison of liver alcohol metabolism indexes of

2.6 AA對TNF-α和GSH活性影響與正常組大鼠比較，模型組中大鼠的TNF-α和GSH活性升高，水飛薊賓治療后的TNF-α和GSH活性降低至正常水平。AA 治療組以劑量依賴性的方式使TNF-α和GSH活性降低。AA對照組中TNF-α和GSH水平與正常組間無差異。結(jié)果表明，AA能減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平(Tab 4)。

Tab 4 Comparison of inflammatory factors and antioxidant stress indexes of

2.7 AA 對 NF-κB信號通路蛋白表達(dá)的影響NF-κB通路中各組蛋白相對表達(dá)量如Fig 5所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AH極大提高p-IKKα/β、p-IκBα和p-NF-кB p65的表達(dá)，模型組p-IKKα/β、p-IκBα和p-NF-кB p65的蛋白表達(dá)量明顯升高，水飛薊賓組和AA治療組治療后這種情況得到了抑制，并且AA治療組呈劑量依賴性的降低了NF-кB通路中各蛋白表達(dá)，而AA對照組則與正常組蛋白的表達(dá)幾乎無差異。結(jié)果表明，AA能抑制NF-κB信號通路中IKKα/β、IκBα和NF-кB p65蛋白的表達(dá)。

Fig 5 Effect of asiatic acid on protein expression of NF-κB pathway

2.8 肝組織病理組織學(xué)檢查H&E染色結(jié)果顯示，正常組和AA對照組中大鼠的肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、排列緊密，呈放射狀有序排列，而模型組大鼠肝組織出現(xiàn)了細(xì)胞衰老退變和炎癥細(xì)胞浸潤甚至炎癥壞死等形態(tài)變化而水飛薊賓組和AA治療組中，炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞壞死等現(xiàn)象均明顯減輕(Fig 6)。

Fig 6 HE staining results of rats(×200)

3 討論

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的方法，預(yù)測積雪草酸與酒精性肝炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其潛在的作用機(jī)制。篩選得到共同靶點(diǎn)24個(gè)，富集分析得到12個(gè)GO功能條目和21條KEGG信號通路，KEGG通路基因主要富集在Pathways in cancer通路上，且富集基因均為關(guān)聯(lián)性強(qiáng)的基因。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，積雪草酸對酒精性肝炎具有一定的作用效果，并且積雪草酸可以通過多通路，多途徑作用于酒精性肝炎疾病，而NF-κB信號通路是其中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)途徑。

大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組的AST和ALT的數(shù)值異常偏高，說明肝損傷嚴(yán)重，GSH指標(biāo)檢測結(jié)果顯示模型組大鼠的氧化應(yīng)激水平異常。結(jié)合TNF-α指標(biāo)檢測和病理結(jié)果顯示，模型組的促炎因子釋放增加，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，說明以食用酒精灌胃誘導(dǎo)的酒精性肝炎模型成功。模型組的ADH和ALDH值明顯低于正常組，說明長期過量的飲酒可導(dǎo)致酒精代謝功能減退。水飛薊賓被稱為“天然的保肝藥”，可防止多種原因引起的肝損傷[12]。研究結(jié)果顯示，水飛薊賓治療組和AA高劑量治療組的療效幾乎等同。而水飛薊賓和AA治療后均能顯著降低AST、ALT、TNF-α和GSH水平，升高ADH和ALDH值，說明兩者都能有效地減輕肝組織的病理損傷，抑制促炎因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)，并減少氧化應(yīng)激功能，同時(shí)還能增強(qiáng)酒精代謝酶的活性。為了進(jìn)一步探究AH的炎癥反應(yīng)，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的結(jié)果，我們測定了NF-κB信號通路中的關(guān)鍵蛋白——IKKα/β、IκBα和NF-κB p65[13]。NF-κB是廣泛分布于細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)肝損傷過程中激活的主要炎癥通路，參與腫瘤的發(fā)展。IKKα/β的激活可促使IκBα磷酸化及降解過程，IκBα降解后會(huì)激活NF-κB，使NF-κB與IκBα結(jié)合形成的聚合物分離[14]。NF-κB表達(dá)的升高可引起炎性細(xì)胞因子的分泌與釋放，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟炎癥、纖維化、肝細(xì)胞壞死及凋亡等作用[15]。AA治療組以劑量依賴性的使p-IKKα/β、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)下調(diào)，說明AA治療組和水飛薊賓組可以抑制NF-κB通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，積雪草酸可能通過抑制NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，以此來抑制炎癥因子的表達(dá)，從而起到抗炎作用。

綜上所述，積雪草酸對酒精性肝炎疾病具有一定的治療作用，可以通過抑制NF-κB信號通路而改善肝損傷和炎癥反應(yīng)。