王 瓊，劉茂竹，陳夢(mèng)園，劉 霞，魯 懿，楊俊卿

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，重慶 400016)

中風(fēng)具有較高的發(fā)病率和死亡率，可分為出血性中風(fēng)和缺血性中風(fēng)，其中缺血性中風(fēng)約占中風(fēng)總發(fā)生率的87%[1]。缺血性中風(fēng)主要是由于腦組織局部血液供應(yīng)減少或中斷而引起的腦血管意外[2]，其臨床上治療策略主要是再通/復(fù)氧。但是，這又必然會(huì)導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)[3]。目前，由于CIRI的病理生理機(jī)制并不完全清楚，因此缺乏有效治療策略和有效的干預(yù)藥物。因此，深入研究CIRI的病理生理機(jī)制，尋找有效降低CIRI的藥物具有重要的醫(yī)學(xué)意義和社會(huì)價(jià)值。

研究表明，炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)理中起關(guān)鍵作用[4]。因此，抑制由腦缺血性中風(fēng)引起的炎癥反應(yīng)可能成為中風(fēng)治療的一種新策略。羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A, HSYA)是紅花黃色素中含量最高、藥理功效最強(qiáng)的水溶性成分，有研究發(fā)現(xiàn)HSYA具有保護(hù)心血管系統(tǒng)[5]、抗氧化[6]、抗腦缺血再灌注損傷[7]等作用，但是其機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)及其相關(guān)的環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)及其下游通路前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)參與了CIRI的機(jī)制[8]，但是HSYA對(duì)CIRI作用機(jī)制是否涉及COX-2/PGD2/DPs途徑，尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)大腦中動(dòng)脈栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R)小鼠模型，進(jìn)一步驗(yàn)證HSYA對(duì)缺血再灌注腦損傷小鼠的保護(hù)作用。同時(shí)觀察小鼠皮層COX2、DP1、DP2mRNA和蛋白的表達(dá)改變，以及炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β、PGD2含量的變化，以期從炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)通路之一的COX-2/PGD2/DPs途徑，初步探討HSYA對(duì)缺血再灌注腦損傷小鼠的保護(hù)作用機(jī)制，為HSYA廣泛用于臨床治療急性缺血性腦卒中提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器C57BL/6J小鼠，60只，雄性，體質(zhì)量(18-22)g，SPF級(jí)，購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SYXK(渝)2018-0003。HSYA(批號(hào)：CAS#78281-02-4)購(gòu)于寶雞市辰光生物科技有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride solution，TTC)(批號(hào)：17779)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；蛋白印跡相關(guān)試劑購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；COX-2抗體(批號(hào)：GR3267180-1)和DP1抗體(批號(hào)：GR79858-8)購(gòu)于英國(guó)abcam公司，DP2抗體(批號(hào)：73b0750)購(gòu)于艾菲公司；COX-2、DP1、DP2引物由上海生物生工公司合成；低溫離心機(jī)(美國(guó)賽默飛公司)；濕式轉(zhuǎn)膜儀和垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)、qPCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；正置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1I/R模型建立 采用線栓法建立小鼠MCAO/R模型[9]。腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉小鼠，將其仰臥固定，在頸部切口，在顯微鏡下分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)，結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈用動(dòng)脈夾夾緊。在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端插入頂端硅膠包被的線栓，線栓經(jīng)頸總動(dòng)脈進(jìn)入大腦前動(dòng)脈(anterior cerebral artery，ACA)的起始部，直到線栓黑色標(biāo)處到達(dá)頸內(nèi)與頸外的分叉處。插栓1 h后，緩慢拔出線栓，再灌注24 h。假手術(shù)組除不插栓外，其余處理與模型組相同。造模過(guò)程中小鼠體溫維持在37 ℃左右。

1.2.2分組與給藥 小鼠隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組(Sham組)、模型組(Model組)、HSYA處理組(HSYA 20 mg·kg-1組)，每組20只小鼠。HSYA溶于生理鹽水中備用。小鼠在每次給藥前稱體質(zhì)量，尾靜脈注射HSYA (20 mg·kg-1)0.2 mL，每天1次，d5給藥后立即造模。MCAO/R造模后存活率約為60%(假手術(shù)組除外)，假手術(shù)組造模后為20只，模型組造模后剩余12只，HSYA處理組造模后剩余13只。死亡小鼠尸檢發(fā)現(xiàn)可能是由于線栓戳到蛛網(wǎng)膜下腔導(dǎo)致腦出血致死。HSYA臨床建議成人有效劑量約為2 mg·kg-1，一般情況下每天1次[10]。且已有研究發(fā)現(xiàn)頸總動(dòng)脈注射16 mg·kg-1HSYA可顯著改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷[11]。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合病人臨床給藥劑量以及已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的有效劑量，換算到小鼠劑量約為20 mg·kg-1，并且我們預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給藥5 d對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷有明顯預(yù)防性保護(hù)效果，因此在正式實(shí)驗(yàn)中采用劑量為小鼠靜脈注射HSYA 20 mg·kg-1。

1.2.3神經(jīng)功能評(píng)分 本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的Longa 5分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)定[12]。小鼠正常運(yùn)動(dòng)，0分；小鼠的左前肢不能完全伸展，1分；小鼠行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，2分；小鼠行走時(shí)向?qū)?cè)傾斜，3分；小鼠不能自發(fā)行走并且意識(shí)喪失，記為4分；死亡小鼠不納入統(tǒng)計(jì)范圍。假手術(shù)組、模型組、HSYA處理組每組取12只小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。神經(jīng)功能評(píng)分后各組小鼠再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4腦梗死體積測(cè)定 再灌注24 h后，小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉后處死，斷頭取腦，-20 ℃冰箱中速凍全腦30 min，待全腦凍硬后置于冰盒上連續(xù)均勻切片5片。將腦切片置于1% TTC染液中，放入37 ℃恒溫水浴鍋中避光孵育，正反面各15 min。觀察腦組織變化，正常組織為紅色，缺血組織為白色。拍照后用ImageJ圖像分析軟件計(jì)算每片腦片梗死體積和腦片體積。假手術(shù)組、模型組、HSYA處理組每組各4只小鼠。

1.2.5皮層組織病理學(xué)觀察 再灌注24 h后，小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，打開(kāi)小鼠胸腔，剪碎右心耳作為灌流液出口，灌注針從左心尖插入，先緩慢推注20 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)進(jìn)行沖洗，再推注10 mL多聚甲醛進(jìn)行內(nèi)固定。推注完成后，斷頭取腦后4%多聚甲醛溶液固定3 d，然后石蠟包埋并切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。顯微鏡下觀察小鼠皮層神經(jīng)元組織病理學(xué)變化。假手術(shù)組、模型組、HSYA處理組每組各3只小鼠。

1.2.6Western blot法檢測(cè)皮層蛋白的表達(dá) 收集假手術(shù)組、模型組、HSYA處理組小鼠右腦皮層組織(梗死區(qū)和半暗帶混合)，每組剩余5只，隨機(jī)取4只小鼠進(jìn)行后續(xù)Western blot、qRT-PCR、ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。加入蛋白裂解液(RIPA-PMSF 100 ∶1)到裝有小鼠組織的勻漿器中，均勻研磨，裂解組織蛋白，等量蛋白用濕法經(jīng)12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離后轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF膜上，5%胎牛血清蛋白室溫封閉2.5 h后，加入一抗COX-2(稀釋比例1 ∶1 000)、DP1(稀釋比例1 ∶1 000)、DP2(稀釋比例1 ∶500)、Tublin(稀釋比例1 ∶5 000)。4 ℃孵育過(guò)夜。次日再加二抗(1 ∶5 000)孵育1 h，最后顯影成像，Image Lab軟件對(duì)結(jié)果圖片進(jìn)行灰度分析。

1.2.7定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá) 用TRIzol試劑盒提取小鼠右腦皮層總RNA，采用SYBR預(yù)混料，在10 μL體系內(nèi)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)條件：在95 ℃下循環(huán)30 s，然后在95 ℃下循環(huán)50 s，60 ℃下循環(huán)30 s。引物由上海生物生工公司合成。引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 List of primers used in qPCR analysis

1.2.8ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子 用ELISA試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技公司)檢測(cè)小鼠右腦組織皮層中的PGD2、IL-1β、TNF-α水平。該試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。往預(yù)先包被捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值，計(jì)算樣品濃度。

Fig 1 Effects of HSYA on neurological function score and cerebral infarction volume in MCAO/R-treated mice

2 結(jié)果

2.1 HSYA對(duì)缺血再灌注小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦梗死體積的影響TTC染色和神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組梗死體積和術(shù)后神經(jīng)功能評(píng)分明顯增加。與模型組相比，HSYA預(yù)處理可以明顯減少M(fèi)CAO/R小鼠損傷側(cè)腦梗死體積且明顯降低了小鼠術(shù)后神經(jīng)功能評(píng)分。

2.2 HSYA對(duì)缺血再灌注腦損傷小鼠皮層組織病理形態(tài)學(xué)的影響HE染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組細(xì)胞排序紊亂且核固縮明顯，核深染且空泡較多，死亡細(xì)胞數(shù)約占細(xì)胞總數(shù)90%。與模型組相比，HSYA組的細(xì)胞核仁較為清晰，排列整齊，少量細(xì)胞死亡，死亡細(xì)胞數(shù)約占細(xì)胞總數(shù)30%。

2.3 HSYA對(duì)缺血再灌注腦損傷小鼠皮層COX-2、DP1、DP2蛋白和mRNA表達(dá)影響從qRT-PCR和Western blot結(jié)果可知，與假手術(shù)組相比，模型組COX-2、DP1、DP2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加。與模型組相比，HSYA 20 mg·kg-1組COX-2、DP1、DP2的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低。

Fig 2 Effects of HSYA on cortical tissue cells of MCAO/R-treated mice (n=3)

2.4 HSYA對(duì)缺血再灌注腦損傷小鼠皮層炎癥因子水平的影響從ELISA結(jié)果得知，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠皮層炎癥因子TNF-α、IL-1β、PGD2水平增加。與模型組相比，HSYA(20 mg·kg-1)預(yù)處理后，炎癥因子TNF-α、IL-1β、PGD2水平明顯下降。

3 討論

在腦缺血數(shù)小時(shí)后，促炎因子會(huì)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞激發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，一方面會(huì)造成缺血區(qū)域血腦屏障通透性改變和神經(jīng)元的死亡；另一方面會(huì)招募中性粒細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等遷移到缺血性病變區(qū)，導(dǎo)致創(chuàng)傷后過(guò)度炎癥反應(yīng)與繼發(fā)性腦損傷[13]。因此，抑制由腦缺血性中風(fēng)引起的炎癥反應(yīng)對(duì)于腦卒中治療至關(guān)重要。

Fig 3 Effect of HSYA on expression of COX-2, DP1, DP2 mRNA and protein in cortex of mice subjected to ischemia-reperfusion injury n=4)

Fig 4 Effects of HSYA on IL-1β, PGD2 and TNF-α in cortex of mice subjected to ischemia reperfusion injury n=4)

COX-2是一種誘導(dǎo)酶，在正常組織細(xì)胞中一般不表達(dá)或者低表達(dá)，但在細(xì)胞內(nèi)外多種刺激(如促炎因子、細(xì)胞因子、機(jī)械性刺激等)下高表達(dá)，并在炎癥等病理情況下起主導(dǎo)作用。COX-2參與免疫調(diào)節(jié)、血管功能和突觸信號(hào)的傳遞，是神經(jīng)炎癥的重要介質(zhì)之一[14]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)， HSYA有抗腦缺血再灌注損傷的作用[7]。但是HSYA對(duì)CIRI作用的病生機(jī)制是否涉及COX-2/PGD2/DPs途徑并不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，HSYA 20 mg·kg-1可顯著降低造模后小鼠皮層組織中COX-2蛋白和mRNA的表達(dá)，且COX-2的下游信號(hào)通路PGD2/DPs也有明顯改變。PGD2是COX-2的下游產(chǎn)物，是腦中富含最豐富的前列腺素。已有研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血/再灌注模型中PGD2的有害作用，主要是通過(guò)DP2受體發(fā)揮作用[15]。DP2是PGD2的特異性受體，類屬7次跨膜G蛋白受體，與Gi型G蛋白偶聯(lián)，抑制cAMP(cyclic adenosine monophosphate)產(chǎn)生而誘導(dǎo)cGMP(cyclic guanosine monophosphate)產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+上調(diào)，促進(jìn)炎癥因子IL-2、IL-4等釋放[16]。與模型組相比，HSYA預(yù)處理組中小鼠皮層組織PGD2和DP2表達(dá)明顯下調(diào)，這提示HSYA降低了COX-2、PGD2、DP2的表達(dá)從而保護(hù)小鼠腦缺血再灌注損傷。DP1類屬視紫紅質(zhì)型G蛋白受體，與Gs型G蛋白相偶聯(lián)，激動(dòng)后細(xì)胞內(nèi)cAMP含量增加并促進(jìn)Ca2+釋放，能夠增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能以及保護(hù)神經(jīng)元[16]。已有研究發(fā)現(xiàn)激活DP1受體可明顯改善小鼠腦缺血再灌注損傷[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，造模后小鼠皮層DP1表達(dá)升高，推測(cè)這是一種小鼠造模損傷后自身應(yīng)激反應(yīng)保護(hù)性的升高，但HSYA預(yù)處理后小鼠皮層DP1表達(dá)降低，可能是由于上游COX-2的表達(dá)減少，因此導(dǎo)致下游的產(chǎn)物減少。但總體來(lái)說(shuō)，HSYA降低了COX-2以及其下游通路PGD2/DPs的表達(dá)從而減緩了腦缺血再灌注小鼠的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，HSYA能夠降低小鼠腦梗死率，減輕腦細(xì)胞病理?yè)p傷，改善神經(jīng)功能，減輕炎癥反應(yīng)。更為重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)HSYA可降低腦缺血再灌注小鼠皮層組織中COX-2、DP1、DP2mRNA和蛋白的表達(dá)，這提示HSYA可能通過(guò)COX-2/PGD2/DPs途徑保護(hù)小鼠腦缺血再灌注損傷。