林松泉，莊若飛，鄒文政

（1.廈門惠盈動(dòng)物科技有限公司，福建 廈門 361023；2.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021）

禽流感、新城疫等疾病的發(fā)生，不同程度影響著我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的正常發(fā)展[1]。某養(yǎng)雞場(chǎng)雞群突發(fā)疾病，其主要癥狀為：嘴巴常張開，體溫升高，精神沉郁，食欲降低或停食，拉灰白色稀便，且傳染快、發(fā)病急、病程短、死亡率高。分別從頭、肺、肝、脾臟等4種器官通過分離純化病菌，得到兩株病原菌，經(jīng)鑒定分別為大腸桿菌（Escherichia coLi）與雞葡萄球菌（StaphyLococcus gaLLinarum）。

關(guān)于雞大腸桿菌與葡萄球菌感染防治的報(bào)道很多[2-9]，但涉及的葡萄球菌主要是金黃色葡萄球菌(Staphy Lococcus aureus)，而雞葡萄球菌（Staphy Lococcus gaLLinarum）的感染未見相關(guān)報(bào)道。如ELsaid[10]從多個(gè)農(nóng)場(chǎng)雞體內(nèi)分離出700多株致病菌，其中葡萄球菌占45.5%。此外，關(guān)于雞疾病的治療基本以抗生素藥物為主導(dǎo)，然而，對(duì)于經(jīng)常使用大量抗生素治療病菌引起的疾病，往往會(huì)產(chǎn)生多種負(fù)面影響，如導(dǎo)致病原菌耐藥性提高、免疫機(jī)能下降、藥物殘留與破壞生態(tài)環(huán)境等[11]。人們食用含抗生素的畜禽產(chǎn)品則會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害[12-13]，而隨著農(nóng)業(yè)部提倡限抗減抗的要求與益生菌產(chǎn)品的開發(fā)研究，多數(shù)益生菌產(chǎn)品可以有效抑制病原菌，起到防治病原菌的作用。因此，其越來越受到人們的廣泛關(guān)注。

本研究從市場(chǎng)獲得10個(gè)含抗生素產(chǎn)品，涉及硫氰酸紅霉素、酒石酸泰樂菌素、替米考星、阿莫西林、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素及延胡索酸泰妙菌素7種常用抗生素，分別對(duì)分離的兩株菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，能有效抑制這兩種菌的抗生素產(chǎn)品僅為鹽酸多西環(huán)素。通過使用實(shí)驗(yàn)室益生菌對(duì)這兩株病原菌進(jìn)行抑菌篩選試驗(yàn)，其中植物乳桿菌（LactobaciLLus pLantarum）、干酪乳桿菌（LactobaciLLus casei）、鼠李糖乳桿菌(LactobaciLLus rhamnosus)與酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）對(duì)這兩株菌均有抑制作用，這為雞病的防治提供了新的方向，也為益生菌產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

病樣由某雞養(yǎng)殖場(chǎng)提供，共5組平行樣，每組平行樣中分別包括頭、肺、肝及脾臟（見圖1）。

圖1 病雞組織器官

供試藥物。市場(chǎng)上得到的10個(gè)含抗生素產(chǎn)品，酒石酸泰樂菌素(A公司)（規(guī)格：5000萬(wàn)單位）、酒石酸泰樂菌素(B公司)（規(guī)格：2000萬(wàn)單位）、替米考星（規(guī)格：10%）、硫氰酸紅霉素可溶性粉(A公司)（規(guī)格：500萬(wàn)單位）、硫氰酸紅霉素可溶性粉(B公司)（規(guī)格：500萬(wàn)單位）、硫氰酸紅霉素（C公司）（規(guī)格500萬(wàn)單位）、延胡索酸泰妙菌素（規(guī)格：45%）、阿莫西林（規(guī)格：10%）、氟苯尼考（規(guī)格：10%）、鹽酸多西環(huán)素（規(guī)格：10%），共涉及7種抗生素。

供試益生菌。解淀粉芽孢桿菌（BaciLLus amyLoLiquefaciens）（BNCC 185324）、納豆芽孢桿菌（BaciLLus natto）（BNCC 336388） 購(gòu)買于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；枯草芽孢桿菌（BaciLLus subtiLis）、地衣芽孢桿菌（BacLicusLincheniformis）、沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas paLustris）、啤酒酵母菌（S.cerevisiae）、植物乳桿菌（L.pLantarum）、干酪乳桿菌（L.casei）與鼠李糖乳桿菌(LactobaciLLus rhamnosus)均為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 病原菌分離與鑒定

從5組平行樣病樣中隨機(jī)選取3組在超凈工作臺(tái)上操作，用灼熱的刀片燙死表面雜菌，再通過無菌操作將病雞的組織采用平板劃線法分離病原菌，頭、肺、肝及脾臟各1個(gè)平板，共使用12個(gè)平板，倒置于37℃培養(yǎng)箱中隔夜培養(yǎng)，長(zhǎng)出單菌落后再劃線純化培養(yǎng)。將純化后的菌株采用16S rRNA細(xì)菌通用引物[14]進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物為27F：5'-GAGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3'，反向引物為1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。所得序列經(jīng)NCBI（美國(guó)生物技術(shù)信息中心）數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST進(jìn)行在線同源性比對(duì)。

1.3 藥物敏感性試驗(yàn)

采用試管二倍稀釋法進(jìn)行操作。以藥物標(biāo)注的使用濃度為參考，設(shè)為第一濃度梯度（最低濃度），往后按二倍梯度提高濃度，設(shè)置6個(gè)稀釋度梯度。即往第1支無菌的小試管（15×100）中加入1 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，再加入1 mL產(chǎn)品母液，混勻，從第1支試管吸取1 mL混合物到第2支含1 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，以此類推，直到第6支試管，并從第6支試管吸取1 mL液體棄去。然后分別向試管中加入0.1 mL菌液（108CFU·mL-1），于 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h（對(duì)照組為1 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基加0.1 mL菌液），觀察是否長(zhǎng)菌。

1.4 益生菌抑菌試驗(yàn)

采用管碟法[15-16]并稍加改進(jìn)。取1 mL病原菌懸液加入50℃ 100 mL牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中搖勻（菌終濃為 105CFU·mL-1），倒入培養(yǎng)皿中（厚度約為3 mm），待冷卻凝固后將牛津杯置于平板中，向牛津杯中加入0.25 mL益生菌菌液 （濃度為108CFU·mL-1），置于37℃下培養(yǎng)24 h。觀察有無抑菌圈產(chǎn)生，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.5 益生菌免疫保護(hù)試驗(yàn)

將60只45日齡健康雞分成6組，每組10只，分別為對(duì)照組1、對(duì)照組2，大腸桿菌感染組1、大腸桿菌感染組2和雞葡萄球菌感染組1、雞葡萄球菌感染組2，其中組別2為益生菌保護(hù)組。感染組皮下注射分離菌 1 mL（濃度為 108CFU·mL-1）、對(duì)照組 1、對(duì)照組 2注射1 mL 0.85%生理鹽水；益生菌保護(hù)組飲水中加入酵母菌和乳酸菌等益生菌，連續(xù)觀察10 d。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離

在3組平行樣的頭、肺、肝、脾臟中，只有肺平板均分離出細(xì)菌。通過菌落形態(tài)觀察，有2種不同形態(tài)的菌，一種為淺白色、半透明的菌落，一種為淡黃色、不透明的菌落（見圖2）；通過革蘭氏染色，鏡檢結(jié)果表明，淺白色的為桿菌、陰性菌（見圖3），淡黃色的為球菌、陽(yáng)性菌（見圖4）。分別標(biāo)注為1號(hào)菌、2號(hào)菌。

圖2 病雞肺分離菌平板

圖3 肺部分離1號(hào)菌(革蘭氏陰性桿菌)

圖4 肺部分離2號(hào)菌(革蘭氏陽(yáng)性球菌)

2.2 菌種測(cè)序鑒定

將純化好的這兩株病原菌進(jìn)行菌種測(cè)序鑒定，菌株基因系列如下：

1號(hào)菌株通過測(cè)序得到16S rRNA片段長(zhǎng)度為1417 bp，具體測(cè)序系列結(jié)果為：

2號(hào)菌株通過測(cè)序得到16S rRNA片段長(zhǎng)度為1434 bp，具體測(cè)序系列結(jié)果為：

兩個(gè)菌株基因系列通過NCBI采用BLAST軟件進(jìn)行菌株同源性比對(duì)，1號(hào)菌與Escherichia coLi AH01的核苷酸序列同源性為 99.93%，2號(hào)菌與StaphyLococcus gaLLinarum LMG19119的核苷酸序列同源性為100%。

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

不同濃度的10種市場(chǎng)藥物產(chǎn)品（7種藥物）對(duì)大腸桿菌和雞葡萄球菌兩株分離菌的抑菌結(jié)果分別見表1和表2。

表1 10種市場(chǎng)藥物產(chǎn)品對(duì)大腸桿菌的抑菌性

表2 10種市場(chǎng)藥物產(chǎn)品對(duì)雞葡萄球菌的抑菌性

從表1和表2可以看出，在藥品試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，酒石酸泰樂菌素、替米考星、硫氰酸紅霉素、延胡索酸泰妙菌素和氟苯尼考等5種抗生素對(duì)大腸桿菌與雞葡萄球菌無抑菌效果；阿莫西林產(chǎn)品用量為正常標(biāo)簽用量的8倍及以上才能抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，而對(duì)雞葡萄球菌則無抑制作用；鹽酸多西環(huán)素產(chǎn)品能有效抑制大腸桿菌生長(zhǎng)，若對(duì)雞葡萄球菌起抑制作用則需正常標(biāo)簽用量的8倍及以上。

2.4 益生菌的抑菌效果

枯草芽孢桿菌等9種益生菌對(duì)大腸桿菌和雞葡萄球菌兩株分離菌的抑菌結(jié)果分別見表3和表 4。

表3 9種益生菌對(duì)大腸桿菌的抑制效果

從表3和表4可以看出，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌等5種益生菌對(duì)大腸桿菌和雞葡萄球菌均無抑制作用；啤酒酵母菌對(duì)雞葡萄球菌具有抑制效果，但對(duì)大腸桿菌無抑制作用；植物乳桿菌、干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌能夠有效抑制大腸桿菌和雞葡萄球菌，抑菌圈非常明顯。

表4 9種益生菌對(duì)雞葡萄球菌的抑制效果

2.5 分離菌株致病性和益生菌免疫保護(hù)結(jié)果

分離菌的致病性和益生菌的保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 兩株分離菌的致病性和益生菌的保護(hù)

從表5可以看出，兩株分離菌對(duì)雞均有不同程度的致病性，其中大腸桿菌致病性較弱，在注射感染7 d內(nèi)死亡率為40%，雞葡萄球菌致病性很強(qiáng)，在注射感染7 d內(nèi)死亡率為100%。但是，在飲用水中添加益生菌后，注射感染大腸桿菌組未見雞死亡；注射感染雞葡萄球菌組死亡率明顯下降，死亡率為20%。

3 討論

在雞養(yǎng)殖業(yè)中由大腸桿菌引發(fā)的疾病普遍存在，且危害較為嚴(yán)重，嚴(yán)重時(shí)死亡率高達(dá)50%。如何有效防控該病的發(fā)生已經(jīng)成為一種重要關(guān)鍵的技術(shù)問題[18]。經(jīng)過對(duì)病樣的分離純化、菌種鑒定，初步判斷雞的死亡很有可能是由大腸桿菌與雞葡萄球菌感染導(dǎo)致的。國(guó)內(nèi)外關(guān)于雞感染葡萄球菌的文獻(xiàn)[4-6]很多，但主要集中在金黃色葡萄球菌，對(duì)雞葡萄球菌的研究未見報(bào)道。

經(jīng)藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)上10個(gè)畜禽產(chǎn)品（涵蓋7個(gè)抗生素）替米考星、氟苯尼考等5種抗生素在試驗(yàn)藥物濃度范圍內(nèi)對(duì)大腸桿菌與雞葡萄球菌無抑菌效果；阿莫西林等產(chǎn)品需要較高劑量才有抑制作用，這表明抗生素的長(zhǎng)期使用提高了大腸桿菌和葡萄球菌等病原菌的耐藥性[19-21]。鹽酸多西環(huán)素等產(chǎn)品能有效抑制大腸桿菌生長(zhǎng)，但對(duì)雞葡萄球菌起抑制作用則需正常藥劑的8倍及以上。這表明，抗生素對(duì)病原菌的抑制作用具有一定的局限性，在用藥過程中需對(duì)因用藥，建議先做藥敏試驗(yàn)，避免濫用抗生素。

益生菌是有利于宿主健康的單細(xì)胞微生物或組成明確的混合微生物[22]，能調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等，其中乳酸菌除了能夠調(diào)節(jié)腸道微生物群平衡，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)，還能定殖于腸道[24-27]。在家禽養(yǎng)殖中，可有效維持動(dòng)物腸道菌群平衡，抑制有害細(xì)菌的產(chǎn)生，減少疾病的發(fā)生[28]。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室9種益生菌菌株的篩選，得到4株可以抑制病原菌的益生菌，其中啤酒酵母菌對(duì)雞葡萄球菌具有抑制效果，但對(duì)大腸桿菌無抑制作用；植物乳桿菌、干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌對(duì)大腸桿菌和雞葡萄球菌具有明顯的體外抑制效果；益生菌保護(hù)試驗(yàn)也進(jìn)一步表明，在飲用水中添加酵母菌和乳酸菌能夠有效防止大腸桿菌和雞葡萄球菌的感染。有研究表明[29-30]，酵母菌與病原菌之間主要通過營(yíng)養(yǎng)與空間的競(jìng)爭(zhēng)而產(chǎn)生拮抗作用；干酪乳桿菌、植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌則通過產(chǎn)生抗菌肽來達(dá)到抑制病原菌[31-35]。根據(jù)這4株菌抑菌效果和相關(guān)抑菌機(jī)制，我們將進(jìn)一步檢測(cè)益生菌對(duì)其他致病菌的抑制效果，同時(shí)優(yōu)化菌種復(fù)配和發(fā)酵培養(yǎng)條件，為益生菌產(chǎn)品的開發(fā)奠定良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從病雞肺分離得到的兩株病原菌分別為大腸桿菌與雞葡萄球菌，對(duì)市場(chǎng)上10個(gè)畜禽抗生素產(chǎn)品具有較強(qiáng)的耐藥性。益生菌（植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌與酵母菌）在體外對(duì)大腸桿菌與雞葡萄球菌具有良好的抑制作用。因此，在生產(chǎn)實(shí)際運(yùn)用過程中，建議先做藥敏試驗(yàn)，對(duì)癥用藥，同時(shí)使用益生菌產(chǎn)品代替抗生素產(chǎn)品，避免抗生素濫用。