李 明，馬 飛，張俊華

(1.寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021；2. 寧夏大學葡萄與葡萄酒研究院，寧夏 銀川 750021；3. 寧夏大學環(huán)境工程研究院，寧夏 銀川 750021)

寧夏銀北地區(qū)為典型的干旱、半干旱地區(qū)，該區(qū)域降雨稀少，蒸發(fā)強烈，地下水位高，在強烈的蒸發(fā)作用下，鹽分不斷累積于土壤表層，土壤發(fā)生不同程度的鹽漬化[1]。土壤鹽漬化影響了作物生長，嚴重制約了該地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。銀北地區(qū)現(xiàn)有鹽堿土面積約1.0×105hm2，占寧夏鹽堿地總面積的58%以上[2]，鹽堿化土壤主要以平羅縣西大灘一帶為典型代表[3]。作為寧夏主要商品糧生產(chǎn)基地之一[4]，由于該地區(qū)土地平整，水資源便利，適合大面積種植水稻。

基于水稻種植在糧食生產(chǎn)及全球氣候變化中的重要地位，稻田耕作年限對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響受到了越來越多的關注[5]。鹽堿環(huán)境條件下的土壤含鹽量和pH值比非鹽堿土高，土壤鹽分對微生物群落的活性、多樣性和結構存在顯著的影響[6]。

現(xiàn)有的研究證實了伴隨稻田耕作年限的增加，土壤理化性質(zhì)在百年至千年尺度內(nèi)呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律[7]，而在百年尺度內(nèi)土壤微生物群落及功能也發(fā)生了相應的變化[8]。隨著鹽漬化土壤種稻年限增加，耕層土壤鹽分不斷降低，無機氮含量不斷增加，部分土壤酶活性增強[9]。真菌群落多樣性隨種稻年限延長而先增加后逐漸減少，種稻5 a時真菌群落多樣性最高[10]。在不同稻田耕作年限序列尺度上的研究表明，土壤有機質(zhì)、養(yǎng)分有效性及土壤微生物群落特征等在最初幾十年內(nèi)變化最為劇烈，在50～100 a內(nèi)即可凸顯人為影響下的稻田耕作年限的作用[11]。此外研究表明，隨著蘇打鹽堿地墾殖種稻年限的增加，耕層土壤鹽分不斷降低，無機氮含量不斷增加，部分土壤酶活性增強[12]。

土壤微生物是使土壤具有生命力的最主要成分，在土壤形成和發(fā)育過程中起著重要作用，是評價土壤質(zhì)量的一個重要指標[13]。土壤微生物控制著土壤有機質(zhì)的分解和轉化，而不同的土地利用方式能顯著影響土壤微生物的多樣性[14]。國內(nèi)針對鹽堿土壤的微生物研究較多，康貽軍等[15]研究灘涂鹽堿土壤微生物生態(tài)特征；曹國棟等[16]對扇緣帶鹽堿土上生長的3種植物類型下的土壤微生物類群數(shù)量進行了研究；張廣志等[17]在鹽堿土壤鑒定出假單胞菌屬和黃桿菌屬；牛世全等[18]對河西走廊鹽堿土細菌多樣性的16S rDNA研究表明，γ-變形菌為優(yōu)勢菌群。然而，針對寧夏引黃灌區(qū)鹽漬化土壤中的微生物種群結構、優(yōu)勢菌系以及土壤理化性質(zhì)變化與微生物活動之間的生態(tài)關系等相關報道較少。

本試驗采集寧夏平羅西大灘不同種稻年限鹽漬化稻田土壤，通過高通量測序測定了土壤細菌群落結構、土壤理化性質(zhì)的變化及其二者之間的關系，為揭示鹽漬化稻田土壤的演變規(guī)律、為寧夏地區(qū)鹽漬化土壤生物多樣性現(xiàn)狀的研究提供基礎數(shù)據(jù)，并為鹽漬化土壤的改良和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗區(qū)位于寧夏銀北地區(qū)前進農(nóng)場三站，屬于賀蘭山東麓洪積平原與黃河沖擊平原過渡地帶，地形較為平坦，平均海拔1 100 m左右。試驗地土壤類型為龜裂堿土(俗稱白僵土)，高度堿性，弱度鹽化。一般地下水埋深1.5 m左右，地下水主要含硫酸鹽、氯化物，并且普遍含有碳酸鹽。土壤pH值8.5以上，堿化度20%以上，含鹽量0.15%以上，鹽分類型主要有NaCl、Na2SO4、Na2CO3，土壤有機質(zhì)含量低，土質(zhì)粘重，氮、磷含量低，鉀含量較高[19]。

1.2 試驗設計

田間大區(qū)對比試驗設在寧夏銀北地區(qū)前進農(nóng)場試驗基地，采樣地信息見表1。以新開墾種植1 a的玉米地作為對照(旱地)，選擇相鄰種稻年限為0、1、6、12、21 a的鹽堿地稻田土壤為研究對象。試驗共設6個處理，每塊稻田中隨機選取3個667 m2小區(qū)，作為3個重復，每塊稻田面積約為33 350 m2。供試品種為耐鹽堿品種富源4號(96D10)，水稻種植方式為旱直播，播種量為337.5 kg·hm-2。播種前施足底肥，基施N15P15K15復合肥225 kg·hm-2，磷酸二銨300 kg·hm-2，苗期追肥過磷酸鈣375 kg·hm-2。田間管理按常規(guī)進行。

表1 采樣地信息

1.3 樣品采集

于水稻生長旺季7月12日采集0～20 cm耕層土樣，在距水稻根圍15 cm處用鉆頭直徑6 cm的土鉆采樣，采用多點采樣的方法，每個試驗小區(qū)隨機分5點采集土樣充分混勻，將新鮮土樣剔除根系和碎石子后分成2份，一份低溫冷藏帶回實驗室，在-20℃冷凍保存，用于土壤微生物的測定，另一份帶回實驗室風干后磨碎過2 mm篩，用于測定土壤理化性質(zhì)。

1.4 土壤理化性質(zhì)測定

測定土壤有機碳含量需要在加熱條件下，用過量的重鉻酸鉀-硫酸溶液氧化土壤有機碳；全氮含量采用凱氏定氮法；土壤pH值采用酸度計法；電導率采用電導法；土壤銨態(tài)氮含量采用KCl浸提-蒸餾法測定；土壤硝態(tài)氮含量測定，稱取土樣10.0 g，用100 mL的2 mol·L-1KCl振蕩提取土樣30 min后，采用紫外分光光度法測定硝態(tài)氮含量。

1.5 土壤微生物碳測定

微生物量碳(MBC)采用氯仿-熏蒸法測定[20]。微生物碳含量為熏蒸浸提液與未熏蒸浸提液中碳含量的差值除以轉換系數(shù)0.45，浸提液中的碳含量用微量有機碳分析儀(multi N/C 3100，Jena, Germany)測定。

1.6 土壤微生物群落結構測定

1.6.1 土壤DNA提取 采用Mobio公司的Power soil DNA Isolation Kit 土壤微生物總DNA提取試劑盒提取土壤微生物總DNA。對提取后的DNA產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，合格DNA稀釋至1 ng·L-1保存于-80℃用于PCR擴增。

1.6.2 PCR擴增及測序 細菌核糖體編碼基因相應區(qū)段的擴增及測序服務由諾禾致源生物信息公司完成。土壤DNA提取完成后，進行16S rDNA的V4區(qū)擴增，所用引物為515F/806R(5’-GTG CCA GCM GCC GCG GTAA-3’/5’-GGA CTA CHV GGG TWT CTAAT-3’)[21]。高通量測序由諾禾致源Illumina HiSeq 2500平臺運行(http://www.novogene.com/index.php, Beijing，China)，最后所測得數(shù)據(jù)在250～300 bp之間產(chǎn)生。文庫構建參照Na等[22]的方法。

1.6.3 DNA數(shù)據(jù)分析 測序原始數(shù)據(jù)的拼接、過濾、聚類分析及物種注釋均參照文獻[22]。其中，序列拼接利用FLASH(V1.2.7)、序列過濾利用QIIME(V1.2.7)、聚類利用UPARSE pipeline (V1.2.7)、物種注釋利用RDP classifier(V2.2)軟件。此外，利用QIIME計算不同樣品中細菌群落的α多樣性和β多樣性指標[21]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用一元方差分析鹽漬化稻田不同耕作年限對土壤各項測定指標的影響，不同耕作年限之間的多重比較采用最小顯著極差法(LSD，α=0.05)。采用Mothur軟件計算多樣性指數(shù)(Chao-1、Shannon和Simpson指數(shù))。皮爾遜相關系數(shù)(Pearson correlation coefficient)用于分析土壤理化性質(zhì)與土壤細菌群落多樣性的相關性。冗余分析(Redundancy analysis, RDA)的二維排序圖能夠較直觀地展現(xiàn)土壤細菌群落與土壤其他性質(zhì)之間的關系。RDA排序圖中，各樣方之間的線段長度代表樣方之間的歐幾里德距離，長度越長代表兩者之間的差異越大，反之越?。煌寥拉h(huán)境因子矢量箭頭的長短代表土壤環(huán)境因子對土壤細菌群落結構的影響程度，矢量箭頭越長代表影響越大。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0和CANOCO 4.5軟件。

2 結果與分析

2.1 種稻年限對鹽漬化土壤理化性質(zhì)的影響

表2 不同種稻年限鹽漬化土壤理化性質(zhì)

表3 土壤理化性質(zhì)間的相關系數(shù)

2.2 種稻年限對鹽漬化土壤細菌群落在門水平的影響

通過對18個土壤樣品的細菌群落分析，共獲得高質(zhì)量序列67473-84608，有效序列52179-67005，在97%相似性下測序覆蓋率均在99%以上，說明測序數(shù)據(jù)量合理，能真實反應土壤微生物的群落組成。

對不同種稻年限鹽堿地土壤樣品中優(yōu)勢細菌門的分析表明，土壤中相對豐度排名前十的優(yōu)勢細菌分別為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、藍細菌門(Cyanobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(圖1)。

圖1 不同種稻年限鹽漬化土壤細菌各門類相對豐度Fig.1 Relative abundance of the bacterial community at thephylum level in the saline soil of different rice planting year

變形菌門是土壤中最為優(yōu)勢的菌群，占36.39%～53.20%。變形菌門的4個亞群的分布在不同種稻年限和旱地土壤中有顯著差異(P<0.05)(圖2)。種稻0 a土壤中γ-變形菌綱相對含量著高于其他樣點(P<0.05)，分別高出8.96%～100.01%。擬桿菌門是第二大優(yōu)勢菌群，其豐度在種稻12 a和21 a土壤中含量分別為20.25%和20.43%，較其他樣點分別高出47.38%～88.55%和48.76%～90.32%。放線菌門是第三大優(yōu)勢菌群，其豐度在種稻0年的鹽漬化土壤中含量最高，為17.93%，高出其他樣點52.72%～189.66%。

圖2 不同種稻年限鹽漬化土壤變形菌亞群分布Fig.2 Distribution of proteobacteria subgroups in thesaline soil of different rice planting year

2.3 不同種稻年限鹽漬化土壤細菌群落在屬水平的豐度變化

從屬水平對不同樣品中細菌的相對豐度變化分析表明，Buchnera在所有樣點中的相對豐度都>1%，Buchnera屬于變形菌門；Nitrosospira、Steroidobacter、Bryobacter在旱地土壤中的相對豐度顯著高于其他樣點(P<0.01)；unidentified_OM1_clade和Bacillus在鹽漬化荒地土壤中(0 a)顯著高于其他土壤樣品(P<0.01)，相對豐度為10.26%和3.66%(表4)；Skermanella、Syntrophobacter、Pseudarthrobacter相對豐度在種稻1 a的土壤中顯著高于其他土壤樣品(P<0.01)；Pedobacter、Delftia、Gillisia、Azospirillum、[Desulfobacterium]_catecholicum_group相對豐度在種稻12 a的土壤中顯著高于其他土壤樣品(P<0.01)；Thioalkalispira、Thiobacillus、unidentified_Chloroplast相對豐度在種稻21 a的土壤中顯著高于其他土壤樣品(P<0.01)。

表4 不同種稻年限土壤細菌群落在屬水平上的豐度變化/%

2.4 不同種稻年限鹽漬化土壤細菌群落α多樣性指數(shù)

不同種稻年限土壤細菌群落多樣性指數(shù)Shannon、Simpson和豐富度指數(shù)Chao-1、ACE和測序深度指數(shù)Coverage如表5所示。研究表明，種稻6 a的Shannon、Chao-1和ACE指數(shù)顯著高于其他種稻年限(P<0.05)。種稻12 a的Shannon、Chao-1和ACE指數(shù)顯著低于其他種稻年限(P<0.05)。

2.5 不同種稻年限鹽漬化土壤中細菌群落結構主成分分析

主成分分析發(fā)現(xiàn)，旱地和種稻1 a的土壤細菌群落結構相似；種稻6、12 a和21 a細菌群落結構相似；種稻0 a土壤和其他樣地細菌群落結構差異顯著(圖3)。

圖3 不同種稻年限土壤細菌群落結構的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of bacterialcommunity composition of saline soils in differentrice planting year

2.6 土壤細菌群落與土壤理化因子的關系

土壤細菌多樣性指數(shù)和豐富度與MBC顯著正相關(P<0.05)，土壤電導率和Simpson指數(shù)顯著負相關(P<0.05)(表6)。

表5 不同種稻年限土壤樣品α多樣性分析

表6 土壤細菌多樣性指數(shù)與土壤理化性狀Pearson相關性分析

通過Canoco 5.0軟件對環(huán)境因子和土壤細菌群落進行RDA分析。由圖4可知，第一排序軸和第二排序軸分別解釋了細菌群落變化的45.52%和35.98%，經(jīng)過蒙特卡羅檢驗，土壤電導率值(F=3.7，P=0.002)、微生物碳(F=2.9，P=0.05)、硝態(tài)氮(F=3.3，P=0.02)是土壤微生物群落的主要影響因子。

圖4 不同種稻年限鹽漬化土壤性質(zhì)與細菌群落RDA分析Fig.4 Results from redundancy analysis (RDA) to explorethe relationship between soil bacterial community andsoil physicochemical characteristics

3 討 論

3.1 稻作年限對鹽漬化土壤養(yǎng)分和微生物學指標的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，有機質(zhì)含量在旱地和種稻21 a的土壤中較鹽堿荒地顯著增加；微生物量碳隨稻作年限延長先升高，在種稻6 a達到最高，而后有所下降；隨著種稻年限延長，土壤pH值有所下降；與種稻0 a的土壤相比，耕作后土壤電導率顯著下降，這主要是由于灌溉使土壤鹽分迅速下降，這與周麗等[22]的研究結果相一致。這一系列變化歸因于每年肥料的施用，因為研究區(qū)位于鹽漬化土壤地區(qū)，植被生長量偏低，土壤有機質(zhì)含量較低，肥料的施用有利于土壤有機質(zhì)的增加。另外，秸稈還田也增加了土壤有機物質(zhì)，進入土壤的水稻秸稈不斷被分解，逐步進行礦化，秸稈中的有機物質(zhì)釋放到土壤中，供作物吸收利用[23]。土壤微生物生物量被認為是反映土壤質(zhì)量變化的敏感性指標[11]。Li等[24]發(fā)現(xiàn)土壤資源有效性的增加是微生物性質(zhì)改善的主要原因[24]。土壤全氮和硝態(tài)氮在旱地土壤中含量最高，這是由于長期施肥改變了土壤氮含量[25]。

3.2 稻作年限對土壤細菌群落多樣性和組成的影響

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)使得鹽漬化土壤的細菌多樣性增加，在本研究中發(fā)現(xiàn)耕作使土壤細菌微生物多樣性指數(shù)增大，這主要是由于耕作過程中改變了地表植被覆蓋，作物生物量、凋落物、根系等顯著高于鹽漬化荒地，為土壤提供大量養(yǎng)分，增加了土壤碳、氮的供應，不僅改變了土壤微生物結構，提高了微生物生物量，還增加了土壤微生物多樣性[26]。

細菌的變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、厚壁菌門等是農(nóng)田土壤中經(jīng)常被檢測到的類群[27]。與大多數(shù)鹽漬化土壤相似，本研究中門水平的土壤細菌以變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、綠彎菌門為主，四者含量約占總測序序列的74.4%，其中變形菌豐度最高(42.6%)。變形菌門是細菌中最大的門，其中的許多類群可以進行固氮作用，并能夠適應各種復雜的環(huán)境[28]。擬桿菌門和放線菌門分別占總測序序列的14.9%和10.9%。擬桿菌門是第二大優(yōu)勢種群，水稻土壤中擬桿菌門土壤細菌的相對豐度顯著高于其他土地類型[19]。另外，研究表明擬桿菌門對高鹽環(huán)境具有較強的抗性，是鹽堿土壤中的優(yōu)勢種群[18]，這在本研究中得到了證實。本研究發(fā)現(xiàn)鹽漬化土壤種稻后降低了放線菌門的豐度。這與Kob?rl等[29]比較了埃及沙漠土壤與其臨近進行農(nóng)業(yè)耕作的土壤細菌群落所得到的結果相一致。他們得出耕種降低了放線菌門的相對豐度。放線菌門在采砂地中的相對豐度顯著高于玉米土壤環(huán)境[30]；土壤水分是影響放線菌門的主要因子[31]。大量研究證實，放線菌門是好氣性微生物，土壤含氧量較高，更適合放線菌門的生長[32]，這與本研究的結果相似。綠彎菌門相對豐度在種稻6 a和21 a土壤中顯著高于其他處理，綠彎菌門是一類通過光合作用，以CO2為碳源產(chǎn)生能量的細菌，能在有效養(yǎng)分較低的條件下轉化難降解的碳[33]。

在綱水平，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)在灘涂土中有相對較高的豐度，而δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)在水稻土中更占優(yōu)勢，這與本研究結論一致[34]。

在屬水平，旱地和種稻1 a土壤中鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)的相對豐度高于其他土樣，鞘氨醇單胞菌屬具有解鉀能力和去除難降解污染物的能力[35]，且與植物聯(lián)系非常密切，在根際環(huán)境中可以分泌糖類營養(yǎng)物促進植物生長，這類益生菌的增加表明土壤微生態(tài)環(huán)境改善[27]。Anaerolinea(屬)相對豐度在旱地和荒地土壤中都較低，隨著種稻年限延長，其相對豐度逐漸增加，研究發(fā)現(xiàn)，Anaerolinea可以產(chǎn)生有機營養(yǎng)素、發(fā)酵有機酸、蛋白質(zhì)提取物和一些碳水化合物[36]。芽孢桿菌屬(Bacillusa)具有較高的抗逆性，能夠在環(huán)境惡劣的條件下存活[37]，這與本研究結論一致，芽孢桿菌屬的相對豐度在鹽漬化荒地土壤(0 a)處理中含量顯著高于其他處理。隨著種稻年限延長溶桿菌屬的相對豐度在逐漸上升，溶桿菌屬(Lysobacter)具有拮抗多種植物病原菌功能[38]，同時溶桿菌屬具有固氮功能。以往的研究表明土壤氮含量的增加可能是固氮功能菌發(fā)揮主導作用[39]。在固氮環(huán)節(jié)中Paenibacillus[40]和假單胞菌屬(Pseudomonas)[41]等可將空氣中的分子氮轉化為有機氮，這在很大程度上增加了土壤的氮素營養(yǎng)，從而促進了作物增產(chǎn)[42]。硫化細菌屬(Thiobacillus)相對豐度在種稻6、12 a和21 a的土壤中顯著高于其他樣品，硫化細菌可以為植物供給硫酸態(tài)硫素[43]；本研究發(fā)現(xiàn)亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)的相對豐度在旱地土壤中的相對豐度顯著高于稻作土壤，亞硝化螺菌屬的氨氧化細菌在土壤氮素循環(huán)中有重要作用[44]；Bryobacter的相對豐度在旱地和種稻1、6 a的土壤相對豐度較高，已有的研究發(fā)現(xiàn)Bryobacter具有分解有機質(zhì)、促進土壤碳循環(huán)的功能[45]。

為了了解種稻后土壤理化性質(zhì)變化對鹽漬化土壤細菌群落組成的影響，本研究選擇土壤有機碳、全氮、pH值、電導率、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和微生物碳與土壤細菌門水平相對豐度進行RDA分析。結果表明(圖4)，土壤電導率、微生物碳和硝態(tài)氮對細菌群落組成影響較大。Pearson相關性分析也表明土壤電導率值與辛普森指數(shù)呈顯著負相關。這表明鹽分是影響不同鹽堿程度土壤中微生物群落結構的顯著因素，土壤電導率和pH值對鹽堿土壤細菌群落結構影響最大[46]。土壤微生物對鹽分變化十分敏感，當土壤鹽分升高時，鹽分脅迫直接改變了微生物的生存環(huán)境，造成土壤微生物滲透脅迫，抑制和降低土壤活性微生物種群數(shù)量[46]。

4 結 論

1)變形菌門、擬桿菌門和放線菌門在所有鹽漬化土壤中為優(yōu)勢種類；布赫納氏菌屬是所有樣點的優(yōu)勢屬種。細菌群落α多樣性指數(shù)在種稻12 a土壤中顯著低于其他樣點。其中，土壤中微生物碳和電導率值是導致種稻12 a土壤細菌群落多樣性不同于其他種稻年限土壤的主要因素。冗余分析顯示土壤電導率、微生物碳和硝態(tài)氮含量對鹽漬化土壤細菌群落結構的影響顯著。種稻時間的長短顯著影響了鹽漬化土壤細菌群落多樣性。

2)在常年種稻和旱作條件下，土壤中固碳、固氮和溶磷功能菌大量出現(xiàn)，土壤理化性質(zhì)變化與其相應功能菌屬的變化具有相同變化趨勢，表明無論是種植水稻還是旱作玉米處理都使得土壤的生物學特性優(yōu)于鹽漬化荒地土壤。

3)有機碳在種稻21 a的鹽漬化土壤中含量最高，pH值在種稻21 a的鹽漬化土壤最低；土壤電導率和微生物碳在種稻12 a的鹽漬化土壤中最低。土壤微生物群落和理化性質(zhì)的變化趨勢顯示隨著種稻年限的延長，鹽漬化土壤生境呈現(xiàn)明顯的改善趨勢。