范雨鑫 劉玫肖 陳晶晶 徐鑫 張宇 岳鵬 曹文靜 寶福凱 柳愛華

目前，結(jié)核病發(fā)病機制仍然欠清晰、診斷方法不夠理想，患者得不到及時診斷，導致預后不良，疾病廣泛傳播，醫(yī)療保健費用增加。因此，迫切需要新的檢測方法或生物標志物來實現(xiàn)對結(jié)核病患者的早期診斷和及時治療，進而提高結(jié)核病患者生存率，控制疾病傳播。結(jié)核分枝桿菌的細胞壁主要是以分枝桿菌基-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖復合物(mycoly-larabinogalactan-peptidoglycan，mAGP)為基礎(chǔ)的大分子結(jié)構(gòu)[1]，其他的一些脂類，如磷脂酰肌醇甘露糖苷(phosphatidyl-myo-inositol mannosides，PIM)及其衍生的糖脂、脂甘露聚糖(lipomannan，LM)和脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)，也存在于細胞壁中，這些結(jié)構(gòu)對結(jié)核分枝桿菌的生長、生存和毒力至關(guān)重要。筆者綜述了LAM在免疫反應中的作用及在結(jié)核病診斷中的應用，為其可能作為一種新的結(jié)核病診斷生物標志物提供了新的視野與思路。

LAM的分子結(jié)構(gòu)

20世紀30年代，Masucci等從分枝桿菌細胞壁中分離出一種血清活性多糖，經(jīng)過對該多糖的鑒定，發(fā)現(xiàn)其主要含有阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan，AG)、LAM及甘露聚糖(lipomannan，LM)[2]。其中，LAM是一種以磷脂酰肌醇(phosphatidyl inositol，PI)為基礎(chǔ)的具有多種生物活性的脂聚糖[3]，主要由一個脂質(zhì)錨點，即甘露糖基磷脂酰肌醇(mannosyl phosphate inositol，MPI)，一個d-甘露聚糖和d-阿拉伯聚糖組成的多糖骨干和甘露糖帽三部分構(gòu)成(圖1)。

圖1 LAM的結(jié)構(gòu)示意圖

恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)的LM和LAM結(jié)構(gòu)缺陷可導致其不能進行抗酸染色，對β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感性也增加，使其更快地被巨噬細胞殺死[4]，所以闡明這些重要分子的完整結(jié)構(gòu)有助于闡明結(jié)核病發(fā)病機制，以及提供新的診斷手段。

一、PIM的結(jié)構(gòu)

PIM為一種糖脂，是LAM、LM的前體分子，含有一個PI單位。PI單位由脂肪酸磷酸二酯連接的肌醇構(gòu)成，當肌醇的O-2和O-6位被甘露糖基糖基化后，形成MPI (圖2)。在PIM基礎(chǔ)上形成的MPI是一種典型的糖基磷酸肌醇錨(glycosyl phosphate inositol anchor，GPI)衍生物，其結(jié)構(gòu)異質(zhì)性可隨脂肪酸的數(shù)量、位置和性質(zhì)發(fā)生變化[5]。

圖2 磷脂酰肌醇甘露糖苷與甘露糖基磷酸肌醇化學結(jié)構(gòu)示意圖

分枝桿菌中最豐富的PIM類型是PIM2(Ac1PIM2、Ac2PIM2)和PIM6(Ac1PIM6、Ac2PIM6)，它們是合成LAM及LM α(1→6)甘露糖骨架的關(guān)鍵模塊。在Ac1PIM2和Ac2PIM2中，MPI作為錨定點可進一步被甘露糖和阿拉伯糖糖基化，產(chǎn)生不同形式的PIM、LM和LAM[6]。

二、LAM的結(jié)構(gòu)

在所有分枝桿菌中，LAM和LM都含有一個甘露糖骨架，這個甘露糖骨架由5～10個α(1→2)甘露糖基周期性修飾21～34個α(1→6)甘露糖基所組成[7]，PIM2則在α(1→6)方向與甘露糖骨架相連。

成熟的甘露糖骨架會進一步與55～72個阿拉伯糖殘基組成的阿拉伯聚糖結(jié)構(gòu)域相連，形成LAM[8-9]。阿拉伯糖鏈的大部分末端阿拉伯糖單位可以連接到2～4個含甘露糖的寡糖，稱為甘露糖帽基序(mannose cap motif，MCM)。根據(jù)分枝桿菌種類的不同，MCM也不同。在結(jié)核分枝桿菌和其他致病性分枝桿菌中，LAM的阿拉伯糖鏈末端連接數(shù)個甘露寡糖形成甘露糖修飾的脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped lipoarabinomannan，ManLAM)[10]，而在非致病性分枝桿菌中，LAM的阿拉伯糖鏈末端連接磷酸肌醇，形成磷酸肌醇修飾的脂阿拉伯甘露聚糖(phospho-myo-inositol-capped lipoarabinomannan，PI-LAM)[11](圖1)。

LAM誘導的免疫應答與免疫調(diào)節(jié)

結(jié)核分枝桿菌感染可能使宿主患活動性結(jié)核病，但在大多數(shù)情況下細菌持續(xù)存在于受感染的宿主中，沒有臨床癥狀，形成結(jié)核分枝桿菌潛伏感染。這些不同的感染狀態(tài)很大程度上取決于入侵的結(jié)核分枝桿菌和宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用。

一、LAM誘導的固有免疫反應

在固有免疫應答中，巨噬細胞和樹突狀細胞(DC細胞)等免疫細胞可以通過其表達的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)識別結(jié)核分枝桿菌細胞壁上的某些成分，進而產(chǎn)生免疫反應。其中Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)[12-13]和C型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLR)與宿主識別結(jié)核分枝桿菌密切相關(guān)，其識別的目的是通過內(nèi)吞作用吞入細菌并隨后消滅細菌[14]。

LAM的前體分子PIM和LM等都有激活或抑制免疫功能的作用，不同毒力的實驗室結(jié)核分枝桿菌菌株(Erdman、H37Rv、H37Ra、BCG)的分子結(jié)構(gòu)、內(nèi)部異質(zhì)性和豐度存在差異，在結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中也觀察到LAM的甘露糖帽末端阿拉伯糖基的變化，這可能與菌株生物活性的不同有關(guān)[15]。因此，ManLAM、LM和PIM可能是結(jié)核病發(fā)病機制中與結(jié)核分枝桿菌毒力強弱有關(guān)的關(guān)鍵因素。

ManLAM是一種病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated moleculer patterns，PAMP)，可以被TLR及CLR識別，進而啟動局部免疫應答，產(chǎn)生大量細胞因子。當巨噬細胞被細胞因子和固有免疫受體激動劑激活時可以直接發(fā)揮殺菌效應，DC細胞可以吞噬感染組織中的細菌，遷移到引流淋巴結(jié)，激活初始T和B淋巴細胞啟動適應性免疫反應[16]。

二、LAM和T細胞介導的免疫

T細胞介導的免疫應答在結(jié)核病的保護性免疫中起著重要作用。CD8+T淋巴細胞具有細胞毒活性，能夠通過凋亡相關(guān)蛋白Fas和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)介導的殺傷機制，以及胞外釋放穿孔素和顆粒酶等機制清除被結(jié)核分枝桿菌感染的細胞[17]。

以往研究認為，糖脂類不會誘導T細胞介導的免疫[18-19]，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)LAM及其結(jié)構(gòu)變體可以識別并激活CD1限制性T細胞。在識別分枝桿菌脂質(zhì)后，CD1限制性T細胞被激活，分泌促炎細胞因子(如γ-干擾素等)，并發(fā)揮細胞溶解和殺菌活性[19-21]。CD1限制性T細胞可表達穿孔素和顆粒酶B，限制細菌的生長，提示了一種可能的預防結(jié)核病的機制[22]。

三、LAM誘導的體液免疫

體液免疫可以調(diào)節(jié)機體對病原體的免疫應答，但體液免疫在結(jié)核病中的作用一直存在爭議。隨著研究的進展，體液免疫在抗結(jié)核免疫中的重要作用逐漸被揭示?？贵w可通過Fc受體介導的吞噬和抗體依賴的細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)來調(diào)節(jié)免疫應答，從而對許多細胞內(nèi)病原體發(fā)揮抗菌免疫作用[23]?？狗种U菌的抗體可在自然感染過程中形成，在活動性結(jié)核病期間，抗體反應尤為顯著，盡管這種抗體的親和力較低，但已證明這類特異性抗體可能阻止結(jié)核分枝桿菌的體內(nèi)播散[24]。在兒童中，抗LAM IgG抗體的存在與結(jié)核分枝桿菌播散呈負相關(guān)，這提示抗LAM抗體可能在限制結(jié)核分枝桿菌播散方面發(fā)揮重要作用[23]。

四、LAM在抗結(jié)核免疫中的免疫調(diào)節(jié)作用

結(jié)核分枝桿菌具有解除吞噬細胞殺菌作用的能力，即將殺菌的吞噬細胞轉(zhuǎn)化為可自我復制的安全避難所。ManLAM 存在于結(jié)核分枝桿菌表面，是PRR的配體，可以啟動免疫反應，TLR及CLR都可與結(jié)核分枝桿菌表面的LAM緊密結(jié)合，這種結(jié)合可以導致結(jié)核分枝桿菌的有效內(nèi)化，也是結(jié)核分枝桿菌進入吞噬細胞發(fā)揮毒力效應的重要分子[25]。LAM作為結(jié)核分枝桿菌的毒力因子，可以通過阻斷CD4+T淋巴細胞激活的傳統(tǒng)T細胞受體(T cell receptor，TCR)依賴途徑中一些關(guān)鍵分子的磷酸化，影響T細胞的活化[26]。Wong等[27]研究表明，結(jié)核分枝桿菌感染機體后，白細胞介素-10(interleukin，IL-10)等調(diào)節(jié)因子的存在有利于結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的生存，而LAM可以通過識別B細胞(B-10)表達的TLR2，促進IL-10的表達，延緩機體免疫系統(tǒng)對結(jié)核分枝桿菌的清除。

此外，ManLAM也可以作為一種可溶性分子，進入吞噬細胞后從感染的巨噬細胞以外泌體或凋亡小泡的形式傳遞到未被感染的抗原提呈細胞，促進T細胞的活化[28]。ManLAM 還具有幾種顯著的免疫抑制特性，包括抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生、抑制吞噬體的成熟、抑制巨噬細胞凋亡和抑制自噬，這些抑制作用可能是結(jié)核分枝桿菌形成潛伏感染的重要原因[14]。

LAM作為結(jié)核病診斷的生物標志物

傳統(tǒng)的肺結(jié)核的診斷，主要依賴于痰液抗酸桿菌涂片和對臨床標本中結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)，痰涂片敏感度僅為22%～43%，而結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)是一項耗時的工作，可能需要6～8周甚至更長時間才能得到結(jié)果[29]。在新發(fā)現(xiàn)的結(jié)核病病原學快速診斷方法中，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)具有較高的敏感度和特異度，成為比較理想的方法之一，WHO目前推薦Xpert MTB/RIF作為疑似結(jié)核病患者的初始檢測手段。但是，基礎(chǔ)設(shè)施和環(huán)境條件不足、缺乏儀器維護支持，以及技術(shù)人員的高流動性等問題成為了許多發(fā)展中國家和偏遠地區(qū)使用這項技術(shù)的障礙[30]。

一、LAM作為診斷結(jié)核病的生物標志物

結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的診斷可依賴結(jié)核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test，TST)或γ-干擾素釋放試驗(inter-feron-γ release assays，IGRA)，但無論是TST還是IGRA都不能幫助判斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染是否會發(fā)展為活動性結(jié)核病。TST特異度較低，在卡介苗(bacille Calmette-Guérin，BCG)接種人群和非結(jié)核分枝桿菌感染患者的檢測中可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果[31]。與TST相比，IGRA具有更高的特異度與敏感度，但對HIV感染患者的檢測作用有限，其高成本等問題也限制了IGRA的潛在效益[32]。

LAM作為結(jié)核分枝桿菌特有的細胞壁主要成分，是檢測結(jié)核分枝桿菌抗原的理想候選物[33]。20世紀90年代，Sada等[34]將LAM作為抗原，用ELISA技術(shù)檢測了66例肺結(jié)核、粟粒性結(jié)核病、結(jié)核性胸膜炎、淋巴結(jié)結(jié)核患者血清中的抗LAM IgG抗體，他們發(fā)現(xiàn)與之前其他純化抗原的研究數(shù)據(jù)相比較，該抗原的敏感度可達72%，特異度高達91%。此外，相較于IGRA，LAM檢測在HIV感染者中可能得到更多的應用。

在結(jié)核分枝桿菌感染期間，LAM存在于機體體液中，可以作為一種潛在的生物標志物來識別機體的感染狀態(tài)。結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的發(fā)展是一個連續(xù)的過程，可以從持續(xù)的非進展性感染和亞臨床感染進展到活動性疾病[35]，理論上，結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者發(fā)展為活動性結(jié)核病時，患者體內(nèi)的細菌新陳代謝活躍性增加。結(jié)核病患者LAM測定可部分反映細菌負荷，是診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染及監(jiān)測抗結(jié)核治療有效性的工具[10, 36-37]。

二、LAM檢測的應用

結(jié)核病最常見的死亡原因是并發(fā)HIV感染。因為種種原因無法獲得患者痰標本或者痰標本檢測陰性，導致結(jié)核病得不到有效及時的診斷。對于這類脆弱群體，開發(fā)新的、快速的、不基于痰液的診斷方案來檢測結(jié)核病顯得尤為重要。目前，腦脊液和胸腔積液LAM檢測也處于研究中，但很少在結(jié)核性腦膜炎患者的腦脊液中或胸腔積液中發(fā)現(xiàn)LAM[38]。由于痰液的黏度和干擾基質(zhì)的影響，痰液LAM檢測的效果也不是很理想[39]，且一些口腔微生物如念珠菌和多種放線菌細胞壁表面分子與LAM存在交叉反應，可能導致痰液LAM檢測的特異度較低[40]。

(一) 尿液LAM檢測

LAM是通過腎臟過濾的，可以從尿液中檢測到[41]，尿液是一種無菌且容易獲得的體液，即使是痰液缺乏的患者也可以進行檢測，且LAM是一種具有熱穩(wěn)定性的抗原，即使在煮沸的尿液中，也可以通過敏感的免疫學技術(shù)檢測到LAM[42]。

有研究表明，尿液LAM檢測可能會提高活動性結(jié)核病診斷的準確性，特別適用于并發(fā)HIV感染和低CD4+T淋巴細胞計數(shù)的重癥患者，尿液LAM檢測的敏感度與CD4+T淋巴細胞計數(shù)可能呈負相關(guān)。對于CD4+T淋巴細胞計數(shù)小于50個/mm3的患者，尿液LAM檢測的敏感度可達56%～85%，特異度達88%，這可能是因為晚期免疫缺陷患者高分枝桿菌負荷和結(jié)核分枝桿菌全身傳播導致尿液中高水平的LAM[40, 43-44]。還有研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1TAT蛋白可以改變?nèi)俗慵毎募毎羌芎湍I素分布，直接增加腎小球通透性，這也可能是HIV陽性結(jié)核病患者尿液中LAM水平高的原因[45]。

尿液LAM測試是一種很便捷的檢測方法，該測試可以直接在患者的床旁進行，并且只需要20 min。然而，HIV陰性的結(jié)核病患者尿液中的LAM濃度非常低，目前的檢測對這類結(jié)核病患者的診斷仍不夠敏感[46-48]。LAM具有抗原性，HIV陰性患者機體免疫功能正常，可引起強烈的體液免疫反應，此時LAM主要以循環(huán)免疫復合物的形式存在于循環(huán)中，不會輕易穿過腎小球基底膜，這可能是導致HIV陰性的結(jié)核病患者尿液中的LAM濃度低的原因之一。尿液中的LAM是否與抗體結(jié)合也很重要，當免疫功能正常時，機體會針對LAM產(chǎn)生相應抗體，進而形成免疫復合物，使LAM由于空間位阻難以進行免疫測定[45]。Flores等[49]研究指出，酶消化法更有利于顯示LAM結(jié)構(gòu)的末端，這有助于識別最佳表位以激活強大的免疫反應，從而獲得更好的單克隆抗體，提高LAM診斷試驗的敏感度和特異度。

(二)血液LAM檢測的應用

幾類體液中，外周血LAM檢測可能成為尿液LAM的替代檢查，但較尿液LAM，其敏感度更低。Jakhar等[50]研究表明，血液中LAM與宿主脂蛋白如高密度脂蛋白(high-density lipoproteins，HDL)有關(guān)，所以將LAM從宿主脂蛋白中分離可能有助于血液LAM的檢測。但由于LAM-蛋白相互作用對其檢測的干擾，以及檢測的低敏感度，使血液LAM檢測在結(jié)核病中的應用受到阻礙。

三、LAM的檢測方法

(一)結(jié)核分枝桿菌LAM ELISA

2005年在坦桑尼亞首次進行了商業(yè)化結(jié)核分枝桿菌LAM ELISA試驗，基于這項研究，標準化和商業(yè)化的LAM檢測方法不斷開發(fā)，如TB-LAM(Clearview)ELISA檢測試劑盒、Determine TB-LAM(Alere)檢測試劑盒及一種新型的快速側(cè)流檢測方法——Fujifilm SILVAMP TB LAM(SILVAMP-LAM)[51]。Determine TB-LAM(Alere)在價格上具有很大的優(yōu)勢，比核酸擴增檢測低3～4倍，但敏感度較差[52]。在此基礎(chǔ)上研制的SILVAMP-LAM是一種結(jié)合高親和力單克隆抗LAM抗體的橫向流動試驗，其敏感度有一定的提升，但也不是很理想，敏感度更高的LAM檢測方法仍在繼續(xù)開發(fā)。CD4+T淋巴細胞計數(shù)會影響尿液LAM檢測的敏感度，血液中LAM-HDL或LAM-蛋白質(zhì)復合物的存在對血液LAM檢測存在干擾。此外，LAM本身的兩親性性質(zhì)，會使其黏附在ELISA塑料板孔和其他表面，降低分析的可靠性、敏感度和重現(xiàn)性[53]。

盡管尿液LAM檢測的敏感度和特異度仍有待提高，基于ELISA的診斷方法的發(fā)展已為第一代LAM測試打開了大門[49]。然而，分析樣本的基質(zhì)效應、免疫抑制患者的低敏感度等技術(shù)局限還未得到突破，分枝桿菌負荷和LAM濃度之間的定量相關(guān)性也未得到進一步的研究，如果能克服這些技術(shù)局限和證實這種定量相關(guān)性，LAM檢測可在結(jié)核病治療監(jiān)測和早期識別結(jié)核病復發(fā)中發(fā)揮更大作用。

(二)脂蛋白捕獲和膜插入

在臨床樣本中，LAM的表位常被宿主脂蛋白隔離，必須將LAM從這種構(gòu)象中釋放或分離才能方便檢測[53]。Jakhar 等[50]開發(fā)了脂蛋白捕獲和膜插入兩種檢測水樣中兩親性物質(zhì)的方法，這兩種方法都可以直接測定血清中的LAM，并且獨立于宿主因素(膜插入)的檢測方式比依賴于宿主因素(脂蛋白捕獲)的檢測方式更敏感。此外，他們也證明了使用波導平臺比傳統(tǒng)的基于塑料孔板的ELISA提高至少10倍的敏感度。這兩種方法為提高LAM-ELISA試劑盒的檢測性能提供了新的方向。

(三)ManLAM核酸適配體免疫組化

基于LAM的病理檢查在結(jié)核病確診中也起著重要作用。核酸適配體是一種單鏈寡核苷酸，可以折疊成特定的結(jié)構(gòu)，與小的化學物質(zhì)、糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或細胞等目標分子結(jié)合，它類似于抗體，具有易修飾、特異度高、親和力強等優(yōu)點[54]。Zhou等[55]使用基于ManLAM核酸適配體的免疫組化檢測結(jié)核病患者、肺外結(jié)核患者及非結(jié)核病對照患者病變組織標本中的ManLAM，他們發(fā)現(xiàn)ManLAM核酸適配體免疫組化對肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷具有較高的敏感度(86.38%)和特異度(92.86%)。這種方法診斷性能與IGRA和GeneXpert MTB/RIF相當，且樣品制備簡單、成本低，可直接測量病變組織中的結(jié)核分枝桿菌抗原，不依賴于宿主的免疫狀態(tài)，對免疫缺陷或嬰兒的結(jié)核病診斷更具有優(yōu)勢[56]。

總 結(jié)

結(jié)核病被認為是全球最嚴重的傳染性疾病，其傳染性強，死亡率高。LAM是結(jié)核分枝桿菌細胞壁的重要組成成分，具有重要而獨特的免疫調(diào)節(jié)特性，可能作為活動性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染診斷的標志物。尿液LAM測試是一種有用的床旁測試，可以很容易地與痰涂片和培養(yǎng)測試結(jié)合起來，作為輔助診斷結(jié)核分枝桿菌與HIV雙重感染的有效方法。當患者尿液LAM檢測結(jié)果呈陽性時，應積極進行抗結(jié)核治療并持續(xù)監(jiān)測整體情況?；贚AM的檢測方法仍在不斷開發(fā)，如脂蛋白捕獲和膜插入及核酸適配體免疫組化，為LAM作為診斷結(jié)核病的生物標志物奠定了基礎(chǔ)，但要使其更好地應用于臨床診療，還有很長一段路要走。