楊曉麗 何兵 王皎磊 張?jiān)圃?張春霞 李月 李建軍 史文韜

2019年全國共報(bào)告職業(yè)性塵肺病患者15 898例[1]。塵肺病是致殘性疾病,主要是肺組織廣泛纖維化引起心肺功能損傷,致使患者勞動(dòng)能力下降[2]。煤工塵肺是指煤礦工人長期吸入生產(chǎn)性粉塵所引起的塵肺的總稱。在煤礦開采過程中由于工種不同，工人可分別接觸煤塵、煤矽塵和矽塵，從而引起肺的彌漫性纖維化，統(tǒng)稱為煤工塵肺[3]。煤工塵肺是嚴(yán)重危害煤礦職工身體健康的主要職業(yè)病，煤工塵肺患者是肺結(jié)核的好發(fā)人群，肺結(jié)核是塵肺患者的主要直接死因之一[4]。目前，煤工塵肺并發(fā)肺結(jié)核的主要診斷依據(jù)是胸部X線攝片(簡(jiǎn)稱“胸片”)和痰液結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的檢查。由于矽肺患者胸片檢查結(jié)果的多變性和不確定性，使痰液MTB檢查結(jié)果成為矽肺患MTB感染和結(jié)核病復(fù)發(fā)確診的直接病原學(xué)證據(jù)[5]。

肺結(jié)核的診斷主要依靠痰涂片抗酸染色和痰分枝桿菌培養(yǎng)。我國常規(guī)應(yīng)用的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法，如涂片顯微鏡檢查，敏感度較低；痰培養(yǎng)具有較高的敏感度，但耗時(shí)較長?，F(xiàn)有的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)均不能滿足臨床早期、快速診治的需要，可能延誤診斷和治療，開發(fā)敏感度高、耗時(shí)短、成本低廉并易普及的檢測(cè)方法成為大勢(shì)所趨[6]。GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“Xpert”)檢測(cè)技術(shù)是一種操作簡(jiǎn)便、快速、敏感度和特異度高、對(duì)操作人員安全的重要方法[7]。同時(shí)，Xpert技術(shù)能同時(shí)檢測(cè)利福平耐藥情況，并能提高低含菌量標(biāo)本的檢出率，可更好地輔助臨床醫(yī)生及早診療和及時(shí)預(yù)防隔離[8]。本研究采用Xpert檢測(cè)技術(shù)對(duì)煤工塵肺并發(fā)肺結(jié)核患者的晨痰進(jìn)行檢測(cè)，觀察其在煤工塵肺并發(fā)肺結(jié)核患者中的診斷價(jià)值。

資料和方法

一、 研究對(duì)象

選取2019年1月至2020年12月在北京京煤集團(tuán)總醫(yī)院診治的64例煤工塵肺并發(fā)肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象；均為男性，年齡39～87歲，中位年齡66歲。塵肺病診斷依據(jù)《GBZ 70—2015 中華人民共和國國家職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[9]進(jìn)行，結(jié)核病診斷依據(jù)《WS 196—2017 結(jié)核病分類》[10]和 《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[11]進(jìn)行診斷。留取患者晨起合格痰標(biāo)本3～5 ml，各取1 ml分別加入到3個(gè)前處理管中，分別進(jìn)行痰抗酸桿菌涂片、痰分枝桿菌培養(yǎng)、Xpert檢測(cè)。

二、 試驗(yàn)材料

分枝桿菌涂片鏡檢采用萋尼染色方法，購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，培養(yǎng)采用BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“MGIT 960培養(yǎng)”)系統(tǒng)，由美國BD公司生產(chǎn)。Xpert檢測(cè)系統(tǒng)及其配套試劑盒(Cartrige 反應(yīng)盒)購自美國Cepheid公司，產(chǎn)品技術(shù)編號(hào)為國械注進(jìn)20173406215。

三、 Xpert檢測(cè)方法

取1 ml痰標(biāo)本放入前處理管中，加入相當(dāng)于痰標(biāo)本體積兩倍的SR痰標(biāo)本處理液中，將前處理管置于漩渦振蕩器上振蕩20 s左右，直到無可見塊狀痰標(biāo)本為止，靜置15 min，用試劑盒中的無菌吸管取2 ml液化后的樣品由加樣孔緩慢轉(zhuǎn)移到Cartridge反應(yīng)試劑盒中，然后將Cartridge反應(yīng)試劑盒放入檢測(cè)模塊中，儀器進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)，2 h后儀器自動(dòng)判讀出結(jié)果、含菌量及是否對(duì)利福平耐藥。如果6條探針中，除質(zhì)控探針外有≥2條探針發(fā)出熒光，則提示MTB感染，根據(jù)Ct值的不同可對(duì)MTB濃度進(jìn)行高(Ct值<16)、中(16≤Ct值<22)、低(22≤Ct值≤28)判定。5條探針如果未全部發(fā)出熒光，則說明對(duì)利福平耐藥。

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

建立Excel數(shù)據(jù)庫收集數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間陽性檢出率的比較及不同檢測(cè)方法間的敏感度、特異度、一致率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究的各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)定義如下：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%,特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%,陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%,陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。各方法間的一致性檢測(cè)采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≥0.75，說明兩種方法診斷一致性較好；0.4≤Kappa值<0.75說明兩種方法診斷一致性中等；Kappa值<0.4，說明兩種方法診斷一致性較差。同時(shí)，分別繪制兩種技術(shù)結(jié)核病診斷的受試者工作特征曲線(ROC曲線)，根據(jù)ROC曲線下的面積(AUC值)評(píng)價(jià)診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。

結(jié) 果

一、以MGIT 960培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，比較Xpert檢測(cè)與痰涂片法對(duì)MTB的檢測(cè)效能

MGIT 960培養(yǎng)陽性患者18例，涂片陽性患者6例，Xpert檢測(cè)陽性患者28例。以MGIT 960培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，涂片法與Xpert檢測(cè)對(duì)病例組患者M(jìn)TB檢測(cè)的敏感度分別為27.8%(5/18)、88.9%(16/18)；特異度分別為97.8%(45/46)、73.9%(34/46)；陽性預(yù)測(cè)值分別為5/6、57.1%(16/28)，陰性預(yù)測(cè)值分別為77.6%(45/58)、94.4%(34/36)。兩種方法的一致率均為78.1%。Xpert檢測(cè)敏感度高于涂片法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.829，P=0.000)；涂片法特異度高于Xpert檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.839，P=0.001)。Xpert檢測(cè)的失敗率和污染率均為0。

二、痰涂片與Xpert檢測(cè)結(jié)果一致性分析

Xpert檢測(cè)與MGIT 960培養(yǎng)一致性為78.1%(50/64)(Kappa=0.537)，兩者具有中等一致性。痰涂片與MGIT960培養(yǎng)一致性為78.1%(50/64)(Kappa=0.321)。對(duì)于涂陰煤工塵肺并發(fā)肺結(jié)核患者，Xpert檢測(cè)的陽性率為36.2%(21/58)；MGIT 960培養(yǎng)陰性的46例患者中，Xpert檢測(cè)MTB陽性率為21.7%(10/46)，涂片陽性率為2.2%(1/46)，兩種檢測(cè)方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.364，P=0.004)。Xpert 檢測(cè)與痰涂片檢測(cè)的AUC值分別為0.836、0.628(圖1)。

圖1 Xpert MTB/RIF檢測(cè)與痰涂片檢測(cè)煤工塵肺并發(fā)肺結(jié)核的ROC曲線

三、兩種方法檢測(cè)煤工塵肺并發(fā)肺結(jié)核患者對(duì)利福平耐藥情況

64例患者的痰標(biāo)本均進(jìn)行MGIT 960培養(yǎng)，共得到18例分枝桿菌陽性菌株，經(jīng)菌種初步鑒定，均為MTB。MGIT 960藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)與Xpert檢測(cè)分別有4例和7例耐利福平。以MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為100.0%，特異度為78.6%，陽性預(yù)測(cè)值為57.1%，陰性預(yù)測(cè)值為100.0%，一致性為83.3%，兩種方法檢測(cè)利福平耐藥的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.889，P=0.027)。兩種檢測(cè)方法的Kappa值為0.620，兩者具有中等一致性(表1)。

表1 以MGIT 960藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)Xpert對(duì)兩組患者利福平耐藥性的檢測(cè)效能

討 論

Mirsadraee等[12]對(duì)伊朗和韓國1980—2011年間報(bào)道的6280例煤工塵肺患者進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)22.5%并發(fā)肺結(jié)核，明顯高于非塵肺對(duì)照組。矽肺并發(fā)肺結(jié)核患者痰中變異的L型MTB、抗酸染色呈陰性及肺部嚴(yán)重纖維化、支氣管扭曲變形致痰液引流不暢均可造成結(jié)核病的漏檢及誤診[13]。

Xpert檢測(cè)是基于定量PCR的分子生物學(xué)檢測(cè)，能夠從已經(jīng)滅活的MTB中擴(kuò)增出MTB核酸并報(bào)告診斷，可出現(xiàn)痰培養(yǎng)陰性而Xpert檢出陽性的情況。本研究中，液體培養(yǎng)陰性的46例患者中，Xpert檢測(cè)MTB陽性患者10例(21.7%)，涂片陽性1例(2.2%)，兩種檢測(cè)方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Xpert能檢測(cè)出MTB含量較低的標(biāo)本，可提高低含菌量標(biāo)本的陽性率。對(duì)于涂陰煤工塵肺并發(fā)肺結(jié)核患者，Xpert檢測(cè)的陽性率為36.2%，這些患者無法通過痰涂片檢測(cè)MTB進(jìn)行診斷，容易漏診。因此，Xpert檢測(cè)可以明確診斷，早診斷、早治療，避免誤診誤治。

本研究中Xpert檢測(cè)在煤工塵肺并發(fā)肺結(jié)核患者中的敏感度(88.9%)、陰性預(yù)測(cè)值(94.4%)均較高，而特異度、陽性預(yù)測(cè)值相對(duì)較低。Xpert檢測(cè)因其簡(jiǎn)便、快速、敏感度高且能同時(shí)檢測(cè)利福平耐藥菌株等優(yōu)點(diǎn)，在臨床結(jié)核病篩查診斷中具有較好的應(yīng)用價(jià)值[14]。Steingart等[15]報(bào)道，Xpert檢測(cè)總敏感度為89%，對(duì)涂片陽性樣本，敏感度達(dá)98%，對(duì)涂片鏡檢陰性的標(biāo)本敏感度為67%，總特異度為99%。Pimkina等[16]報(bào)道，Xpert 檢測(cè)對(duì)培養(yǎng)陽性患者敏感度為93.7%，特異度為91.7%，對(duì)于涂片陰性樣本的敏感度為82.5%。本研究Xpert 檢測(cè)敏感度與上述研究基本相似，但特異度均低于上述結(jié)果。周銀發(fā)等[17]研究以痰固體培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)， Xpert檢測(cè)MTB的敏感度與陰性預(yù)測(cè)值均較高，但特異度與陽性預(yù)測(cè)值均較低，兩種檢測(cè)方法的結(jié)果呈中度一致。也有文獻(xiàn)顯示，以傳統(tǒng)固體痰培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，在涂陰疑似肺結(jié)核患者中Xpert檢測(cè)MTB的敏感度為55.2%～90.2%[18]。本文結(jié)果與這兩項(xiàng)研究相符。分析原因可能為：(1)標(biāo)本菌量太低，超出Xpert檢測(cè)的下限；(2)可能存在PCR抑制因子；(3)樣本量較少；(4)考慮與實(shí)驗(yàn)方法、研究對(duì)象自身局限性有關(guān)，矽肺患者由于全身免疫力和防御機(jī)能的下降，加之二氧化硅對(duì)MTB活力和毒性的增強(qiáng)作用，同時(shí)，肺組織的缺血和缺氧等因素不利于MTB的生長，其肺內(nèi)長期生存的MTB可產(chǎn)生適應(yīng)性改變，在形態(tài)、毒力、抗原性及藥物敏感性方面發(fā)生變異[19]。Xpert檢測(cè)結(jié)果一致性及ROC曲線下面積均優(yōu)于痰涂片。相較于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室診斷方法，Xpert對(duì)煤工塵肺并發(fā)肺結(jié)核診斷的準(zhǔn)確性高，且極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間。

以MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，煤工塵肺并發(fā)肺結(jié)核患者Xpert檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為100.0%，特異度為78.6%。張治國等[20]研究顯示，以傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為 89.1%，特異度為 96.3%。Boehme等[21]研究顯示Xpert檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為 97.6%，特異度為 98.1%，特異度均高于本研究。在煤工塵肺并發(fā)肺結(jié)核患者中，兩種方法檢測(cè)利福平耐藥差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)然，關(guān)于Xpert檢測(cè)的假耐藥性問題也不容忽視，目前已升級(jí)至G4版本，以提高耐藥檢測(cè)的特異度。但最近研究報(bào)道，Xpert檢測(cè)的假耐藥患者，給予一線抗結(jié)核藥物后可成功治愈，提示目前仍未解決假耐藥性問題[22-24]。

本研究中，在痰涂片、液體培養(yǎng)檢測(cè)為陰性的患者中仍有患者核酸檢測(cè)陽性，且對(duì)這些患者進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)均為陽性，充分印證了在煤工塵肺并發(fā)肺結(jié)核患者的輔助診斷中核酸檢測(cè)的高敏感度。有30%～60%的肺結(jié)核患者無細(xì)菌學(xué)依據(jù)[25]，導(dǎo)致涂陰肺結(jié)核患者誤診誤治，其病亡率接近20%[26]。結(jié)核病的早期診斷及其耐藥性的檢測(cè)，對(duì)于很好地控制耐藥結(jié)核病的傳播具有十分重要的意義[20]。由于部分非結(jié)核分枝桿菌中也存在rpoB基因或類似基因，故理論上Xpert檢測(cè)有假陽性的可能，但有報(bào)道顯示[15]，非結(jié)核分枝桿菌造成假陽性的比例僅為0.6%。WHO進(jìn)一步更新了推薦，認(rèn)為Xpert檢測(cè)可作為涂陰肺結(jié)核患者進(jìn)一步明確結(jié)核病診斷的后續(xù)檢測(cè)方法[27]。

綜上所述，Xpert檢測(cè)是一種速度快、敏感度高的MTB感染的輔助診斷方法，在煤工塵肺并發(fā)肺結(jié)核患者中具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，Xpert檢測(cè)可作為臨床快速檢測(cè)MTB及其利福平耐藥性的篩選試驗(yàn)。在一些結(jié)核病基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)，一定程度能降低漏診率，使患者盡早進(jìn)行有效抗結(jié)核治療，減少煤工塵肺與結(jié)核病對(duì)機(jī)體造成的協(xié)同損害作用，從而減少患者痛苦，降低患者病亡率。