李 霞，張國柱，劉志飛，單 楊，李培駿，李 靜,

（1.桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林 541004；2.湖南農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長沙 410125）

2型糖尿病（Type 2 Diabetic Mice, T2DM）是最常見的糖尿病形式，是一種以胰島素抵抗和胰島β細胞功能受損為特征的復(fù)雜代謝紊亂[1]。組織對胰島素的反應(yīng)能力下降的現(xiàn)象稱為胰島素抵抗[2]，胰腺β細胞功能受損會影響胰島素分泌。2型糖尿病的特點是糖脂代謝的慢性代謝失調(diào)，與腎功能衰竭、心血管疾病和失明密切相關(guān)[3]。目前用于治療T2DM的藥物主要有阿卡波糖、雙胍類、噻唑烷二酮類和磺脲類等，存在副作用強、高成本和具有毒性等缺陷[4]。因此，開發(fā)制備簡單、安全可靠的降血糖藥物具有重要意義。

海洋藻類是具有生物活性的天然物質(zhì)的重要來源[5]。許多研究表明，海洋藻類多糖能降低血糖和治療糖尿病并發(fā)癥[6?11]。滸苔是可食用海藻，其主要活性成分有滸苔多糖、蛋白質(zhì)多肽、脂肪酸等[12]。已有一些研究發(fā)現(xiàn)滸苔具有降血糖活性。Yan等[1]發(fā)現(xiàn)分子量小于3 kDa的滸苔醇提物，通過激活I(lǐng)RS1/PI3K/AKT和抑制JNK1/2胰島素通路發(fā)揮降血糖作用。Yuan等[13]發(fā)現(xiàn)酶解滸苔多糖可以緩解胰腺損傷，改善糖尿病。孫世紅等[14]發(fā)現(xiàn)堿提滸苔多糖能顯著降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖濃度。劉乾陽等[15]通過檢測糖尿病小鼠血糖、糖化白蛋白和糖耐量并觀察胰腺組織病理切片初步研究了滸苔多糖的降血糖活性。這些研究表明滸苔提取物具有一定降血糖活性，但具體降血糖機制仍有待補充和擴展。本研究從腸滸苔中提取多糖，通過檢測腸滸苔多糖對小鼠體重、采食、空腹血糖、血清及肝臟相關(guān)指標的影響，綜合評價腸滸苔多糖的降血糖活性，為腸滸苔多糖的降血糖機制的進一步研究奠定基礎(chǔ)、為相關(guān)藥物開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

雄性肥胖型糖尿病db/db小鼠和正常db/m小鼠（5周齡） 購買于江蘇集萃藥康生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2019-0009。正常小鼠體重21±2 g，肥胖型糖尿病小鼠體重31±3 g；小鼠飼料為實驗鼠維持飼料（Co60輻照） 飼料營養(yǎng)組成見表1，江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司；腸滸苔 采于中國浙江杭州灣，由寧波大學朱文榮教授鑒定；二乙基氨基乙基纖維素（DEAE） 上海恒信化學試劑有限公司；乙醇、葡萄糖、鹽酸、硫酸、苯酚、氨基磺酸、D-半乳糖醛酸、二甲基亞砜、間羥基聯(lián)苯、考馬斯亮藍G-250、3,5-二硝基水楊酸、碳酸鈉、檸檬酸鈉、氯化鈉 均為國產(chǎn)分析純試劑；胰島素 生物試劑，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；胰島素試劑盒、游離脂肪酸試劑盒、甘油三酯試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒、過氧化氫酶試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司。

表1 飼料營養(yǎng)組成Table 1 Nutrient composition of feed

ALPHA1-2 LD冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；LRH-250-Z恒溫培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；YK722PC紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器有限公司；安準血糖儀 三諾生物傳感股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 腸滸苔多糖提取、分離 參考劉玉鳳等[16]使用的方法提取腸滸苔多糖，藥材按料液比1:20（w/v，g/mL）加入80%乙醇加熱回流提取3次（每次2 h），干燥后按料液比1:16（w/v，g/mL）加入蒸餾水，浸泡過夜，100 ℃下提取2次（每次3 h），收集水提液，蒸發(fā)濃縮，75%乙醇醇沉，離心（4000 r/min，15 min）取沉淀冷凍干燥得水提腸滸苔粗多糖（polysaccharides fromEnteromorpha intestinalis, EIP）。

利用DEAE纖維素制備柱（8 cm×40 cm）分離EIP。預(yù)實驗確定各參數(shù)后，配制20 mg/mL EIP溶液200 mL，于?20 ℃冷凍24 h，4 ℃融化12 h，離心（4000 r/min，10 min）取上清液備用。打開纖維素層析柱下端出水口待液面與纖維素相平后緩慢加入EIP溶液，上樣后依次使用蒸餾水、0.7 mol/L NaCl溶液、0.1 mol/L NaOH溶液洗脫，流速為15 mL/min。蒸餾水洗脫液經(jīng)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥得到腸滸苔中性多糖（EIP-1），NaCl和NaOH洗脫液經(jīng)蒸發(fā)濃縮、透析、冷凍干燥分別得到酸性多糖（EIP-2）、堿洗多糖（EIP-3）。

1.2.2 腸滸苔多糖理化性質(zhì)測定 采用苯酚-硫酸法[17]測定總糖含量，間羥基聯(lián)苯法[18]測定糖醛酸含量，考馬斯亮藍法[19]測定蛋白質(zhì)含量，二硝基水楊酸法[20]測定還原糖含量。

1.2.3 動物實驗

1.2.3.1 動物分組與飼養(yǎng) db/m小鼠（血糖正常小鼠）6只，作為正常對照組（NC）。db/db小鼠（2型糖尿病T2DM肥胖小鼠）30只，隨機分為5組：模型對照組（MC，無菌生理鹽水）、陽性對照組（PC，50 mg/kg/day二甲雙胍）、EIP-2低劑量組（L，50 mg/kg/day）、中劑量組（M，100 mg/kg/day）、高劑量組（H，200 mg/kg/day）。小鼠在實驗環(huán)境（溫度25±1 ℃，濕度50%±10%，12 h光/暗循環(huán)）適應(yīng)一周后，每日灌胃干預(yù)一次，持續(xù)5周，期間自由飲水和進食。

1.2.3.2 日采食和體重檢測 每日給藥前，稱量小鼠體重、稱量飼料質(zhì)量并記錄。

1.2.3.3 空腹血糖檢測（Fasting blood glucose, FBG）給藥后第0、7、14、28 d，測量小鼠的空腹血糖。檢測前禁食12 h，使用血糖儀測量血糖濃度并記錄。

1.2.3.4 葡萄糖耐受實驗（Glucose tolerance test, GTT）

給藥第14 d，檢測各組小鼠葡萄糖耐受量，檢測前禁食12 h，尾部取血，使用血糖儀測量血糖濃度。檢測小鼠的空腹血糖30 min后，腹腔注射葡萄糖溶液（1.5 g/kg），分別在第15、30、60、120 min檢測小鼠血糖并記錄。

1.2.3.5 胰島素耐受實驗（Insulin tolerance test, ITT）給藥第22 d，檢測各組小鼠胰島素耐受量，檢測前禁食12 h，尾部取血，使用血糖儀測量血糖濃度。測量空腹血糖30 min后，腹腔注射胰島素溶液（1.5 U/kg），分別在第15、30、60、120 min檢測小鼠血糖并記錄。

1.2.3.6 血清生化因子檢測 給藥35 d后，小鼠眼眶取血，4 ℃下2500 r/min離心10 min取上清液，根據(jù)試劑盒說明檢測游離脂肪酸（nonestesterified fatty acid, NEFA）、甘油三酯（triglyceride, TG）、血清胰島素（insulin, INS）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST）水平。

1.2.3.7 肝臟生化因子檢測 取血后，小鼠脫頸處死，解剖并收集肝臟、腎臟、胰腺和結(jié)腸，液氮冷凍保存。肝臟在預(yù)冷生理鹽水（1:9，w/v）中研磨制成肝勻漿，4 ℃下2500 r/min離心10 min，收集上清液，參考各試劑盒說明書分別檢測NEFA、AST、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、過氧化氫酶（catalase,CAT）水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 9.0軟件作圖，SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結(jié)果 x±s表示，使用單因子方差（One-Way ANOVA，LSD）分析顯著性差異，P＜0.05代表差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸滸苔多糖的理化性質(zhì)

腸滸苔多糖的理化性質(zhì)測定結(jié)果見表2。EIP經(jīng)DEAE纖維素柱層析分離獲得EIP-1、EIP-2、EIP-3。EIP、EIP-1、EIP-2、EIP-3總糖含量分別為33.30%、19.77%、39.89%、35.53%，EIP、EIP-1、EIP-2、EIP-3糖醛酸含量分別為14.51%、6.49%、17.58%、8.92%。許多研究結(jié)果表明，多糖的降血糖活性可能與糖醛酸的含量有關(guān)。EIP-2的總糖和糖醛酸含量最高，分別為39.89%和17.58%。因此，使用腸滸苔多糖EIP-2進行小鼠實驗，研究腸滸苔多糖的降血糖活性。

表2 腸滸苔多糖的理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of polysaccharide from Enteromorpha intestinalis

2.2 體重和采食

腸滸苔多糖對小鼠體重的影響見表3。實驗5周后，正常小鼠體重增加了4.64 g，模型組和陽性對照組小鼠體重均增加了10 g左右，EIP-2低、中、高劑量組體重分別增加了17.52、15.68、18.37 g。腸滸苔多糖對小鼠采食量的影響見圖1。正常小鼠日采食量始終保持在3 g/day左右，T2DM小鼠給藥前采食量為8～9 g/day隨時間逐漸降低且組間差異不大。模型組、陽性對照組、EIP-2低、中、高劑量組第5周采食量較給藥前分別降低了39.4%、39.5%、36.3%、39.4%、39.8%。

圖1 EIP-2對T2DM小鼠采食量的影響Fig.1 Effects of EIP-2 on the feed intake of T2DM mice

2型糖尿病的治療通常伴隨著體重增加，以及食物和水的消耗減少[21]。腸滸苔多糖對T2DM小鼠采食影響不大，但是可以使小鼠體重增加，高劑量組體重較給藥前增長了56.5%，與模型組相比差異極顯著（P＜0.001）。

2.3 空腹血糖

EIP-2對T2DM小鼠空腹血糖的影響如表4所示。正常組小鼠血糖濃度維持在3.5～4.5 mmol/L范圍內(nèi)，T2DM小鼠初始空腹血糖在10～11 mmol/L范圍內(nèi)。模型組小鼠血糖濃度前2周略有降低，后2周開始升高，第4周血糖濃度達到了22.4 mmol/L。二甲雙胍和EIP-2組小鼠的血糖濃度整體呈下降趨勢，第4周二甲雙胍、EIP-2低、中、高劑量組血糖濃度較給藥前分別降低了6.0%、17.8%、23.8%、24.0%?？崭寡鞘翘悄虿【徑獾囊豁椫匾笜薣22]，EIP-2可以極顯著降低空腹血糖（P＜0.001）。

表4 EIP-2對T2DM小鼠空腹血糖的影響Table 4 Effects of EIP-2 on FBG in T2DM mice

2.4 葡萄糖耐受實驗結(jié)果

腸滸苔多糖對糖尿病小鼠葡萄糖耐受量的影響見圖2。

圖2 EIP-2對T2DM小鼠葡萄糖耐受量的影響Fig.2 Effects of EIP-2 on glucose tolerance in T2DM mice

小鼠注射葡萄糖后，血糖的變化可反映機體對餐后血糖的處理能力。注射葡萄糖溶液后，正常小鼠經(jīng)過60 min后血糖濃度降至正常水平，二甲雙胍和EIP-2劑量組小鼠的血糖濃度經(jīng)過120 min恢復(fù)至初始水平，但模型組小鼠的血糖濃度仍處于高水平。相比于二甲雙胍和EIP-2中、高劑量組，EIP-2低劑量組小鼠的血糖濃度恢復(fù)速度相對較快。糖耐受量是檢測人體對急性高血糖的反應(yīng)能力的一項重要指標[14]。通過葡萄糖耐受性的強弱判斷胰島β細胞對血液中血糖調(diào)節(jié)的能力[23]。EIP-2可以改善T2DM小鼠的葡萄糖耐受性，增強機體的血糖調(diào)節(jié)能力。

2.5 胰島素耐受實驗結(jié)果

腸滸苔多糖對糖尿病小鼠胰島素耐受的影響見圖3。注射胰島素后，模型組小鼠前30 min血糖濃度升高后90 min略有降低。正常組小鼠注射胰島素15 min后血糖濃度開始下降，120 min后回升至正常水平。低劑量組小鼠的血糖濃度15min后升高至峰值，120 min后降至初始水平。中劑量組與陽性對照組30 min后血糖濃度降至最低，后90 min血糖濃度略有回升。高劑量組小鼠血糖濃度變化較為平滑，前60 min下降，后60 min回升至正常水平。胰島素功能障礙是T2DM的顯著特征[24]。長期胰島素抵抗可干擾糖脂代謝，進一步導(dǎo)致脂質(zhì)和葡萄糖水平異常升高[25]。注射胰島素后小鼠的血糖濃度變化可以反映胰島素抵抗性。高劑量EIP-2治療后的T2DM小鼠胰島素抵抗性得到了明顯改善。

圖3 EIP-2對糖尿病小鼠胰島素耐受量的影響Fig.3 Effects of EIP-2 on insulin tolerance in T2DM mice

2.6 血清生化因子

給藥35 d后，小鼠血清NEFA、TG、INS和AST水平見表5。模型組小鼠的血清NEFA水平比正常組高24.7%；二甲雙胍、EIP-2低、中、高劑量組NEFA水平比模型組分別低7.7%、1.5%、6.2%、13.8%。血清NEFA升高是肝臟和外周細胞胰島素抵抗引起的糖尿病血脂異常的一個特征指標[4]，NEFA水平升高在一定程度上可以解釋為高胰島素抵抗，EIP-2高劑量組顯著降低了小鼠血清NEFA水平（P＜0.01）、緩解了T2DM小鼠胰島素抵抗性。模型組小鼠的血清TG水平是正常組的2.9倍，二甲雙胍、低、中、高劑量EIP-2組血清TG水平比模型組分別低49.8%、39.6%、61.0%、63.5%。模型組小鼠的血清INS水平是正常組的4.2倍；二甲雙胍、EIP-2低、中、高劑量組血清INS水平比模型組分別低56.2%、17.9%、21.2%、34.7%。T2DM小鼠胰島素敏感性降低或作用缺陷會使機體產(chǎn)生過多的胰島素[26]，胰島素水平的顯著降低反映了EIP-2對小鼠胰島素敏感性降低或作用缺陷的良好療效。T2DM是一種長期而復(fù)雜的疾病，通常伴有血脂異常和肝腎功能不全，血清中AST、ALT和TBA水平被認為是肝細胞損傷和肝功能的指標[21]。模型組小鼠的血清AST含量是正常對照組NC的1.7倍；二甲雙胍、EIP-2低、中、高劑量組血清AST水平比模型組分別低34.2%、22.1%、31.0%、39.6%。EIP-2與血清指標水平呈量效關(guān)系，高劑量EIP-2對INS水平降低作用比二甲雙胍弱，而對血清NEFA、TG和AST水平的降低作用優(yōu)于二甲雙胍。

表5 EIP-2對小鼠血清指標的影響Table 5 Effects of EIP-2 on serum indexes in mice

2.7 肝臟生化因子

給藥35 d后，小鼠肝臟NEFA、AST、ALT、SOD和CAT水平見表6。二甲雙胍、EIP-2低、中、高劑量組肝臟NEFA水平比模型組分別低16.9%、4.3%、9.2%、17.4%。EIP-2低劑量組和模型組AST水平相近，二甲雙胍、EIP-2中、高劑量組AST水平比模型組分別低20.2%、16.8%、17.0%。二甲雙胍、EIP-2高劑量組ALT水平比模型組分別低12.5%、20.5%、22.1%。EIP-2對肝臟NEFA、AST、ALT水平的降低作用隨劑量增加而增強。肝臟NEFA、AST和ALT水平的降低說明EIP-2改善了小鼠的脂質(zhì)代謝、緩解了T2DM引起的肝損傷。

表6 EIP-2對小鼠肝臟指標的影響Table 6 Effects of EIP-2 on liver indicators in mice

模型組小鼠的SOD、CAT水平比正常組分別低16.6%、14.5%。腸滸苔多糖對肝臟SOD水平影響較小，二甲雙胍、EIP-2高劑量組SOD水平比模型組分別高9.8%、4.6%。二甲雙胍、EIP-2低劑量組CAT水平比模型組分別高31.8%、41.5%，但EIP-2中、高劑量組CAT水平均比模型組低，說明低濃度EIP-2對肝臟過氧化氫酶水平升高有促進作用，濃度過高會抑制過氧化氫酶產(chǎn)生。EIP-2劑量與SOD酶活性正相關(guān)而與CAT酶活性負相關(guān)，這可能是由于過氧化物酶在清除H2O2過程中發(fā)揮了主要作用，過氧化氫酶競爭底物的能力減弱活性也減弱[27?28]。研究表明，糖尿病的持續(xù)高血糖可能導(dǎo)致體內(nèi)的氧化應(yīng)激[25]。氧化損傷和糖代謝紊亂會形成惡性循環(huán)，加重糖尿病癥狀[29]。SOD和CAT是哺乳動物的主要抗氧化酶，是抗氧化防御系統(tǒng)抵御體內(nèi)自由基的第一道防線[3]。中、高劑量EIP-2可以提高小鼠肝臟SOD水平、低劑量EIP-2可以提高CAT水平，T2DM引起的氧化損傷得到改善。

3 結(jié)論

實驗結(jié)果顯示腸滸苔多糖分離組分EIP-2的總糖（39.89%）和糖醛酸（17.58%）含量最高。以不同劑量的EIP-2對T2DM小鼠進行干預(yù)，通過檢測降血糖指標綜合評價腸滸苔多糖的降血糖活性。EIP-2給藥后T2DM小鼠空腹血糖降低、葡萄糖和胰島素耐受量的改善及血清INS水平的降低說明滸苔多糖有利于調(diào)節(jié)血糖平衡。有關(guān)研究表明糖代謝的改善可能與滸苔多糖調(diào)節(jié)肝臟和脂肪組織中INSR、GCK、APN和GLUT-4基因mRNA水平的能力有關(guān)[11]。血清AST和肝臟AST、ALT水平的降低說明滸苔多糖可以緩解肝損傷。給藥后血清NEFA、TG和肝臟NEFA水平降低說明滸苔多糖有利于改善脂質(zhì)代謝，肝臟抗氧化酶（SOD、CAT）活性升高說明滸苔多糖具有抗氧化活性、可減輕T2DM引起的氧化損傷，Tang等[30]發(fā)現(xiàn)滸苔多糖通過發(fā)揮抗氧化作用、減輕氧化損傷可能是改善糖尿病一種有效途徑。綜上所述，腸滸苔多糖可改善糖脂代謝、緩解肝損傷，其降血糖機制可能與其抗氧化作用有關(guān)，通過緩解組織氧化損傷從而減輕胰島素抵抗。