劉曉飛，侯 艷，馬京求，程傳興，張 娜，盧淑雯

（1黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站 哈爾濱 150086 2哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院 哈爾濱 150028）

糖蛋白是由低聚糖鏈和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合蛋白，低聚糖鏈通常通過糖基化作用與蛋白質(zhì)連接[1]。糖蛋白的主要生物學(xué)功能是細胞或分子的識別作用，參與生物體中各種生物學(xué)反應(yīng)，糖蛋白在生物體中普遍存在，具有多種生物學(xué)功能，如抗氧化，抗腫瘤[2]，降膽固醇[3]等。目前在臨床上使用的重組蛋白藥物大多是糖蛋白。隨著糖蛋白生物學(xué)研究的不斷深入，糖蛋白的潛在功能逐漸被發(fā)現(xiàn)，從蛋白質(zhì)折疊、細胞信號、受體結(jié)合、免疫識別到調(diào)節(jié)生物半衰期，都可以追蹤到糖蛋白[4]。

發(fā)芽糙米是將糙米置于合適的溫度、濕度下萌發(fā)，直至具有一定的萌發(fā)長度，含有芽和胚乳。糙米的發(fā)芽過程實際上是提高其營養(yǎng)價值的過程[5]。糙米在萌發(fā)過程中，不僅現(xiàn)有的營養(yǎng)物質(zhì)含量有所增加[6]，而且萌發(fā)引起的內(nèi)部化學(xué)變化也產(chǎn)生了新的營養(yǎng)物質(zhì)，如γ-氨基丁酸等[7]。研究表明，糙米中糖蛋白含量在一定程度上會隨著萌發(fā)時間的延長而增加，且抗氧化性也與萌發(fā)時間呈正相關(guān)[8]。目前，關(guān)于發(fā)芽糙米糖蛋白（Germinated brown rice glycoprotein,GBRG）的研究較少，人們對其物理、化學(xué)性質(zhì)及其潛在的結(jié)構(gòu)和生物功能知之甚少，GBRG 尚未得到充分利用。

本試驗中采取超聲輔助提取GBRG，用DEAE-Cellulose 52 陰離子柱交換層析法和Sephadex G-200 凝膠層析法進行分離純化。采用高效液相色譜、紅外光譜、圓二色性、1H-NMR 譜等方法進行結(jié)構(gòu)分析，評估GBRG 中主要成分的抗氧化作用。本研究旨在拓寬天然糖蛋白來源，為水稻增產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)鏈延伸做一些研究和探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發(fā)芽糙米粗糖蛋白樣品制備 供試粳稻為“龍粳”，用龔谷機去除稻子外殼得到糙米，按照文獻[9]的方法將糙米發(fā)芽，并制備發(fā)芽糙米粗糖蛋白樣品，凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 DEAE-Cellulose 52，日本Pharmacia集團；乙醇（100%）、氫氧化鈉、氯化鐵、過氧化氫溶液、濃硫酸、乙酸、硫酸銅、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、鹽酸、苯酚（分析純），南京生物化學(xué)試劑研究中心；單糖標(biāo)準(zhǔn)品、糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-Aldrich（中國上海）。

1.2 主要儀器

L-8900 型全自動氨基酸分析儀，美國Sigma公司；Nicolet 380 型傅里葉變換紅外光譜儀，日本Thermo Electron Corp；MOS-450/AF-CD 圓二色光譜儀，英國Bio-Logic 集團；Ulti Mate 2500 高效液相色譜儀，德國Thermo 企業(yè)。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽糙米粗糖蛋白的分離純化

1.3.1.1 DEAE-Cellulose 52 陰離子交換柱層析純化 對GBRG 粗品進行層析純化處理[10]，蒸餾水溶解糖蛋白粗品質(zhì)量濃度為30 mg/mL，取10 mL 上樣于溶脹好的DEAE-Cellulose 52，蒸餾水洗柱，流速3 mL/min，5 mL/管，接收10 管后，依次以0.1，0.2，0.3 mol/L NaCl 溶液進行洗脫，各收集10 管，利用考馬斯亮藍法、苯酚-硫酸法測定A490、A595，繪制梯度洗脫曲線，收集各峰，除鹽后凍干備用。

1.3.1.2 Sephadex G200 瓊脂糖凝膠柱層析 將獲得的各峰糖蛋白分別溶于蒸餾水，取2 mL 樣品上柱，0.1 mol/L NaCl 溶液洗脫，流速1 mL/min，2 mL/管，收集洗脫液，通過苯酚-硫酸法追蹤含糖管，確定梯度洗脫曲線，洗脫峰透析、濃縮后凍干備用。

1.3.2 GBRG 各峰的結(jié)構(gòu)表征

1.3.2.1 GBRG 各峰分子質(zhì)量的測定 高效凝膠滲透色譜法測定GBRG 的分子質(zhì)量，采用UniSilTM5-120 C18色譜柱，SFDRI-2000 型示差折光檢測器，進樣量20 μL，流動相為磷酸鹽緩沖溶液，流速0.5 mL/min。以6 種分子質(zhì)量（6，10，40，100，500，1000 ku）的葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品，獲得保留時間和分子質(zhì)量lgM 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算GBRG 各峰的相對分子質(zhì)量。

1.3.2.2 GBRG 各峰的單糖組分分析 采用高效液相色譜法（HPLC）分析各峰的單糖組分[11]。單糖的參照標(biāo)品為半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖。取2 mg 樣品，添加2 mL 三氟乙酸，密封，110 ℃水解7 h，得到水解后單糖混合物。加入少量蒸餾水溶解，將樣品的pH 值調(diào)至中性，蒸餾水定容到1 mL，備用。將上述幾種單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合配制成2 mmol/L 的單糖標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，純化各峰經(jīng)2 mol/L H2SO4在100 ℃水解8 h，水解產(chǎn)物經(jīng)BaCO3中和后檢測。流動相為乙腈∶磷酸緩沖液=8∶2（體積比），流速1 mL/min，進樣量為20 mL。

1.3.2.3 GBRG 各峰氨基酸組分分析 取樣品0.1 g，精確稱重置入真空充氮密閉管中，添加5 mL 6 mol/L 鹽酸，110 ℃水解24 h。取50 mL 水解液干燥為1 mL，0.02 mol/L 鹽酸溶解，用氨基酸自動分析儀檢測。色譜條件：氨基酸PAC-10 柱（3.8 mm×75 mm），流動相：雙蒸餾水0.25 mol/L NaOH 和1.0 mol/L NAC，以17 個氨基酸為標(biāo)準(zhǔn)。在同一色譜條件下，根據(jù)保留時間計算樣品內(nèi)各氨基酸的含量[12]。

1.3.2.4 GBRG 各峰紅外光譜分析 將1 mg GBRG 各峰樣品分別與100 mg KBr 混合，研磨10 min 后壓片，由Nicolet380 型傅里葉變換紅外光譜儀在500～4 000 cm-1波長區(qū)域進行掃描[13]。

1.3.2.5 GBRG 各峰糖肽鍵特性分析 采用β-消除法分析GBRG 各峰糖肽鍵特性。將2 mg 純化糖蛋白溶于1 mL 水中，加入1 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，45 ℃水浴2 h。以1 mL 蒸餾水為空白對照，于190～350 nm 波長范圍內(nèi)紫外掃描，通過比較β-消除反應(yīng)前、后的掃描結(jié)果變化確定糖肽鍵的類型。

1.3.2.6 GBRG 各峰的核磁結(jié)構(gòu)分析 將GBRG各峰樣品20 mg 溶于0.5 mL D2O 中。1H-NMR 譜在400 MHz、296.9 K 條件下由Bruker-400 NMR核磁分析儀測定[14]，數(shù)據(jù)處理使用MestReNova5.3.1 軟件。

1.3.2.7 GBRG 各峰圓二色譜分析 將GBRG 各峰溶解于pH 7.0，10 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液中，制備1 mg/mL 的樣品溶液。掃描溫度25 ℃，波長范圍190～270 nm，掃描步長1.0 nm，速度5 nm/min，重復(fù)3 次。取得相關(guān)數(shù)據(jù)后通過CD Tool 軟件進行圖譜分析，得到α 螺旋、β 折疊、β 轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲的含量[15]。

1.3.3 GBRG 各峰抗氧化性能分析

1.3.3.1 GBRG 各峰DPPH 自由基的清除能力分析 參考文獻[16]將0.5 mL 質(zhì)量濃度為4.00 mg/mL 的GBRG 各峰和2.5 mL 0.1 mmol/L 的DPPH溶液充分混合，無水乙醇為空白組，抗壞血酸維生素C 為對照組，于517 nm 波長處檢測，計算公式如下。

式中，E1——DPPH 的清除率（%）；A0——空白組吸光度；A1——待測樣品吸光度。

1.3.3.2 GBRG 各峰羥自由基的清除能力分析參考文獻[17]將0.1 mL 質(zhì)量濃度為4.00 mg/mL 的GBRG 各峰樣品和1 mL 濃度為0.75 mmol/L 鄰二氮菲無水乙醇溶液混合，添加2 mL 0.15 mol/L 的磷酸鹽緩沖液，充分混合再加入1 mL 0.75 mmol/L 硫酸亞鐵溶液，隨后加1 mL 5 mmol/L H2O2溶液，使其體積分數(shù)為0.01%。37 ℃水浴1 h，于536 nm 波長處檢測，雙蒸水為空白組，抗壞血酸維生素C 為對照組。計算公式如下。

式中，E2——羥自由基的清除率（%）；B1——樣品反應(yīng)后的吸光度；B2——蒸餾水代替樣品；B3——樣品和蒸餾水代替H2O2的吸光度。

1.3.3.3 GBRG 各峰超氧陰離子自由基的清除能力分析 參考文獻[18]將0.1 mL 4.00 mg/mL 的待測糖蛋白和2.8 mL 0.1 mol/L 的Tris 緩沖液充分混勻。在25 ℃條件下水浴10 min，加入3 mmol/L焦性沒食子酸溶液0.1 mL，并且每30 s 于325 nm波長處測1 次吸光度值，持續(xù)5 min，記錄數(shù)據(jù)，并計算其回歸方程，空白為蒸餾水，對照為抗壞血酸維生素C。計算公式如下。

式中，E3——超氧陰離子自由基的清除率（%）；Va——焦性沒食子酸氧化速率斜率；Vb——蒸餾水氧化速率斜率。

1.3.3.4 GBRG 各峰總還原能力分析 參考文獻[19]在2 mL 4.00 mg/mL 的不同GBRG 中，依次加2 mL 1%鐵氰化鉀溶液和2 mL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液。50 ℃水浴20 min，滴加2 mL 10%三氯乙酸溶液，混合均勻后，3 000 r/min 離心5 min，取2 mL 上清液；在上清液中添加0.4 mL 0.1%三氯化鐵溶液及2 mL 蒸餾水，50 ℃水浴10 min，當(dāng)溶液變色時，于700 nm 波長處檢測吸光度值，將加入雙蒸水組作為空白組，抗壞血酸維生素C 組為對照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽糙米粗糖蛋白的分離純化結(jié)果

2.1.1 DEAE-Cellulose 52 陰離子交換柱層析純化結(jié)果 DEAE-Cellulose 52 填料對糖蛋白層析純化過柱洗脫曲線見圖1。

圖1 DEAE-Cellulose 52 洗脫曲線Fig.1 DEAE-Cellulose 52 elution curve

糖蛋白粗品所帶電荷性質(zhì)不同，經(jīng)DEAECellulose 52 分離純化后，獲得蒸餾水洗脫峰1個，命名為WEG，NaCl 溶液洗脫峰2 個，分別命名為SEG-1 和SEG-2。3 個峰于595 nm 和490 nm波長處都有吸收值，是典型的糖蛋白洗脫峰。

2.1.2 Sephadex G200 瓊脂糖凝膠柱層析 Sephadex G-200 凝膠洗脫曲線，如圖2所示。

圖2 Sephadex G-200 洗脫曲線Fig.2 Sephadex G-200 elution curve

WEG、SEG-1、SEG-2 經(jīng)Sephadex G-200 純化后，無新峰出現(xiàn)，這3 個組分在585 nm 和490 nm 波長處均有吸收峰，且變化趨勢保持一致，表明WEG、SEG-1 和SEG-2 是糖蛋白。

2.2 發(fā)芽糙米純化糖蛋白的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.2.1 WEG、SEG-1 和SEG-2 分子質(zhì)量的測定結(jié)果 采用高效凝膠滲透色譜測定WEG、SEG-1 和SEG-2 的分子質(zhì)量，WEG 的分子質(zhì)量約為9.96 ku；SEG-1 的分子質(zhì)量約為10.6 ku；SEG-2 的分子質(zhì)量約為18.9 ku。

2.2.2 WEG、SEG-1 和SEG-2 單糖組分分析結(jié)果WEG、SEG-1 和SEG-2 高效液相色譜結(jié)果見圖3和表1。

圖3 單糖標(biāo)品和3 種GBRG 液相色譜圖Fig.3 Monosaccharide standard and liquid chromatography of three kinds of GBRG

表1 GBRG 單糖組成分析Table 1 Analysis of glycoprotein monosaccharide composition in GBRG

由圖3和表1可知，水洗糖蛋白WEG 由半乳糖醛酸、阿拉伯糖和葡萄糖組成，其摩爾比為2.4∶2.8∶3.9；SEG-1 由阿拉伯糖和葡萄糖組成，摩爾比為3.6∶1.7；SEG-2 由阿拉伯糖與葡萄糖組成，摩爾比為1.3∶1.1。

2.2.3 WEG、SEG-1 和SEG-2 氨基酸組分分析結(jié)果 發(fā)芽糙米純化糖蛋白WEG、SEG-1 和SEG-2氨基酸組分分析如表2所示。

表2 GBRG 中氨基酸組分及占比Table 2 Amino acid component and ratio of the GBRG

如表2所示，3 種GBRG 經(jīng)氨基酸分析儀檢測，其氨基酸總量分別為29.66%，29.64%，28.51%。3 種糖蛋白中氨基酸占比最高是谷氨酸，占比分別為3.12%，3.57%，3.43%；最少的是組氨酸，占比分別為0.69%，0.60%，0.58%。

2.2.4 WEG、SEG-1 和SEG-2 紅外光譜分析結(jié)果 3 種發(fā)芽糙米純化糖蛋白WEG、SEG-1、SEG-2 紅外光譜如圖4所示，糖蛋白的紅外光譜分析結(jié)果如表3所示。

圖4 3 種GBRG 的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of three kinds of GBRG

表3 糖蛋白的紅外光譜分析結(jié)果Table 3 Results of FTIR analysis of glycoproteins

由圖4可知，3 種純化糖蛋白在3 400，2 900，1 640，1 400 cm-1和1 000～1 075 cm-1周圍均存在吸收峰，對此，它們均屬于糖蛋白、多糖等特征峰。其中，O-H 伸縮振動在3 650～3 200 cm-1左右有強吸收峰，因為分子中-OH 之間具有H 鍵，能夠讓吸收峰加寬[20]，其強值約在3 429 cm-1附近，表明分子內(nèi)含有O-H（3 300～3 600 cm-1） 鍵或-NH2/NH/-NH3的N-H（3 500～3 100 cm-1）鍵伸縮振動，同時具備分子間或分子內(nèi)的H 鍵。在3 000～2 800 cm-1附近屬于飽和烴基（-CH2或-CH3）的C-H 伸縮振動峰。在1 640 cm-1附近屬于C=O（羧基或酰胺羰基）伸縮振動與N-H 變角振動峰。1 540 cm-1附近屬于CONH 基團C=O 鍵伸縮振動峰，也可以稱作肽鍵的特征峰。在1 020 cm-1附近有吸收峰，表明存在C-O 和C-H 的伸縮振動，在670 cm-1附近為環(huán)狀扭曲振動峰。WEG 和SEG-2 在1 420 cm-1附近有吸收峰，為亞甲基面內(nèi)彎曲振動。WEG在1 384 cm-1處的吸收峰，為CH3對稱彎曲振動；在1 140 cm-1處的吸收峰是C-O-C 伸縮振動。在1 000～1 075 cm-1存在吸收峰，表明3 種糖蛋白分子均含有吡喃環(huán)。

2.2.5 WEG、SEG-1 和SEG-2 糖肽鍵特性分析結(jié)果 糖蛋白峰WEG、SEG-1、SEG-2 經(jīng)堿處理前后的紫外掃描結(jié)果如圖5所示。

圖5 β-消除前、后3 種GBRG 的紫外掃描圖譜Fig.5 β-UV scanning in three kinds of GBRG before and after elimination

通常使用紫外分光度法在280 nm 處檢測糖蛋白，以確定樣液中是否存在蛋白質(zhì)、多肽和核酸[21]。WEG、SEG-1、SEG-2 含有蛋白質(zhì)組分，不含核酸。糖蛋白中糖肽鍵的常見類型是-O-型和-N-型。-O-銜接一般是通過糖與一些羥基氨基酸（如賴氨酸等）銜接。在稀堿狀態(tài)影響下，賴氨酸中的糖鏈會分解，轉(zhuǎn)變?yōu)棣?氨基丙烯酸、α-氨基丁酸，其峰值均在240 nm 波長處形成。所以，利用對比堿處理前、后該波長處的樣品吸光值，能夠證明其內(nèi)含有-O-糖肽鍵。圖5給出了WEG、SEG-1、SEG-2 堿處理前、后的紫外掃描圖像。堿處理前（虛線） 在240 nm 波長處的吸光度值分別為1.047，1.6175，1.8452。經(jīng)β-消除反應(yīng)后（實線），其波長240nm 處的吸光度分別提高到2.4858，2.8775，2.4682，表明WEG、SEG-1、SEG-2 均含有-O-糖肽鍵。

2.2.6 WEG、SEG-1 和SEG-2 糖苷鍵構(gòu)型核磁分析結(jié)果 發(fā)芽糙米純化糖蛋白WEG、SEG-1、SEG-2 組分的1H-NMR 譜如圖6所示。

圖6 3 種GBRG 組分1H-NMR 譜圖Fig.6 1H-NMR spectra of glycoprotein components in three kinds of GBRG

從圖6中可以看出，用1H-NMR 分析了GBRG 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。發(fā)芽糙米中糖蛋白的化學(xué)位移范圍小于5 ppm1H-NMR，其中4.0～5.5 ppm 是糖苷鍵的主要質(zhì)子信號區(qū)。然而，由于質(zhì)子信號之間的重疊和干擾，1H-NMR 譜的分析并不是很清楚和容易。因此，第一碳的特征信號應(yīng)在4.8～5.5 ppm 范圍內(nèi)進行分析和判斷[22]。4.70 ppm 附近的譜峰為溶劑D2O 中氘質(zhì)子信號1H-NMR 的化學(xué)位移為2.0 ppm，表明-O-糖肽鍵的存在。在3.65 ppm的信號是β-L-阿拉伯糖。在3.89 ppm 是C（O）NH信號。質(zhì)子信號對應(yīng)于不同的糖殘基。δ 5.03 和δ 4.94 分別對應(yīng)于α-（1.4）半乳糖醛酸和β-（1.4）葡萄糖[23]。

2.2.7 WEG、SEG-1 和SEG-2 圓二色譜分析結(jié)果發(fā)芽糙米純化糖蛋白WEG、SEG-1、SEG-2 圓二色譜分析如圖7所示。

圖7 3 種糖蛋白圓二色譜圖Fig.7 Three kinds of glycoprotein circular dichroism

利用圓二色光譜儀對活性分子的光譜圖進行分析，是分析大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一個最精簡、有效的方法。特別是在分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及外在條件對其構(gòu)象造成干擾等方面是很普遍的，波長范圍不一樣的CD 譜能夠說明其結(jié)構(gòu)信息的差異性，波長在190～260 nm 附近能夠得到肽鏈的結(jié)構(gòu)特征：α-螺旋結(jié)構(gòu)的3 個特征吸收峰，在190，208，222 nm 附近分別是正峰、負峰、負峰，β-折疊結(jié)構(gòu)也包括3 個特征吸收峰，在217～218 nm 范圍、195 nm 附近分別是負峰、正峰。在198 nm 處無規(guī)則卷曲有負峰，在220 nm 處有正峰。3 種糖蛋白通過圓二色譜儀進行測定，其圖譜如圖7所示，利用CD Tool、CD SSTR 軟件進行分析，確定其結(jié)構(gòu)特征，WEG-1 結(jié)構(gòu)中α-螺旋占34.1%、β-折疊占12.3%、β-轉(zhuǎn)角占24.2%、無規(guī)卷曲占33%。SEG-1為α-螺旋占43%、β-折疊占29%、β-轉(zhuǎn)角占6%、無規(guī)卷曲占22%。SEG-2 為α-螺旋占44%、β-折疊占28%、β-轉(zhuǎn)角占7%、無規(guī)卷曲占21%。

2.3 GBRG 的抗氧化作用研究

2.3.1 不同GBRG DPPH 自由基的清除能力分析結(jié)果 WEG、SEG-1 和SEG-2 對DPPH 自由基的清除能力結(jié)果如圖8所示。

DPPH 是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，一貫被用作抗氧化活性的研究試劑[24]，當(dāng)溶液中有具備清除自由基能力的物質(zhì)存在時，DPPH 會與該物質(zhì)提供的質(zhì)子結(jié)合，使溶液的顏色由紫變黃。從圖8可以看出，3 種4.00 mg/mL 的GBRG 均對DPPH有一定的清除能力，清除率分別為22.75%，15.67%，10.22%，其中WEG 對DPPH 的清除率最高。分析原因是糖蛋白的抗氧化活性與糖蛋白分子質(zhì)量分布有關(guān)，較小的分子質(zhì)量其抗氧化活性相對較高。雖然WEG、SEG-1 和SEG-2 對DPPH均有較好的清除效果，但總體低于抗壞血酸。

圖8 3 種糖蛋白對DPPH 清除作用Fig.8 The scavenging effect of three glycoproteins on DPPH

2.3.2 不同GBRG 羥自由基的清除能力分析結(jié)果WEG、SEG-1 和SEG-2 對羥自由基的清除能力結(jié)果如圖9所示。

Fe2+與H2O2反應(yīng)生成Fe3+，加入糖蛋白溶液后，有色化合物消失。由圖9可知發(fā)芽糙米糖蛋白體外抗氧化活性結(jié)果，當(dāng)質(zhì)量濃度是4.00 mg/mL時，WEG、SEG-1、SEG-2 對羥自由基均有較強的清除能力。清除率分別為94.4%，95.2%，98.7%。與抗壞血酸的清除率相差不大，對羥自由基抗氧化能力有積極作用，可以用做羥自由基清除劑。

圖9 3 種糖蛋白對羥基自由基的清除作用Fig.9 The scavenging effect of three glycoproteins on hydroxyl radical

2.3.3 不同GBRG 超氧陰離子自由基的清除能力分析結(jié)果 WEG、SEG-1 和SEG-2 對超氧陰離子自由基的清除能力結(jié)果如圖10所示。

超氧陰離子在堿性環(huán)境中被鄰苯三酚氧化，生成有色產(chǎn)物[25]。加入糖蛋白溶液后，自由基被清除，同時有色物質(zhì)的生成被中斷。由圖10可知，WEG、SEG-1 和SEG-2 對超氧陰離子均有一定的清除效果，清除率各為24.63%，35.66%，12.04%，SEG-1 對超氧陰離子清除能力雖最強，但弱于抗壞血酸。

圖10 3 種糖蛋白對超氧陰離子的清除能力Fig.10 The scavenging ability of three glycoproteins to superoxide anion

2.3.4 不同GBRG 總還原能力分析結(jié)果 WEG、SEG-1 和SEG-2 總還原能力結(jié)果如圖11所示。

圖11 3 種糖蛋白的總還原能力Fig.11 Total reduction ability of three glycoproteins

GBRG 作為氧化劑為鐵氰酸鉀提供電子，把Fe3+還原成Fe2+，吸光度值可以判斷還原能力。物質(zhì)的還原能力能側(cè)面體現(xiàn)出其潛在的抗氧化能力，一般作為電子供體的物質(zhì)通常具有一定的還原能力，可以將脂質(zhì)過氧化過程中的中間氧化產(chǎn)物還原，具有初級或次級抗氧化性能[26]。由圖11可知，WEG、SEG-1 和SEG-2 均具有一定的還原能力，清除率分別為0.208%，0.342%，0.501%，且SEG-2 還原能力與抗壞血酸相差不大，說明3 種GBRG 均具有較強的抗氧化性能。

機體在正常代謝過程中會產(chǎn)生一定的自由基，會對身體器官造成十分不利的影響。因此，探尋高效無害的天然抗氧化劑是目前開發(fā)研究的重要課題。許多研究表明糖蛋白擁有較強的抗氧化性能。徐永健等[27]從大海馬體內(nèi)提取純化得到糖蛋白，并測定其抗氧化性能，結(jié)果顯示：5.0 mg/mL的糖蛋白對DPPH 自由基的清除率高達95.2%；4.0 mg/mL 的糖蛋白對羥自由基的清除率為28.6%；2 mg/mL 糖蛋白對超氧陰離子的清除率為19.14%；質(zhì)量濃度在1 mg/mL 以上還原力基本一致。董渭雪等[28]在大鯢黏液凍干粉內(nèi)提取得到糖蛋白，并測定其抗氧化能力，結(jié)果表明：該糖蛋白對DPPH 自由基清除率為36.20%，羥自由基清除率為24.80%，超氧陰離子自由基清除率為20.40%。本試驗提取的3 種發(fā)芽糙米糖蛋白WEG、SEG-1和SEG-2 均具有抗氧化作用，證明發(fā)芽糙米可作為“藥食同源”的保健功能性食品，有極大的發(fā)展前景和開發(fā)潛力。

3 結(jié)論

糙米發(fā)芽后，營養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)含量顯著增加，糙米的保健價值顯著提高。具有巨大的市場潛力和商業(yè)價值。在本研究中，獲得了具有抗氧化作用的GBRG。首先，從發(fā)芽糙米中分離純化出3種分子質(zhì)量的糖蛋白：WEG、SEG-1 和SEG-2。分析了3 種GBRG 的單糖組成、氨基酸組成、糖苷鍵結(jié)構(gòu)和二級糖鏈結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，對3 種GBRG進行抗氧化性能試驗：對DPPH 自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除能力及總還原能力進行測定及研究。結(jié)果表明：3 種GBRG 均具有較強的抗氧化作用，為進一步探索和評價天然抗氧化保健食品提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。拓寬了水稻食品潛在的應(yīng)用領(lǐng)域，增加了其附加值，對促進我國水稻產(chǎn)業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。