聶芳，李可，王媛，許穎

(1.成都醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科； 2.成都醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院；3.成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500)

肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)指肝臟組織器官由于多種原因?qū)е氯毖斐杉?xì)胞組織器官的損傷，而缺血之后進(jìn)行再灌注，細(xì)胞組織器官相關(guān)功能仍無(wú)法恢復(fù)，并且使其損傷更為嚴(yán)重，這也是肝臟切除和肝移植手術(shù)、低血容性休克、毒性肝損傷、靜脈阻塞性病變等疾病過(guò)程中最常見(jiàn)的病理生理現(xiàn)象[1]。HIRI 可導(dǎo)致10%早期肝臟移植后器官衰竭、45%器官損傷和急慢性組織排異現(xiàn)象[2-3]。然而，目前仍然缺乏對(duì)于HIRI的有效監(jiān)測(cè)指標(biāo)和防治措施。TTC36是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的具有3個(gè)連續(xù)C端四肽重復(fù)(tetratricopeptide repeat，TPR)結(jié)構(gòu)域的蛋白分子， Liu等[4]報(bào)道通過(guò) TPR 結(jié)構(gòu)域與熱休克蛋白70(HSP70)的C端相互作用發(fā)揮分子伴侶的功能，Jiang等[5]報(bào)道TTC36作為抑癌基因參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的凋亡，Xie等[6]報(bào)道TTC36參與4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvic acid dioxygenase，HPD)的降解導(dǎo)致酪氨酸血癥和神經(jīng)損傷。本實(shí)驗(yàn)擬研究TTC36在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為進(jìn)一步深入探討TTC36在肝臟缺血再灌注損傷中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常肝細(xì)胞LO2由華西科技園腫瘤分子靶向治療研究室夏洪偉博士惠贈(zèng)；TTC36鼠源性單克隆抗體由深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科劉運(yùn)洪博士惠贈(zèng)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶、胎牛血清、高糖Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(Gibco公司)；乳酸脫氫酶 (LDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT )、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST )試劑(四川邁克生物科技股份有限公司，配套儀器為日立全自動(dòng)生化分析儀7060)；無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；ST8R型高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾公司)；HR40-IIA2型生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司)；GENbag厭氧產(chǎn)氣袋(梅里埃公司)；SM-150A超聲細(xì)胞破碎儀(南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司)；ST-360型酶標(biāo)儀(上海科華生物公司)；Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)Bio-Rad 公司)；UVP凝膠成像分析儀(美國(guó)UVP公司)。

1.2 方法

1.2.1 LO2肝細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、保種 肝臟LO2細(xì)胞復(fù)蘇，將其轉(zhuǎn)入10 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿中，再用含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下無(wú)菌培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后，棄去培養(yǎng)基，以PBS洗滌細(xì)胞，傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) (1)細(xì)胞分組分盤(pán)：棄去培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液，用 PBS 洗兩次后棄去，加入 0.25%胰酶置于培養(yǎng)箱內(nèi)消化2 min；在離心機(jī)中 800 g離心力，離心5 min。后棄去上清液；離心沉淀中加入完全培養(yǎng)液，并以無(wú)菌吸管輕輕反復(fù)吹打使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液均分加入培養(yǎng)皿，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組N組(正常條件下培養(yǎng))；A3組、A6組、A9組(在缺氧環(huán)境下分別培養(yǎng)3、6、9 h之后進(jìn)行復(fù)氧2 h)；R0組、R2組、R4組、R6組(在最適缺氧時(shí)間6 h后復(fù)氧0、2、4、6 h)。(2)缺氧復(fù)氧細(xì)胞模型建立：當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基更換為無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組均放入GENbag厭氧產(chǎn)氣袋中(GENbag厭氧產(chǎn)氣袋，型號(hào)：45534)可在1 h左右提供殘余氧濃度低于1%，和CO2濃度大約20%，在脫氧過(guò)程中不產(chǎn)生壓差及溫度變化)，置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別缺氧培養(yǎng)6 h后，棄去厭氧袋，培養(yǎng)基更換為之前含10%FBS的完全培養(yǎng)基，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2、4、6 h后收集細(xì)胞。對(duì)照組在正常條件下培養(yǎng)、換液，無(wú)缺氧復(fù)氧處理。(3)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力：各組細(xì)胞消化后吸取0.1 mL細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色5 min后，取一滴置于高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)，死細(xì)胞著淺藍(lán)色并膨大無(wú)光澤，或細(xì)胞不著色并保持正常形態(tài)，有光澤。細(xì)胞活力(%)=未染色的細(xì)胞數(shù)/觀察到細(xì)胞總數(shù)×100%。(4)細(xì)胞總蛋白的提?。簩?shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在不同缺氧復(fù)氧時(shí)間后，開(kāi)始收集細(xì)胞總蛋白。LO2細(xì)胞吸走細(xì)胞上清液，PBS 緩沖液清洗兩遍細(xì)胞后，加入800 uL蛋白裂解液，超聲波破碎(功率20%或200 V，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30次)，12 000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。

1.2.3 檢測(cè)肝功能損傷酶學(xué)指標(biāo)ALT、AST的含量 收集缺氧復(fù)氧處理前后的細(xì)胞上清液，在7060型日立全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行檢測(cè)，記錄各組數(shù)據(jù)。

1.2.4 檢測(cè)肝損傷標(biāo)志蛋白SOD、GSH、MDA的活性含量 將提取好的各組的細(xì)胞總蛋白參照Solarbio試劑盒說(shuō)明書(shū)經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理后，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)吸光度，并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)上的公式進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算出SOD、GSH和MDA 三種蛋白質(zhì)活性含量。

1.2.5 蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞TTC36蛋白水平 提取好的總蛋白加loading buffer后煮沸10 min變性處理，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯[poly(1,1-difluoroethylene)，PVDF]膜上。封閉后，一抗孵育過(guò)夜，再用二抗體偶聯(lián)物孵育，化學(xué)發(fā)光試劑(electrochemiluminescence，ECL)顯跡，在UVP凝膠成像分析儀中采集圖像并進(jìn)行灰度比值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝缺血再灌注損傷細(xì)胞模型的建立

選取最適宜的缺氧條件：LO2細(xì)胞在Genbag厭氧袋中培養(yǎng)0.5～1 h，厭氧指示條由藍(lán)色逐漸變?yōu)闊o(wú)色，說(shuō)明此時(shí)氧氣濃度<0.1%(有氧環(huán)境下為藍(lán)色，無(wú)氧環(huán)境下為無(wú)色)，說(shuō)明缺氧環(huán)境已建立。缺氧培養(yǎng)3、6、9 h復(fù)氧2 h后，A3、A6、A9組細(xì)胞活力較正常組有顯著性差異(P<0.05)，見(jiàn)圖1。通過(guò)鏡下觀察LO2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷后的形態(tài)學(xué)變化，正常組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，大部分細(xì)胞貼壁擴(kuò)展，呈梭形，細(xì)胞密度高。隨缺氧時(shí)間增加，貼壁細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞間間隙增大，部分細(xì)胞可見(jiàn)明顯的結(jié)構(gòu)破壞，鏡下出現(xiàn)更多的細(xì)胞碎片或脫落漂浮的細(xì)胞，提示LO2細(xì)胞損傷程度隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，細(xì)胞存活率下降，證明厭氧袋/厭氧罐法能夠建立有效的細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型，可以有效地模擬肝缺血再灌注損傷，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取缺氧6 h后分別復(fù)氧0、2、4、6 h收集細(xì)胞及細(xì)胞外液進(jìn)行檢測(cè)分析。

2.2 肝缺血再灌注損傷細(xì)胞模型的驗(yàn)證

2.2.1 構(gòu)建的缺氧復(fù)氧模型LO2細(xì)胞外液中的肝損傷標(biāo)志物ALT、AST含量變化 與正常組比較，R0、R4組ALT、AST活性增高(P<0.05)；與R0組(ALT=10.3±3.2 U/L、AST=15.4±3.1 U/L)比較，R2組ALT(25.4±2.5 U/L)、AST(39.2±3.4 U/L)表達(dá)水平更高(P<0.05)，提示肝細(xì)胞復(fù)氧后比缺氧時(shí)損傷更嚴(yán)重了；隨著復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)，R6組(ALT=10.2±3.6 U/L、AST=18.8±5.0 U/L)逐漸降低恢復(fù)正常(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 缺氧復(fù)氧模型LO2細(xì)胞外液中ALT、AST含量變化

2.2.2 構(gòu)建的缺氧復(fù)氧模型LO2細(xì)胞中MDA、GSH、SOD活性變化 與正常組比較，R0(1.46±0.313 nmol/mg)、R4組(1.49±0.327 nmol/mg)細(xì)胞MDA活性含量較正常組(1.43±0.123 nmol/mg)升高(P<0.05)，而GSH(R0=4.26±1.463 μg/mg、R4=4.22±0.738 μg/mg)和SOD(R0=342±34 U/g、R4=325±63 U/g)活性含量下降(P<0.05)；與R0組比較，R2組MDA(1.52±0.294 nmol/mg)活性含量更高(P<0.05)，GSH(3.92±0.829 μg/mg)和SOD(268±48 U/g)活性含量更低，同樣提示肝細(xì)胞復(fù)氧后比缺氧時(shí)損傷更嚴(yán)重；隨著復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)，R6組(MDA=1.45±0.285 nmol/mg、GSH=4.43±1.137μg/mg、SOD=389±84 U/g)逐漸恢復(fù)正常(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 缺氧復(fù)氧模型LO2細(xì)胞中MDA、GSH、SOD活性變化

2.3 LO2細(xì)胞構(gòu)建的缺氧復(fù)氧模型細(xì)胞中TTC36表達(dá)差異

LO2細(xì)胞缺氧6 h后分別復(fù)氧0 h、2 h、4 h、6 h，提取細(xì)胞蛋白，通過(guò)Western Blot 檢測(cè)TTC36的表達(dá)，結(jié)果顯示正常組、R0組、R2組表達(dá)逐漸降低，R4、R6組表達(dá)又逐漸增高，提示復(fù)氧1 h的細(xì)胞發(fā)生二次損傷，較缺氧未復(fù)氧時(shí)TTC36蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，隨著肝功能恢復(fù)，TTC36蛋白的表達(dá)也恢復(fù)正常。見(jiàn)圖2。

3 討論

我國(guó)的肝臟外科是一個(gè)迄今不到50年的新崛起的領(lǐng)域，其中肝缺血再灌注損傷的理論研究至今僅十幾年[7]?，F(xiàn)階段，雖然HIRI的研究范圍廣，但是我國(guó)對(duì)此的研究較少，迄今對(duì)該損傷診斷的仍無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，主流觀點(diǎn)認(rèn)為肝缺血再灌注損傷的主要檢測(cè)方法是生化和影像學(xué)指標(biāo)。生化方法主要是檢測(cè)傳統(tǒng)的損傷生化標(biāo)志物，包含天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT) 等。另外，還有一些未廣泛運(yùn)用的新型肝損傷生物標(biāo)志物，如蛋白質(zhì)分子、血液生物標(biāo)記、尿液中的生物標(biāo)記和循環(huán)RNA等[8]。這些方法均是對(duì)于肝損傷的大范圍的檢測(cè)和術(shù)后評(píng)估，對(duì)于肝缺血再灌注損傷這一特定的肝臟損傷的特異性和針對(duì)性較低。傳統(tǒng)的損傷標(biāo)志物對(duì)于肝缺血再灌注損傷無(wú)法作出較準(zhǔn)確和快速的反應(yīng)[9]。因此，本研究分析TTC36蛋白在肝缺血再灌注損傷中的表達(dá)差異，從而探索HIRI的新的早期檢測(cè)指標(biāo)。

將細(xì)胞置于無(wú)糖無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中，然后放置在厭氧袋里，在此環(huán)境培養(yǎng)后，細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)；缺氧后培養(yǎng)基由無(wú)糖無(wú)血清更換為正常培養(yǎng)基，再造成復(fù)氧環(huán)境，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力和肝損傷指標(biāo)反映該模型建立成功。LO2細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同缺氧時(shí)間處理，細(xì)胞活力發(fā)生改變。分別缺氧3 h 、6 h、9 h后復(fù)氧2 h，A9組可能由于缺氧時(shí)間過(guò)長(zhǎng)已經(jīng)超出了細(xì)胞的承受范圍，對(duì)細(xì)胞造成了不可逆的損傷，細(xì)胞大量死亡，說(shuō)明在缺氧的環(huán)境下，機(jī)體應(yīng)激能力是有限的；較A9組，A6組在復(fù)氧2h后細(xì)胞死亡數(shù)減少，可能需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能恢復(fù)；A3組損傷輕微，細(xì)胞存活率較A6組高，肝細(xì)胞功能恢復(fù)時(shí)間較短。為研究缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的缺血再灌注損傷，選取損傷適中的缺氧時(shí)間6 h進(jìn)行復(fù)氧實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)檢測(cè)幾種肝損傷標(biāo)志物ALT、AST、MDA、GSH和SOD驗(yàn)證此細(xì)胞模型的有效性。缺氧復(fù)氧2 h的肝細(xì)胞損傷程度要高于缺氧未復(fù)氧時(shí)，表明該模型可以模擬手術(shù)中肝缺血后恢復(fù)血供，肝臟正常生理功能并沒(méi)有因此恢復(fù)，反而造成損傷加重的情況。此方法具有成模快速、結(jié)果穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行合適的選擇。在機(jī)體中的缺氧再灌注損傷情況更為復(fù)雜，涉及到各種激素調(diào)節(jié)，神經(jīng)調(diào)節(jié)等[10]，建立細(xì)胞模型，可控制變量，研究某一特定因素，減少或避免其他因素的干擾，讓實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度、準(zhǔn)確性更高。肝細(xì)胞缺血再灌注損傷模型的建立為缺血再灌注損傷的預(yù)防及治療奠定了一定的臨床基礎(chǔ)。

TTC36蛋白在哺乳動(dòng)物體內(nèi)保守表達(dá)，并且在肝臟中TTC36可作為分子伴侶與多種蛋白協(xié)助發(fā)揮作用[11]。本研究中ALT、AST以及MDA、GSH、SOD等肝損傷指標(biāo)顯示，在缺氧復(fù)氧模擬的細(xì)胞模型中缺氧后細(xì)胞受到一定程度的損傷，但缺氧復(fù)氧后的細(xì)胞較缺氧未復(fù)氧時(shí)損傷嚴(yán)重，但隨著復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常。另外，正常組、R0組、R2組TTC36的表達(dá)逐漸降低，R4、R6組TTC36的表達(dá)又逐漸增高，但缺氧復(fù)氧后的細(xì)胞較缺氧未復(fù)氧時(shí)TTC36蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，隨著肝功能恢復(fù)，TTC36蛋白的表達(dá)也恢復(fù)正常。

綜上所述，TTC36蛋白在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的肝缺血再灌注損傷過(guò)程中表現(xiàn)出明顯差異，其表達(dá)量的變化能夠較好地反映細(xì)胞缺氧性損傷-再灌注損傷-細(xì)胞損傷后修復(fù)這一動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。因此， TTC36的表達(dá)水平可以反映機(jī)體肝缺血再灌注損傷程度的早期判斷和預(yù)后情況，也預(yù)示著TTC36有望成為肝缺血再灌注損傷一個(gè)新的早期監(jiān)測(cè)指標(biāo)和預(yù)后指標(biāo)。