趙子麒，趙雅琪，林昌朋，趙永澤，余宇瀟，孟慶立，曾廣瑩，薛吉全，楊琴?

1西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北旱區(qū)玉米生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，陜西楊凌 712100；2寶雞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，陜西岐山 722499；3鎮(zhèn)坪縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西鎮(zhèn)坪 725600

0 引言

【研究意義】玉米是全世界種植范圍最廣、總產(chǎn)量最高的作物。在全球氣候變化的背景下，由于耕作制度、栽培方式的轉(zhuǎn)變和新品種的推廣，中國玉米病害發(fā)生呈現(xiàn)新的動態(tài)，特別是莖腐病（stalk rot）、穗腐?。╡ar rot）、大斑?。╪orthern leaf blight）、小斑?。╯outhern leaf blight）、灰斑?。╣ray leaf spot）等發(fā)生頻率增加，影響范圍擴大，給玉米產(chǎn)量和品質(zhì)帶來巨大威脅[1-6]。收集和鑒定重要玉米種質(zhì)的綜合抗性，明確種質(zhì)中的優(yōu)良抗病等位基因，對抗病育種意義重大?！厩叭搜芯窟M展】莖腐病當(dāng)前已成為全國性的重大病害，近年來，在中國西北、東北、黃淮海部分地區(qū)重度發(fā)生，高感品種的發(fā)病率達到 40%—100%[2-3]。鐮孢穗腐病在全國不同玉米產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，感病品種的發(fā)病率可高達50%，致病菌在籽粒中產(chǎn)生的毒素直接威脅人畜健康[4]。大斑病在中國東北、華北北部、西北東部、西南山區(qū)等地發(fā)病勢頭嚴(yán)重，一般造成減產(chǎn) 20%[5]。小斑病在溫暖潮濕的氣候條件下發(fā)病嚴(yán)重，感病品種在嚴(yán)重發(fā)生年份減產(chǎn) 20%—30%[3]。灰斑病主要在中國東北、西南地區(qū)發(fā)生，近幾年擴展迅速，嚴(yán)重發(fā)生時產(chǎn)量損失達10%—60%[6]。種植抗病品種是病害防治最經(jīng)濟有效的措施，開展抗病性和抗病基因鑒定是選育抗病品種的前提。國內(nèi)外學(xué)者針對不同玉米病害開展了大量的抗病性鑒定工作，篩選出一系列抗病種質(zhì)[1,3-4,7-18]。然而，大部分研究只針對1種或2種病害進行種質(zhì)資源抗性評價，很少開展多年多點的鑒定，難以解決當(dāng)前多種病害同時混合發(fā)生的問題。利用抗病基因培育抗病品種是更加經(jīng)濟有效的途徑，分子標(biāo)記輔助育種可以大大縮短育種年限，在抗病主基因的導(dǎo)入方面有明顯的優(yōu)勢[19]。目前，針對玉米莖腐病、穗腐病、大斑病、小斑病和灰斑病，已克隆的基因有 5個，包括抗大斑病Htn1（ZmWAK-RLK1）[20]，多抗玉米小斑病、灰斑病qMdr9.02（ZmCCoAOMT2）[21]，抗禾谷鐮孢莖腐病qRfg1（ZmCCT）[22]和qRfg2（ZmAuxRP1）[23]，以及抗炭疽莖腐病Rcg1[24]。利用抗病基因的功能分子標(biāo)記，開展自交系基因型鑒定，結(jié)合抗病性精準(zhǔn)評價，將為抗病育種提供優(yōu)良的抗病性改良靶點。目前，玉米中已報道的抗病位點鑒定主要利用與抗病基因連鎖的分子標(biāo)記，由于玉米自交系之間遺傳變異豐富，位點間重組率高，如果分子標(biāo)記與抗病基因相距較遠(yuǎn)，可能會導(dǎo)致分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與抗病性不符[25-27]。目前還沒有針對這些已知抗病基因開展種質(zhì)資源精準(zhǔn)鑒定的研究?！颈狙芯壳腥朦c】病害是影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，選育綜合抗性優(yōu)良的品種對保障玉米高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)至關(guān)重要。對重要玉米自交系開展多年多點多個病害的綜合鑒定，對已知抗病基因進行準(zhǔn)確鑒定，將為玉米抗病性遺傳改良提供材料基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，然而目前仍然缺乏這方面的系統(tǒng)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究收集陜A群、陜B群30份核心自交系和 18份國內(nèi)外優(yōu)良種質(zhì)，分別于 2019年和2020年在陜西省楊凌區(qū)、岐山縣、三原縣、鎮(zhèn)坪縣鑒定禾谷鐮孢莖腐病、禾谷鐮孢穗腐病、大斑病、小斑病和灰斑病的抗性，分析種質(zhì)對不同病害抗性水平及其相關(guān)性，明確材料的綜合抗性及已知抗病基因數(shù)目，為抗病育種提供材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料和田間試驗設(shè)計

陜A群、陜B群是由西北農(nóng)林科技大學(xué)玉米遺傳育種課題組構(gòu)建的2個雜種優(yōu)勢群，依據(jù)“二群論”理論，以國內(nèi)外優(yōu)良種質(zhì)形成的綜合種為基礎(chǔ)群體，以提高適應(yīng)性為主線，采用兩邊推、兩向分群的育種思路，強化逆境選擇（高密、低氮、干旱），通過多點聯(lián)合持續(xù)改良，育成了一批早熟、耐密、高產(chǎn)、宜機收的自交系。選擇11份陜A群核心玉米自交系：KA064、KA081、KA103、KA105、KA106、KA109、KA115、KA147、KA203、KA225、KA327；19 份陜B群核心自交系：KB019、KB020、KB024、KB025、KB043、KB052、KB062、KB081、KB089、KB102、KB106、KB107、KB109、KB128、KB204、KB207、KB227、KB243、KB588；18份國內(nèi)外重要種質(zhì)：1145、2082、AMD43、B110、B73、CML170、Mo17、NW-H537、PH4CV、PH6WC、PHK42、PHN11、PHT60、X178、昌 7-2、黃早四、沈 137、鄭 58。大斑病、小斑病和灰斑病選取1145為抗病對照，B73為感病對照；莖腐病選取1145為抗病對照，黃早四為感病對照；穗腐病選擇昌7-2為感病對照。

1.2 病原菌及田間接種鑒定方法

1.2.1 供試病原菌 大斑病病原菌為大斑凸臍蠕孢（Exserohilumturcicum），分離自陜西省岐山縣田間采集的大斑病樣；小斑病病原菌為玉蜀黍平臍蠕孢（Bipolarismaydis），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所段燦星副研究員惠贈；灰斑病病原菌為玉米尾孢（Cercosporazeina），分離自陜西省鎮(zhèn)坪縣采集病樣；禾谷鐮孢菌（Fusariumgraminearum）由西北農(nóng)林科技大學(xué)龍書生副研究員惠贈。

1.2.2 病原菌接種方法 采用高粱粒接種法[28]接種小斑病和大斑病。將馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上活化的大斑凸臍蠕孢/玉蜀黍平臍蠕孢切成小塊，接種到含有滅菌高粱粒的錐形瓶中，26℃黑暗條件下靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)期間，定期搖晃錐形瓶，保證菌絲充分生長。待菌絲長滿高粱粒后，將高粱粒接種物倒出，自然晾干備用。在玉米苗期6—8葉期，將制備好的帶菌高粱粒投入植株心葉中，每株接種15—20粒，接種時間選擇在傍晚或陰天進行?；野卟樘镩g自然發(fā)病。

采用田間土埋傷根接種法[29]接種禾谷鐮孢莖腐病。將PDA平板上活化的禾谷鐮孢菌接種于經(jīng)高壓滅菌的玉米粒培養(yǎng)基進行擴繁。26℃黑暗培養(yǎng)10—14 d后，菌絲布滿玉米粒，即可用于田間接種。在玉米抽雄期，距離植株莖基部約5 cm處，向下剖開土壤并切斷毛細(xì)根，將培養(yǎng)好的帶菌玉米70—80粒埋入根系處，接種后覆土并進行澆灌，保證土壤濕潤。

采用花絲通道法和針刺果穗法分別進行2次接種禾谷鐮孢穗腐病[30-31]。將PDA平板上活化的禾谷鐮孢菌切成小塊，接種到液體綠豆培養(yǎng)基中，25℃黑暗條件180 r/min震蕩培養(yǎng)7—10 d，過濾菌絲，收集孢子懸浮液，配置孢子濃度為1×106個/mL的接種液，加入表面活性劑吐溫20，濃度為2 μL·mL-1，混勻待用。在玉米吐絲后7 d進行第1次接種，采用花絲通道法將2 mL孢子懸浮液注射到玉米果穗頂端，在吐絲后14 d進行第2次接種，采用針刺果穗法將2 mL孢子懸浮液注射到玉米果穗中部。

1.2.3 抗病性鑒定方法 小斑病/灰斑病：玉米進入乳熟期開始調(diào)查，重點調(diào)查穗位葉及果穗的上部和下部各1葉，根據(jù)葉片的感病面積進行病情分級，分級方法參考1—9級鑒定標(biāo)準(zhǔn)[32]，其中，1為高抗，9為高感。共調(diào)查3次，每次間隔7—10 d，以3次的結(jié)果對發(fā)病情況進行綜合判斷（表1）。

大斑?。河衩走M入乳熟后期開始調(diào)查，針對感病葉片面積占整株葉片面積的比例進行病情分級，分級方法參考《玉米抗病蟲性鑒定技術(shù)規(guī)范NY/T 1248.1-2006》（表1）。

禾谷鐮孢莖腐?。涸谟衩咨沓墒旌筮M行劈莖調(diào)查，將植株沿莖稈縱向劈開，根據(jù)莖稈內(nèi)壞死組織的長度和壞死程度進行病情分級（圖1和表1）[29]。

表1 玉米大斑病、小斑病、灰斑病、穗腐病及莖腐病病情級別與抗性評價Table 1 Disease rating scale and evaluation of northern leaf blight, southern leaf blight, gray leaf spot, ear rot and stalk rot in maize

禾谷鐮孢穗腐?。涸谟衩咨沓墒旌?，采收接種的玉米果穗，逐穗進行病情分級調(diào)查（表 1）。分級方法參考《玉米抗病蟲性鑒定技術(shù)規(guī)范 NY/T 1248.8-2016》。

2)隨著泵進口壓力的降低，氣泡在葉片表面的分布逐漸增加，并且逐漸由葉片的背面低壓區(qū)向流道內(nèi)擴展；氣泡隨著液流向出口處擴散時，由于壓力的升高又會破滅而對葉片產(chǎn)生侵蝕，嚴(yán)重時會造成泵外特性曲線的下降。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用整行調(diào)查法進行大斑病、小斑病、灰斑病的病情分級，采用sAUDPC（standardized area under disease progress curve）[33]計算最終表型值，計算公式為：

其中，yi為每次調(diào)查的病情分級，ti+1—ti為相鄰 2次調(diào)查相隔的天數(shù)，n代表總共調(diào)查的次數(shù)。

禾谷鐮孢莖腐病和穗腐病采用單株調(diào)查法，每行調(diào)查除第1株之外的所有植株，取平均值用于分析。多年多點的表型數(shù)據(jù)使用最佳線性無偏預(yù)測值（best linear unbiased prediction，BLUP）來估算。利用SAS軟件PROC MIXED模型計算[34]，將基因型作為固定效應(yīng)，將環(huán)境、基因型與環(huán)境互作、重復(fù)、散粉期都作為隨機效應(yīng)，獲得不同病害抗病性的BLUP值。利用R軟件計算不同病害之間的相關(guān)性。

1.4 抗病基因鑒定方法

在玉米 8—10葉期取樣，每個材料隨機選 5—8株混合取新鮮葉片，用 SDS法提取葉片基因組DNA[35]。檢測4個抗病基因的引物見表2。使用全式金高保真酶（TransStart?FastPfu DNA Polymerase）對每個基因進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳或PCR產(chǎn)物測序，進行基因型鑒定。

表2 已克隆抗病基因鑒定引物Table 2 Primers used to identify the cloned disease resistance genes

2 結(jié)果

2.1 5種病害抗病性表型分析

2年的接種鑒定結(jié)果表明，大斑病的感病對照B73的感病面積 BLUP值為 45.63%，抗病對照 1145為3.48%（圖2-a）；小斑病、灰斑病的感病對照B73的病情級別BLUP值分別為5.59和5.19，抗病對照1145為2.33和2.57（圖2-b和圖2-c）；莖腐病的感病對照黃早四的病情級別BLUP值為7.03，抗病對照1145為1.11（圖2-d）；穗腐病感病對照昌7-2的發(fā)病面積BLUP值達到54.1%（圖2-e）。抗感材料抗病性差異明顯，表明接種鑒定條件可以顯著區(qū)分抗病材料和感病材料。

48份自交系對不同病害的抗病性表型均呈正態(tài)分布，表型變異范圍很大（圖 2）。方差組分分析表明，大斑病、小斑病、灰斑病和禾谷鐮孢莖腐病的基因型效應(yīng)差異極顯著，重復(fù)、環(huán)境差異不顯著，基因型與環(huán)境互作效應(yīng)顯著（表 3）。禾谷鐮孢穗腐病基因型與環(huán)境互作效應(yīng)極顯著，試驗殘差極大，導(dǎo)致基因型效應(yīng)不顯著（表3）。

表3 48份玉米自交系對不同病害抗性方差組分分析Table 3 Variance component analysis for resistance to different diseases on 48 maize inbred lines

對5種病害分別進行抗性評價，獲得高抗、抗、中抗大斑病的材料分別為9份（占18.75%）、18份（37.5%）和 14份（29.2%）；高抗、抗、中抗小斑病的材料分別為2份（4.2%）、16份（33.3%）和15份（31.25%）；抗、中抗灰斑病的材料分別為 10份（20.8%）和 23份（47.9%）；高抗、抗、中抗禾谷鐮孢莖腐病的材料分別為5份（10.4%）、14份（29.2%）和18份（37.5%）；抗、中抗禾谷鐮孢穗腐病的材料分別為5份（10.4%）和26份（54.2%）；無高抗灰斑病和穗腐病材料（表4）。

兼抗3種葉斑病的材料有1145、CML170、KA103、KA327、KB102、X178、沈137和鄭58共8份材料，對 5種病害綜合抗性表現(xiàn)優(yōu)良的自交系有 1145、CML170、KA105、KB020、X178、沈137和鄭58共7份材料（表4）。

2.2 5種病害抗病性相關(guān)性分析

對48份自交系的5種病害抗性BLUP值進行成對相關(guān)性分析（圖3），結(jié)果表明，灰斑病與大斑病抗性相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)達到 0.74（P<0.001），灰斑病與小斑病抗性的相關(guān)系數(shù)為 0.67（P<0.001），大斑病與小斑病抗性的相關(guān)系數(shù)為0.61（P<0.001）。禾谷鐮孢莖腐病與3個葉斑病的抗性也呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)介于0.37—0.57（P<0.01），其中，大斑病與莖腐病抗性的相關(guān)性最高。禾谷鐮孢穗腐病與其他4個病害的抗性之間無顯著相關(guān)性。

2.3 4個已知抗病基因分子標(biāo)記鑒定結(jié)果

針對本研究鑒定的5種病害，目前已報道的圖位克隆的抗病基因有5個，抗禾谷鐮孢莖腐病位點qRfg2的抗病基因功能變異位點尚不清楚，因此，無法進行抗病等位基因的準(zhǔn)確鑒定。選擇抗禾谷鐮孢莖腐病主效位點qRfg1、抗炭疽莖腐病主效位點Rcg1、抗大斑病位點Htn1和多抗小斑病與灰斑病的ZmCCoAOMT2，利用已發(fā)表的引物或根據(jù)已知基因序列信息設(shè)計引物（表2），對48份自交系進行抗病位點基因型檢測。結(jié)果表明（表5），1145、KA081和沈 137帶有抗病的qRfg1等位基因，只有 1份材料KB109帶有抗病的Rcg1等位基因，KA081、KA115、KA147、KA327、KB020、KB043、KB052、KB106、KB128、KB207、KB243、PH6WC和沈137共13份材料帶有抗病的Htn1，1145、KA064、KA106等 25份自交系帶有抗病的ZmCCoAOMT2等位基因。其中，沈137帶有3個抗病等位基因，包括qRfg1、Htn1和ZmCCoAOMT2。

表5 玉米自交系已克隆抗病基因基因型檢測結(jié)果Table 5 Test results of the cloned resistance genes in maize inbred lines

3 討論

莖腐病、穗腐病、大斑病、小斑病和灰斑病是世界范圍內(nèi)重要的玉米病害[36-37]。大部分研究針對單一病害開展種質(zhì)資源的自然發(fā)病鑒定或人工接種鑒定，缺乏對多個病害的多年多點重復(fù)接種鑒定[3,7-8]。玉米對這些病害的抗性都是復(fù)雜的數(shù)量抗性，鑒定結(jié)果受環(huán)境條件影響較大，自然發(fā)病條件下可能存在發(fā)病不充分的現(xiàn)象，影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究對國內(nèi)外48份優(yōu)良自交系開展多個環(huán)境下大斑病、小斑病、禾谷鐮孢莖腐病、禾谷鐮孢穗腐病的田間接種鑒定和灰斑病自然發(fā)病鑒定，發(fā)現(xiàn)測試群體中抗葉斑病的種質(zhì)較為豐富，莖腐病、穗腐病的抗原不多，一方面，可能由于葉斑病比莖腐病、穗腐病抗性更容易在育種中被選擇；另一方面，可能由于莖腐病、穗腐病缺乏主效抗性基因，很難通過傳統(tǒng)育種選擇，同時聚合多個抗病位點。大斑病、小斑病和灰斑病抗性之間呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)高達0.61—0.74，暗示這3種葉斑病抗性可能有共同的遺傳基礎(chǔ)，可進一步挖掘多抗葉斑病的數(shù)量性狀位點。此外，研究發(fā)現(xiàn)一些兼抗2種或2種以上病害的材料，其中，1145、CML170、KA105、KB020、X178、沈137和鄭58對5種病害的綜合抗性表現(xiàn)良好，可作為供體親本進行自交系的綜合抗性改良。與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記可用于抗病性輔助育種，加快抗病育種進程。玉米抗絲黑穗病主效位點qHSR1和抗禾谷鐮孢莖腐病主效位點qRfg1已被成功用于分子標(biāo)記輔助改良不同玉米材料的抗病性[38-39]。玉米種質(zhì)資源遺傳變異豐富，明確不同材料中攜帶的抗病基因類型，可為抗病分子育種提供準(zhǔn)確的抗原信息，優(yōu)化抗性改良的策略。本研究發(fā)現(xiàn)，1145、KA081和沈137共3份材料攜帶抗病的qRfg1等位基因，對莖腐病表現(xiàn)均為抗病以上級別；只有KB109這1份材料帶有抗炭疽莖腐病的Rcg1等位基因，其對禾谷鐮孢莖腐病也表現(xiàn)為抗病，該結(jié)果暗示qRfg1、Rcg1這些莖腐病數(shù)量抗性位點可能對不同病原真菌引起的玉米莖腐病均有抗性，同時也表明qRfg1和Rcg1在測試群體中屬于稀有等位基因，可通過分子標(biāo)記輔助選擇導(dǎo)入感病材料進行莖腐病抗性改良。帶有抗大斑病的Htn1的材料有13份，其中，9份自交系對大斑病表現(xiàn)為抗病以上級別，4份表現(xiàn)為中抗，說明Htn1對大斑病的抗性改良效果明顯。具有抗病的ZmCCoAOMT2等位基因的材料有25份，其中12份對小斑病表現(xiàn)中抗以上表型，14份對灰斑病表現(xiàn)中抗以上表型，10份材料同時對小斑病和灰斑病表現(xiàn)中抗以上表型，說明ZmCCoAOMT2作為一個微效抗病基因，在進行小斑病和灰斑病抗性改良時，必須與其他基因聚合使用，才能達到理想的效果。沈137對5種病害的綜合抗性表現(xiàn)良好，同時攜帶qRfg1、Htn1和ZmCCoAOMT2共3個抗病等位基因，可利用這 3個基因的功能分子標(biāo)記同時進行3種病害的輔助改良。

目前，在玉米中克隆的抗病基因還很少，針對本研究鑒定的 5個病害，只克隆了 3個抗莖腐病基因（qRfg1、qRfg2和Rcg1）、1個抗大斑病基因（Htn1）和1個兼抗小斑病和灰斑病的基因（ZmCCoAOMT2）。qRfg2的功能變異位點還不清楚，因此，無法進行抗病基因的準(zhǔn)確鑒定。目前還沒有克隆穗腐病的抗病基因。研究表明這些病害的抗性都是復(fù)雜的數(shù)量性狀，由多個遺傳位點控制，因此，需要進一步挖掘新的抗病基因。本研究發(fā)現(xiàn)，對莖腐病表現(xiàn)中抗及以上表型的材料有37份，而帶有抗病qRfg1等位基因的材料只有 3份；對大斑病表現(xiàn)中抗及以上表型的材料有41份，帶有抗病Htn1等位基因的材料只有13份；對小斑病、灰斑病表現(xiàn)中抗及以上表型的材料各有33份，而帶有抗病ZmCCoAOMT2等位基因的材料僅有10份對小斑病和灰斑病均表現(xiàn)中抗以上表型。這些結(jié)果充分說明，大部分抗病材料中還有未知抗病基因亟待發(fā)掘。例如，本研究發(fā)現(xiàn)有一些綜合抗性表現(xiàn)良好的自交系如 CML170和KA105，并不攜帶任何已知的抗病基因，但對 5種病害均表現(xiàn)出良好的抗性，因此，可以進一步從中挖掘新的抗病位點。

莖腐病、穗腐病致病菌復(fù)雜多樣，發(fā)病程度與環(huán)境條件密切相關(guān)[7,40]。本文只選擇了禾谷鐮孢菌進行接種鑒定，后續(xù)研究將對關(guān)鍵材料進行腫囊腐霉菌、擬輪枝鐮孢菌等多個致病菌的接種鑒定，通過多年多點數(shù)據(jù)明確種質(zhì)對不同病原菌的綜合抗性，確保材料抗病性的穩(wěn)定性和持久性。另外，由于莖腐病和穗腐病表型鑒定的復(fù)雜性，建議設(shè)置多個重復(fù)，提高鑒定的準(zhǔn)確性?；野卟∧壳斑€沒有成熟的人工接種鑒定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，采用自然發(fā)病取決于選擇的鑒定地點和當(dāng)年的氣候條件，陜西省鎮(zhèn)坪縣是玉米尾孢灰斑病的高發(fā)區(qū)[6,41]，有研究表明，不同玉米種質(zhì)對玉米尾孢和玉蜀黍尾孢菌的抗性可能不一樣，因此需要進一步對玉蜀黍尾孢灰斑病進行抗性鑒定。

4 結(jié)論

1145、CML170、KA105、KB020、X178、沈 137和鄭 58這 7份材料的綜合抗性表現(xiàn)良好，KA081、KA115、KB207等多份材料抗2種以上病害。大斑病、小斑病、灰斑病和禾谷鐮孢莖腐病抗性之間呈極顯著正相關(guān)，與禾谷鐮孢穗腐病無顯著相關(guān)。自交系沈137同時攜帶抗病的qRfg1、Htn1和ZmCCoAOMT2等位基因，可用于分子標(biāo)記輔助改良。CML170和KA105不攜帶已知的4個抗病位點，但對5種病害均表現(xiàn)出良好的抗性，可用于挖掘新的抗病基因。