林兵，陳藝荃，鐘淮欽，葉秀仙，樊榮輝?

1福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福州 350013；2福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福州 350013

0 引言

【研究意義】花色是觀賞植物重要的性狀特征[1]，花色變異對(duì)豐富其花色具有重要意義，闡明花色變異機(jī)理，可為花色定向改良提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】荷蘭鳶尾（Irishollandica）為鳶尾科（Iridaceae）鳶尾屬（Irisspp.）秋植球根花卉?；ㄗ藘?yōu)美、如鳶似蝶、花色艷麗，主要有白色、黃色和藍(lán)紫色等色系[2]。許多植物中，由紅到紫到藍(lán)色花的形成主要由花色素苷途徑控制，如茶樹（Camelliasinensis(L.)）、葡萄風(fēng)信子（Muscari）、睡蓮（Nymphaeaspp.）等[3-5]。花色素苷途徑在F3H、F3'H和F3'5'H三個(gè)關(guān)鍵酶作用下，形成3個(gè)分支，形成3種不同的二氫黃酮醇，DFR選擇性地催化3種二氫黃酮醇，形成相應(yīng)的花青素苷。因此，3個(gè)羥化酶F3H、F3'H、F3'5'H活性的有無(wú)、強(qiáng)弱、DFR的底物催化選擇性及FLS對(duì)底物的競(jìng)爭(zhēng)性是決定花色的主要因素[6-7]。該途徑結(jié)構(gòu)基因的突變可能導(dǎo)致其編碼的酶失活進(jìn)而使植物中花色素苷含量降低，表型上會(huì)表現(xiàn)出顏色變淺、變白等特征[8-9]。荷蘭鳶尾藍(lán)紫色花的深淺主要由花色素苷的種類和含量、黃酮助色素的輔助著色及類胡蘿卜素的含量三者共同作用，其中花色素苷的種類和含量為主控因素[10]，且荷蘭鳶尾花色素苷途徑大部分相關(guān)酶和基因被挖掘和研究[11-13]，這為花色研究奠定了基礎(chǔ)。【本研究切入點(diǎn)】由于特定位點(diǎn)突變導(dǎo)致色素缺失，進(jìn)而導(dǎo)致花色變淺或變白的可能分子機(jī)制存在廣泛性和不確定性，例如，可能是某個(gè)基因、某個(gè)蛋白或某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的突變，使花色變淺或變白機(jī)理的研究難以澄清，這就需要更多的數(shù)據(jù)去解釋花色變異原因。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)探索荷蘭鳶尾藍(lán)紫色野生型‘展翅’及白色突變株‘玉妃’的顯色分子機(jī)制及色素積累差異，為花色變異機(jī)理研究提供技術(shù)支持，同時(shí)對(duì)荷蘭鳶尾白色花和藍(lán)紫色花中花色苷積累機(jī)制提供更全面的了解。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型‘展翅’（藍(lán)紫色）和突變株‘玉妃’（白色）種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究中心種質(zhì)資源圃中。

2019年3月，分別取‘展翅’（藍(lán)紫色）和‘玉妃’（白色）旗瓣，液氮中速凍，-80℃保存，用于色素成分分析、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；分別取‘展翅’和‘玉妃’花發(fā)育3個(gè)時(shí)期（花蕾前期：蕾為白色，未露出花被；花蕾中期：蕾略顯色，尖端露出花被；始花期：花苞半開放），用于 qRT-PCR，以檢測(cè)目的基因隨花發(fā)育的表達(dá)情況。

1.2 類黃酮的定性定量分析

類黃酮的定量定性分析采用超高效液相色譜—四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-QTOF-MS）技術(shù)進(jìn)行，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

類黃酮的提?。簝龈蓹C(jī)中凍干后，取出約100 mg，采用上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司型號(hào)為JX-24的全自動(dòng)組織研磨儀，于40 Hz頻率研磨4 min；加入1 mL 60%乙醇溶液（含0.1%鹽酸）于恒溫水浴鍋中35℃下浸提2 h；在4℃離心機(jī)中14 000 r/min離心15 min，取上清，用溫和氮?dú)獯等テ渲械囊掖迹⒀a(bǔ)充一定體積0.1%鹽酸的水溶液，用于后續(xù)分析。

UPLC條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters），溫度為45℃。流動(dòng)相組：A相，水（含0.5%甲酸溶液）；B相，乙腈（含0.5%甲酸溶液）。洗脫條件：2 min，1% B；～1 min，5% B；6 min，20% B；3 min，50% B；3 min，100% B；100% B保持2 min；最后1% B平衡3 min。流速 0.4 mL·min-1，進(jìn)樣體積 3 μL。

質(zhì)譜條件：LockSpray離子源在正電噴霧電離和負(fù)電噴霧電離（ESI）模式下運(yùn)行。掃描模式為 MSE模式，以低能掃描（CE 4 eV）和高能掃描（CE傾斜20—45 eV）來(lái)破碎離子，氬氣（99.999%）作離解氣體。掃描范圍50—1 000 amu，速度0.2 s/掃描。毛細(xì)管電壓2 kV（正模式），錐電壓40 V，源電壓偏移60 V。光源溫度115℃，脫溶劑氣溫度為450℃。去溶劑氣流量 900 L·h-1，錐氣流量 50 L·h-1，氮?dú)猓?99.5%）用作去溶劑和錐氣。

花色素苷和黃酮醇含量測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，利用標(biāo)準(zhǔn)品矢車菊素 3-O-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside）和槲皮素（Quercetin）作為外標(biāo)進(jìn)行半定量分析。標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度為 500、250、100、50、10、5和1 μg·mL-1。每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用UNIFI 1.8.1（Waters）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析

通用RNA提取試劑盒（北京百泰克生物科技有限公司）提取總RNA。RNA完整性用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，MA，USA）檢查。使用Illumina HiSeq?4000進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（北京百邁克生物技術(shù)公司）。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析流程如下：應(yīng)用 FASTX-Toolkit軟件獲得原始 Raw reads，利用FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）軟件對(duì)Raw reads過(guò)濾得到高質(zhì)量的Clean reads；Clean reads再組裝成Transcripts和Unigene。利用RSEM軟件對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行預(yù)測(cè)，采用 FPKM（Fragments Per Kilobase Million）方法對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理[14]。使用DESeq軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行評(píng)估[15]。差異基因間的閾值為false discovery rate（FDR）<0.01 a且fold- change value≥2。由8大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋，包括 Nr、Nt、GO、KOG、KEGG、COG、Pfam 和eggNOG。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

使用ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems）進(jìn)行qRT-PCR。應(yīng)用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)以確定基因的相對(duì)表達(dá)水平。熔解曲線分析確認(rèn)PCR的特異性。每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以β-actin為內(nèi)參。相對(duì)定量計(jì)算方法應(yīng)用2-ΔΔCt法。

表1 qRT-PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 花色素苷及黃酮醇鑒定

應(yīng)用UHPLC-QTOF-MS技術(shù)，對(duì)野生型‘展翅’（藍(lán)紫色）和突變品種‘玉妃’（白色）的旗瓣進(jìn)行花色素苷和黃酮醇定量定性鑒定。共有9種花色素苷，‘展翅’花中色素物質(zhì)主要為飛燕草素苷和矢車菊素苷，使其花色呈藍(lán)紫色，主要含量較高的有飛燕草素-3-(6-p-?；咸烟擒?-5-(6-丙二?；?4-鼠李糖基葡萄糖苷)和矢車菊素-3-蕓香糖苷，含量分別為 209.85和 144.42μg·g-1，其次為矮牽牛素-3-(6-鼠李糖基-2-木糖基葡萄糖苷)和飛燕草素-3-[6-(4-咖啡酰基木糖基)葡萄糖苷]-5-葡萄糖苷，含量分別為61.86和61.26 μg·g-1。而‘玉妃’的9種花色素苷含量相較于‘展翅’均顯著降低，預(yù)測(cè)可能是花色素苷合成途徑的上游基因發(fā)生了突變，阻斷了整個(gè)花色素苷代謝流的通路，使顯色的花色素含量達(dá)不到顯色程度，導(dǎo)致變異品種‘玉妃’花色變?yōu)榘咨?/p>

共鑒定出 14種黃酮醇，其中楊梅素-3-O-葡萄糖苷和楊梅素-3-O-半乳糖苷在‘玉妃’中含量顯著升高，分別為145.22和58.65 μg·g-1，而在‘展翅’中的含量分別為3.29和4.04 μg·g-1，預(yù)測(cè)花色素苷合成途徑的部分代謝流流向黃酮醇。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

為了進(jìn)一步探索‘玉妃’突變?yōu)榘咨脑?，將‘展翅’和‘玉妃’的旗瓣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得21.51 Gb Clean reads（表3），通過(guò)組裝獲得46 485個(gè)unigenes，平均長(zhǎng)度為839 bp，其中12 500個(gè)unigene長(zhǎng)于1 000 bp，占總數(shù)的26.89%?！皴c‘展翅’相比，有485個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，有216個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。

表2 荷蘭鳶尾花中花色素苷和黃酮醇的鑒定Table 2 Identification of anthocyanin and flavonol in Iris hollandica flower

表3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)Table 3 RNAseq data statistics

在46 485個(gè)unigenes中，58.24%的unigenes被8大公共數(shù)據(jù)庫(kù)注釋。為了鑒定與次級(jí)代謝途徑相關(guān)的unigenes，進(jìn)行KEGG注釋。約有9 909（21.31%）個(gè)unigenes分屬于65個(gè)KEGG途徑。類黃酮途徑（花色素苷途徑）是次級(jí)代謝途徑中含有差異基因最多的一組之一（圖2），這與突變株‘玉妃’花色變異明顯是一致的，這些基因分析為荷蘭鳶尾基因挖掘和功能分析提供寶貴資源?；ㄉ剀胀緩街泄舶l(fā)現(xiàn)7個(gè)差異表達(dá)基因，2個(gè)二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）基因在‘玉妃’中下調(diào)表達(dá)，1個(gè)黃酮醇合成酶（flavonol synthase，F(xiàn)LS）基因、1個(gè)查爾酮合成酶基因（chalcone synthase，CHS）、1個(gè)查

爾酮異構(gòu)酶基因（chalcone isomerase，CHI）和1個(gè)類黃酮 3′-羥化酶基因（flavonoid 3′-hydroxylase，F(xiàn)3'H）在‘玉妃’中均上調(diào)表達(dá)。

2.3 花色變異相關(guān)基因分析

DFR和FLS均以二氫黃酮醇（dihydroflavonol）為底物，分別形成有色的花色素苷（anthocyanin）和無(wú)色的黃酮醇（flavonol），兩個(gè)基因間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共發(fā)現(xiàn)5個(gè)DFR基因，其中3個(gè)在‘展翅’和‘玉妃’中均低表達(dá)，2個(gè)（IhDFR1和IhDFR2）在白色‘玉妃’花中表達(dá)量顯著降低（圖 4）。共發(fā)現(xiàn)10個(gè)FLS基因，其中8個(gè)在‘展翅’和‘玉妃’中均低表達(dá)，1個(gè)在‘展翅’和‘玉妃’中的 FPKM均為10，1個(gè)（IhFLS1）在白色‘玉妃’花中表達(dá)量顯著升高。DFR聚類分析表明，IhDFR1和IhDFR2親緣關(guān)系很近，且與同為鳶尾屬的溪蓀（Irissanguinea）和馬藺（Irislactea）聚為一類。FLS聚類分析表明，IhFLS1與其他FLS氨基酸序列親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，單獨(dú)聚為一類（圖3）。

對(duì)‘展翅’和‘玉妃’的3個(gè)花發(fā)育時(shí)期進(jìn)行qRTPCR分析，結(jié)果顯示，IhDFR1和IhDFR2在‘展翅’中隨著花的發(fā)育，表達(dá)量逐漸上升，在始花期達(dá)到最高，而在‘玉妃’中花發(fā)育3個(gè)時(shí)期表達(dá)量相近。在始花期，IhDFR1和IhDFR2在‘展翅’中的表達(dá)明顯高于‘玉妃’中。IhFLS1在‘展翅’中隨著花的發(fā)育略有上升，至始花期達(dá)到最高，在‘玉妃’中隨著花的發(fā)育顯著上升，至始花期達(dá)到最高。在始花期，IhFLS1在‘玉妃’中的表達(dá)明顯高于 ‘展翅’（圖4）。推測(cè)在‘玉妃’中，IhDFR1和IhDFR2的低表達(dá)及IhFLS1的高表達(dá)，使花色素苷生物合成途徑的花色素苷合成受阻，部分代謝流流向無(wú)色的黃酮醇，花色由藍(lán)紫色變?yōu)榘咨?/p>

3 討論

飛燕草色素苷使花色呈現(xiàn)紫色到藍(lán)色，矢車菊色素苷使花色呈現(xiàn)紅色到品紅[16-17]。藍(lán)紫色‘展翅’花中主要含有飛燕草素苷和矢車菊素苷，‘玉妃’花中飛燕草素苷和矢車菊素苷含量顯著降低，呈現(xiàn)白色。然而，花色素苷生物合成途徑的一些關(guān)鍵基因如CHS、CHI和F3'H在白色‘玉妃’花中表達(dá)量分別提高了3.2、2.2、2.3倍。前人研究中，花色素苷的積累會(huì)伴隨生物合成途徑中相關(guān)基因的高表達(dá)，而花色素苷的缺失會(huì)伴隨相關(guān)基因的低表達(dá)[18-21]，本研究與前人研究存在差異。LOU等[4]的研究中，葡萄風(fēng)信子的白色花中，CHS、F3'H和F3'5'H的高表達(dá)，使該途徑中不顯色的黃梅酮（Myricetin）和山奈酚（Kaempferol）含量高。CHS、CHI和F3'H高表達(dá)，使白色‘玉妃’花中不顯色的黃酮醇總含量升高。

DFR能催化二氫黃酮醇形成原花色素苷（Leucoanthocyanins），進(jìn)而形成花色素苷，F(xiàn)LS催化二氫黃酮醇形成無(wú)色的黃酮醇，與DFR存在競(jìng)爭(zhēng)底物關(guān)系[22-23]。由于2個(gè)基因?qū)Φ孜锏母?jìng)爭(zhēng)，F(xiàn)LS的上調(diào)表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致DFR表達(dá)量下降和花色素苷的降低。在煙草中，過(guò)表達(dá)FLS，使DFR的表達(dá)受阻，黃酮醇積累，花色變?yōu)榘咨玔24]。本研究白色‘玉妃’花中，DFR的低表達(dá)可能是藍(lán)紫色色素缺失的主要原因，此外，F(xiàn)LS的高表達(dá)，導(dǎo)致其與DFR競(jìng)爭(zhēng)二氫黃酮醇底物，部分阻止花色素苷的合成，并使代謝流流向無(wú)色的黃酮醇，最終導(dǎo)致藍(lán)紫色變?yōu)榘咨?/p>

目前，許多植物出現(xiàn)花色退化或變白現(xiàn)象，除DFR突變外，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因有多種。如單個(gè)CHS的突變會(huì)導(dǎo)致花色退化，在矮牽牛（Petunia hybrida）和紫羅蘭（Matthiolaincana）中，由于CHS的突變，花色均變?yōu)榘咨玔25-27]。阻斷花色素苷途徑上游基因會(huì)更有效率，CHS突變也許是使花色缺失最常見(jiàn)的方法[28-29]。ANS和DFR的突變也可導(dǎo)致花色素缺失[30-31]。研究表明，通過(guò)調(diào)節(jié)花色素苷生物合成的分支點(diǎn)等方法，也可使花色缺失。將蘋果ANR導(dǎo)入煙草可抑制煙草花中CHI和DFR的表達(dá)，最終導(dǎo)致花青素含量降低[32]。本研究中，DFR的低表達(dá)和FLS的高表達(dá)導(dǎo)致荷蘭鳶尾花色變?yōu)榘咨?/p>

4 結(jié)論

白色‘玉妃’中，IhDFR1和IhDFR2的低表達(dá)，使花色素苷積累受阻，而與 DFR競(jìng)爭(zhēng)相同底物的IhFLS1在‘玉妃’中高表達(dá)，使部分代謝流轉(zhuǎn)向黃酮醇，也在一定程度上限制花色素苷的形成，最終導(dǎo)致花色由藍(lán)紫變?yōu)榘咨?/p>