郭建敏，李云濤*，劉 影，湯 澍，王曉瑩，柳婷婷

(1.哈爾濱怡康藥業(yè)有限公司， 哈爾濱 150060； 2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室， 哈爾濱 150081)

骨質(zhì)疏松是一種全身性的骨骼疾病，其特點是骨質(zhì)減少，骨組織的細(xì)微結(jié)構(gòu)被破壞，使骨的脆性增加，骨折的危險性增加.骨密度是一個判定骨質(zhì)疏松的指標(biāo),它能夠反映骨骼的健康狀況.骨密度與遺傳、飲食、生活習(xí)慣等均有關(guān)系[1]，隨著人口老齡化進(jìn)程的加速，以骨質(zhì)疏松癥為代表的慢性非傳染性疾病成為了社會的常見病、多發(fā)病.骨質(zhì)疏松癥的臨床終點結(jié)局是骨質(zhì)疏松性骨折，隨著發(fā)病率的上升，給社會和家庭帶來巨大負(fù)擔(dān)[2].我國2013年人口普查結(jié)果顯示，約有2.02億人口超60歲，至2050年，可能上升至4億，其中骨質(zhì)疏松癥的患者將達(dá)2.12億[3].

臨床上治療骨密度降低用化學(xué)藥物[4]、激素[5]、中成藥[6]等手段.近年來發(fā)現(xiàn)部分原料用在保健食品中來增加骨密度，如鈣制劑、氨基葡萄糖等[7].對于補(bǔ)鈣有益的研究發(fā)現(xiàn)鈣離子對于成骨細(xì)胞的分化與增值有部分的促進(jìn)作用[8].氨基葡萄糖目前的生產(chǎn)工藝以及使用情況，德國聯(lián)邦風(fēng)險評估研究所、歐洲食品安全局、新加坡等部門在對此原料使用中，建議葡萄糖代謝受損人群，特別是糖尿病人群等需要謹(jǐn)慎使用[9-11].骨骼健康需要鈣、維生素D[12]等營養(yǎng)素.熟地黃骨膠原鈣咀嚼片是以碳酸鈣、骨膠原、熟地黃、維生素D3、山藥為主要原料，經(jīng)過胃溶型藥用薄膜包衣制得的用于增加骨密度的功能性保健食品.

中醫(yī)認(rèn)為，骨質(zhì)疏松癥是由肝血虛和腎氣虛導(dǎo)致的并發(fā)癥[13]，故補(bǔ)腎補(bǔ)血是中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松癥的主要方法.本品是以現(xiàn)代化的制劑技術(shù)，經(jīng)提取、過篩、混合、制粒、壓片、包衣等工藝制備而成，功效成分穩(wěn)定可控，安全性、穩(wěn)定性等均通過了國家相關(guān)技術(shù)評價.

1 實驗材料與方法

1.1 樣品

熟地黃骨膠原鈣咀嚼片由哈爾濱怡康藥業(yè)有限公司提供，樣品為棕色粉末.該樣品推薦劑量為每次2片，每日2次，每片0.75 g，每人每日3 g.樣品每100 g含鈣20.0 g.

金鈣爾奇牌碳酸鈣維D3元素片(4)由惠氏制藥有限公司生產(chǎn)，推薦劑量為每次1片，每日1次，每片1.5 g，每人每日1.5 g.樣品每1.5 g含鈣600 mg，金鈣爾奇牌碳酸鈣維D3元素片(4)每100 g含鈣40.0 g.

1.2 劑量設(shè)計

熟地黃骨膠原鈣咀嚼片人體推薦劑量為3 g/人/d，如成人體重以60 kg計，則每日推薦劑量為0.05 g/kg·bw.實驗設(shè)低、中、高三個劑量組，劑量分別為0.25、0.5、1.5 g/kg·bw，含鈣量分別為0.05、0.1、0.3 g/kg ·bw.相當(dāng)于人體推薦劑量的5、10、30倍.金鈣爾奇牌碳酸鈣維D3元素片(4)人體推薦劑量為1.5g/人/d，如成人體重以60 kg計，則每日推薦劑量為0.025 g/kg·bw.實驗設(shè)低、中兩個劑量組，劑量分別為0.125、0.25 g/kg·bw，含鈣量分別為 0.05、0.1 g/kg·bw.相當(dāng)于人體推薦劑量的5、10倍.另設(shè)一個低鈣對照組(含鈣量為150 mg/100g飼料)(灌胃等容積去離子水)和一個碳酸鈣對照組(劑量為0.75 g/kg·bw，碳酸鈣中鈣的質(zhì)量占40%，因此含鈣量為0.3 g/kg·bw).

1.3 實驗動物及分組

SPF級SD品系雄性大鼠70只，體重60～75 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，在清潔級動物實驗中心(屏障環(huán)境)飼養(yǎng)，動物房溫度21～23 ℃，相對濕度55%～58%.動物實驗期間均給予低鈣飼料，飼料：北京科澳協(xié)力飼料有限公司.低鈣飼料配方(100 g)含小麥粉54.0 g，黃豆粉15.0 g，酪蛋白10.0 g，淀粉11.0 g，花生油4.0 g，AIN-76混合鹽2.6 g，纖維素2.0 g， AIN-76混合維生素1.0 g，氯化膽堿0.2 g，DL-蛋氨酸0.2 g.加入一定質(zhì)量的CaCO3，使飼料含鈣量達(dá)到150 mg/100 g，實測含鈣量為149.5 mg/100 g.保證有充足飲水，飲用去離子水，連續(xù)3個月.

70只大鼠在實驗室條件下檢疫1周后，隨機(jī)分成7組，分別為熟地黃骨膠原鈣咀嚼片低、中、高三個劑量組，金鈣爾奇牌碳酸鈣維D3元素片(4)低、中兩個劑量組，一個低鈣對照組和一個碳酸鈣對照組，每組10只，將各組動物均按10 mL/kg·bw灌胃容積進(jìn)行灌胃.連續(xù)灌胃3個月后進(jìn)行各項指標(biāo)檢測.

1.4 儀器與試劑

AA 7002型原子吸收分光光度計：北京東西分析儀器有限公司；HOLOGIC Discovery雙能X線骨密度儀： 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院； 動物天平、電子天平、 加樣器、 試管、 離心管、 動物解剖器材、游標(biāo)卡尺、 代謝鼠籠、 105 ℃烘箱.優(yōu)級純碳酸鈣、硝酸、高氯酸、氧化鑭.鈣單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL，北京北化康泰臨床試劑有限公司).

1.5 實驗方法

1.5.1 體重測定

禁食12 h后，測體重，1次/周.

1.5.2 股骨重量測定

動物喂養(yǎng)3個月安樂處死，剝離出右側(cè)股骨，測股骨長度；置105 ℃烘箱中烘烤8 h，至恒重，冷至室溫，稱定質(zhì)量.

1.5.3 股骨骨密度測定

確定股骨中點測量點：通過其中點對股骨全長進(jìn)行測量，沿橫截面劃一直線，以此作為股骨中點測量點(截面).確定股骨遠(yuǎn)心端測量點：在股骨遠(yuǎn)心端關(guān)節(jié)凹槽最下緣處確定測量點，經(jīng)過此點劃與上述股骨中點處標(biāo)記的互相平行的直線，以此作為股骨遠(yuǎn)心端測量點(截面).骨密度儀經(jīng)過校準(zhǔn)后對股骨中點及股骨遠(yuǎn)心端的骨密度進(jìn)行測量.

1.5.4 骨含鈣量測定

精密稱取烤至恒重的股骨整體，放至干燥清潔的150 mL三角瓶(經(jīng)鹽酸處理)中，加入15～20 mL硝酸+高氯酸(4∶1)混合酸，在電熱板上加熱消化至冒白煙并透明無色.加數(shù)毫升去離子水，煮沸去除剩余的酸.重復(fù)2次，定容后，用原子吸收分光光度計測定.

1.5.5 鈣吸收實驗

給予該樣品3周后，將大鼠置代謝籠中進(jìn)行3 d鈣代謝實驗，記錄3天進(jìn)食量，收集72 h糞便，測定飼料樣品及糞便中的含鈣量.飼料均勻混合過20目篩后烘干；鼠糞樣品混勻，置80 ℃烘箱中進(jìn)行烘干，干后放干燥器中冷卻.磨細(xì)后，精密稱量飼料或糞便0.300～1.000 g，經(jīng)過硝酸和高氯酸混合酸消化后，用原子吸收分光光度計測定飼料及糞便中含鈣量，從而計算鈣的吸收率.

鈣的表觀吸收率(%)=(攝入鈣-糞鈣)/攝入鈣×100%.

1.6 統(tǒng)計分析

用SPSS統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示.用各組間平均數(shù)比較進(jìn)行方差分析.檢驗水準(zhǔn)α=0.05.

1.7 結(jié)果判定

根據(jù)原衛(wèi)生部頒布的《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》，給予受試組的骨含鈣量或骨密度顯著高于低鈣對照組且不低于相應(yīng)劑量碳酸鈣對照組，鈣的吸收率不低于碳酸鈣對照組，可斷定該受試組擁有增加骨密度的功效.

2 實驗結(jié)果

2.1 大鼠體重、鈣吸收率的影響

大鼠體重的影響見表1.實驗?zāi)?，熟地黃骨膠原鈣咀嚼片高、中劑量組、碳酸鈣對照組與金鈣爾奇牌碳酸鈣維D3元素片(4)中劑量組的體重顯著大于低鈣對照組.熟地黃骨膠原鈣咀嚼片高劑量組的體重與碳酸鈣對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).熟地黃骨膠原鈣咀嚼片中劑量組的體重與金鈣爾奇牌碳酸鈣維D3元素片(4)中劑量組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).

表1 大鼠體重的影響Table 1 Effect of body weight on

大鼠鈣吸收率的影響見表2.實驗?zāi)?，熟地黃骨膠原鈣咀嚼片高劑量組的鈣吸收率不低于碳酸鈣對照組.熟地黃骨膠原鈣咀嚼片中劑量組的鈣吸收率與金鈣爾奇牌碳酸鈣維D3元素片(4)中劑量組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05).

表2 大鼠鈣的表觀吸收率的影響Table 2 Effect of calcium on apparent absorption

2.2 大鼠股骨質(zhì)量和長度的影響

大鼠股骨質(zhì)量和長度的影響見表3.實驗?zāi)?，各劑量組、碳酸鈣對照組的股骨質(zhì)量均顯著大于低鈣對照組(P<0.01).熟地黃骨膠原鈣咀嚼片高劑量組的股骨質(zhì)量和骨長與碳酸鈣對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).熟地黃骨膠原鈣咀嚼片中劑量組的股骨質(zhì)量與金鈣爾奇牌碳酸鈣維D3元素片(4)中劑量組比較時，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).

表3 大鼠股骨質(zhì)量和長度的影響Table 3 Effect of the weight and length of femur in

2.3 大鼠股骨骨密度和骨含鈣量的影響

大鼠股骨骨密度和骨含鈣量的影響見表4，5.實驗?zāi)?，熟地黃骨膠原鈣咀嚼片高劑量組的股骨密度和和骨含鈣量均顯著大于低鈣劑量組(P<0.05).熟地黃骨膠原鈣咀嚼片中劑量組的股骨密度和和骨含鈣量與金鈣爾奇牌碳酸鈣維D3元素片(4)中劑量組相比時，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).

表4 大鼠股骨骨密度的影響Table 4 Effect of bone mineral density of femur in

表5 大鼠股骨骨含鈣量的影響Table 5 Effect of calcium content in femur of

3 討 論

經(jīng)口給予大鼠不同劑量的熟地黃骨膠原鈣咀嚼片和金鈣爾奇牌碳酸鈣維D3元素片(4)90 d，相同組別的兩個樣本大鼠的股骨骨密度、骨含鈣量、鈣吸收率均無顯著性差異，結(jié)果顯示熟地黃骨膠原鈣咀嚼片對大鼠骨密度的作用與金鈣爾奇牌碳酸鈣維D3元素片(4)無顯著性差異.本品質(zhì)量控制的標(biāo)志性成分為鈣、蛋白質(zhì)、毛蕊花糖苷[14]、維生素D3.奶制品中具有礦物質(zhì)及維生素如鈣與維生素D等，是老年人和絕經(jīng)后女性必須的營養(yǎng)物質(zhì)，有利于延緩骨密度下降[15].