周婷 吳瑀婕 盧方云 黃瑾 吳海虹 張新笑 徐為民 鄒燁 王道營

摘 要：研究超聲波輔助酶提取雞膝軟骨膠原蛋白肽的工藝，確定最佳實驗用酶為堿性蛋白酶。以料液比、超聲功率和酶提時間為試驗因素，膠原蛋白肽得率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken試驗和響應(yīng)面法分析試驗，確定最佳提取工藝條件。結(jié)果表明：最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶26（m/V）、超聲功率253 W、酶提時間4 h，此時雞膝軟骨膠原蛋白肽得率可達(dá)到42.83%，與模型理論預(yù)測值（43.32%）較為接近，相對誤差僅為0.49%;對經(jīng)過優(yōu)化工藝得到的雞膝軟骨膠原蛋白肽成品進(jìn)行抗氧化性能測定，其2，2-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）陽離子自由基清除能力和羥自由基清除能力的半抑制質(zhì)量濃度分別為8 mg/mL和8.5 mg/mL，還原能力低于VC，但具有較好的金屬離子螯合能力。

關(guān)鍵詞：雞膝軟骨;膠原蛋白肽得率;超聲波;堿性蛋白酶;抗氧化性能

Optimization of Ultrasound-Assisted Enzymatic Extraction of Collagen Peptide from Chicken Knee Cartilage

and Its Antioxidant Activity

ZHOU Ting1，2， WU Yujie1，2， LU Fangyun2， HUANG Jin2， WU Haihong1，2， ZHANG Xinxiao1，2， XU Weimin2， ZOU Ye2，*， WANG Daoying1，2，*

（1.College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China;

2.Institute of Agricultural Products Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Science， Nanjing 210014， China）

Abstract： The ultrasound-assisted enzymatic extraction of collagen peptide from chicken knee cartilage was studied in this work. Alkaline protease was selected as the optimum enzyme. In an effort to determine the optimal processing conditions using Box-Behnken design combined with response surface methodology （RSM）， solid-to-solvent ratio， ultrasonic power and extraction time were considered as the independent variables， and the yield of collagen peptide was considered as the response. A solid-to-solvent ratio of 1：26 （m/V）， an ultrasonic power of 253 W and enzymatic extraction for 4 h were found to be the optimal conditions， under which the experimentally measured yield of collagen peptide was 42.83%. This experimental value was in good agreement with the predicted one （43.32%） with a relative error of only 0.49%. Antioxidant tests showed that the half maximal inhibitory concentration （IC50） of the collagen peptide prepared using the optimized conditions was 8 and 8.5 mg/mL for scavenging of 2，2-azinobis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate） cation radical and hydroxyl radical， respectively. The collagen peptide， despite having potent metal ion chelating ability， exhibited lower reducing power than did VC.

Keywords： chicken knee cartilage; collagen peptide yield; ultrasound; alkaline proteinase; antioxidant activity

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210226-048

中圖分類號：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）04-0007-09

引文格式：

周婷， 吳瑀婕， 盧方云， 等. 雞膝軟骨膠原蛋白肽的超聲輔助酶提工藝優(yōu)化及抗氧化性[J]. 肉類研究， 2021， 35（4）： 7-15. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210226-048.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHOU Ting， WU Yujie， LU Fangyun， et al. Optimization of ultrasound-assisted enzymatic extraction of collagen peptide from chicken knee cartilage and its antioxidant activity[J]. Meat Research， 2021， 35（4）： 7-15. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210226-048.? ? http：//www.rlyj.net.cn

膠原蛋白是動物機體結(jié)締組織重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，起著支撐器官和保護(hù)機體的作用。膠原蛋白肽是膠原蛋白經(jīng)酸、堿或蛋白酶降解處理后制成的一種膠原蛋白前體產(chǎn)品，又稱水解膠原蛋白，具有獨特的氨基酸組成和豐富的生理功能活性，如降血壓、免疫活性、促進(jìn)鈣吸收和抗氧化性能[1]等，在食品工業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景。目前國內(nèi)外工業(yè)生產(chǎn)中多采用酸法水解或堿法水解制備膠原蛋白肽，但酸法和堿法水解都存在一定的弊端，酸法水解會破壞水解產(chǎn)物中的某些氨基酸，且對設(shè)備的腐蝕嚴(yán)重，堿法水解會產(chǎn)生一些不利于人體健康的副產(chǎn)物，因此酶法水解逐漸成為當(dāng)前研究的熱點。

我國是肉雞養(yǎng)殖和進(jìn)口大國，雞肉相對于豬肉、牛肉等紅肉食品具有高蛋白、低脂肪和低膽固醇的特點。雞膝軟骨指的是雞爪膝蓋關(guān)節(jié)部分（俗稱為雞掌中寶，又叫雞脆骨），富含膠原蛋白和鈣質(zhì)[2]。超聲波技術(shù)[3]是20世紀(jì)發(fā)展起來的高新技術(shù)，由于其具有機械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)等獨特功能特性，已廣泛應(yīng)用于實際生產(chǎn)中。本研究以雞膝軟骨為原料，先以膠原蛋白肽得率為標(biāo)準(zhǔn)篩選最佳試驗用酶，然后通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗探究超聲輔助酶提雞膝軟骨膠原蛋白肽的最佳工藝，最后對產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化性能測定，以期為雞爪副產(chǎn)物的高值化利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞膝軟骨購于上海谷野食品有限公司，蒸餾水清洗處理，低溫通風(fēng)晾干后分裝，在-20 ℃冷凍柜中貯藏備用。

胃蛋白酶（豬胃黏膜）（USP級，3 000 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、胰蛋白酶（3 000 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）、復(fù)合蛋白酶（120 U/mg）、氯化亞鐵 上海源葉生物技術(shù)有限公司;氫氧化鈉、無水碳酸鈉、鹽酸、七水合硫酸亞鐵、無水乙醇 國藥

集團化學(xué)試劑有限公司;羥脯氨酸（Hyp）測試盒（消化法）和羥脯氨酸試劑標(biāo)準(zhǔn)品 南京建成生物工程研究所;2，2-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2，2-azino-bis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、菲啰嗪-鈉鹽 上海麥克林生化科技有限公司;過二硫酸鉀、鐵氰化鉀 西隴化工股份有限公司;水楊酸 天津市

科密歐化學(xué)試劑有限公司;過氧化氫 南京化學(xué)試劑股份有限公司;三氯乙酸 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PTX-FA210S電子天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司;HTP-312電子天平 上?；ǔ睂崢I(yè)有限公司;78-1磁力加熱攪拌器、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;DF-101S數(shù)顯集熱式磁力攪拌器 上海易友儀器有限公司;FiveEasy Plus pH計

梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;Centrifuge 5810R離心機 德國Eppendorf股份公司;TG16-WS臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;XW-80A微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器有限公司;Gen5全波長酶標(biāo)儀? ?美國伯騰儀器有限公司;Direct-Q3uv超純水機 美國Millipore公司;Alpha1-2LDplus實驗室型凍干機 德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 雞膝軟骨成分的測定

水分含量測定：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》[4]直接干燥法;灰分含量測定：參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》[5]高溫灼燒法;脂肪含量測定：參照

GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》[6]

索氏抽提法;蛋白質(zhì)含量測定：參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[7]凱氏定氮法。

1.3.2 雞膝軟骨膠原蛋白肽的酶提制備工藝流程

雞膝軟骨→脫脂和除雜→水洗→超聲波輔助酶提取→

滅酶→離心→膠原蛋白肽提取液→凍干成粉末

操作要點：1）脫脂：將雞膝軟骨從冷凍柜中隨機取出所需樣品量，流水解凍，剔除表面筋膜與可見脂肪，用濾紙擦拭表面的水分，切成小碎塊;先進(jìn)行脫脂處理，將一定量的雞膝軟骨皮塊組織裝入燒杯中，以皮塊質(zhì)量為基準(zhǔn)，加入10 倍的蒸餾水，再用10%（以蒸餾水的質(zhì)量為基準(zhǔn)）異丙醇溶液室溫浸泡24 h[8]，將異丙醇溶液傾倒干凈，用蒸餾水清洗數(shù)次后密封保存?zhèn)溆?2）除雜蛋白：將經(jīng)過脫脂處理的雞膝軟骨皮塊組織裝入燒杯中，在0.1 mol/L的NaOH溶液（液料比10∶1，V/m）中浸泡6 h，溶液每3 h更換1 次，以除去雜蛋白，堿處理后的樣品用去離子水沖洗至中性[9];3）真空冷凍干燥：將制得的雞膝軟骨膠原蛋白肽提取液倒入玻璃平皿中，

在-18 ℃冰箱中冷凍24 h，確保提取液完全結(jié)冰，取出后放置于凍干機中真空冷凍干燥48 h，即得雞膝軟骨膠原蛋白肽粉末[10]，放置于干燥器中備用。

1.3.3 膠原蛋白肽得率測定

膠原蛋白肽被含有一定量氯化亞錫的鹽酸溶液水解釋放出羥脯氨酸，經(jīng)過氧化劑氯胺T氧化后，在一定溫度條件下可與對二甲氨基苯甲醛溶液反應(yīng)生成紅色絡(luò)合

物[11]，在550 nm波長處具有最大吸收峰，因此，可用紫外分光光度法進(jìn)行定量測定。羥脯氨酸含量使用羥脯氨酸（Hyp）測試盒（消化法）測定。膠原蛋白肽含量和膠原蛋白肽得率按式（1）～（2）計算。

（1）

（2）

式中：ρ為羥脯氨酸含量/（μg/mL）;V為酶提過程提取液的體積/mL;7.7為雞膝軟骨膠原蛋白肽含量與羥脯氨酸含量換算系數(shù);m為雞膝軟骨原料干質(zhì)量/g;m1為雞膝軟骨膠原蛋白肽提取液的凍干質(zhì)量/g。

1.3.4 酶的選擇

分別采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶對雞膝軟骨進(jìn)行酶提，由所得產(chǎn)物得率來反映酶提效果，并以膠原蛋白肽含量作為輔助判斷指標(biāo)，篩選出一種適用于提取雞膝軟骨中膠原蛋白肽的酶。稱取經(jīng)過預(yù)處理（脫脂和除雜）的雞膝軟骨5 份，每份約為10 g（濕質(zhì)量），控制料液比為1∶15（m/V）、超聲時間30 min、超聲功率200 W、加酶量6 000 U/g、酶提溫度45 ℃（復(fù)合蛋白酶為55 ℃），提取pH值分別為7.5（木瓜蛋白酶）、2.0（胃蛋白酶）、9.0（堿性蛋白酶）、7.0（復(fù)合蛋白酶）和7.8～8.5（胰蛋白酶），酶提時間均為6 h。

1.3.5 雞膝軟骨膠原蛋白肽提取單因素試驗設(shè)計

取雞膝軟骨流水解凍1.5 h，稱取經(jīng)過預(yù)處理（脫脂和除雜）的雞膝軟骨約5 g（濕質(zhì)量），進(jìn)行超聲波（工作時間2 s、停止時間3 s）輔助提取，最終以膠原蛋白肽得率為指標(biāo)，分別探究料液比、超聲功率、超聲時間和酶提時間4 個因素對膠原蛋白肽得率的影響，并以膠原蛋白肽含量作為單因素試驗測定結(jié)果的輔助判斷指標(biāo)。各因素水平設(shè)置如下：料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30;超聲功率分別為100、150、200、250、300 W;超聲時間分別為20、25、30、35、40 min;酶提時間分別為3.5、4.0、4.5、5.0 h。根據(jù)控制變量法的原則，設(shè)定其他條件不變，單獨變化某個因素的水平，每個因素均進(jìn)行3 次平行實驗，取平均值，探討其對膠原蛋白肽得率的影響，確定較優(yōu)取值。

1.3.5.1 料液比對膠原蛋白肽得率的影響

向裝有雞膝軟骨的燒杯中，以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30的料液比加入蒸餾水，超聲（功率200 W、時間30 min）后加入0.055 5 g堿性蛋白酶（加酶量為6 000 U/g），調(diào)節(jié)初始pH值為9.0，而后放入45 ℃恒溫水浴鍋中酶提4 h，反應(yīng)前期溶液偏堿性，先使用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至約9.0，反應(yīng)過程中溶液pH值會下降，應(yīng)使用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，保證反應(yīng)過程pH值穩(wěn)定在約9.0，100 ℃滅酶10 min，取出冷卻，10 000 r/min離心10 min，取少量上清液用羥脯氨酸試劑盒測定其中羥脯氨酸含量，并將剩余上清液真空冷凍干燥，進(jìn)一步計算膠原蛋白肽得率。

1.3.5.2 超聲功率對膠原蛋白肽得率的影響

向裝有雞膝軟骨的燒杯中，以1∶15的料液比加入蒸餾水，分別以超聲功率為100、150、200、250、300 W處理，其余步驟同1.3.5.1節(jié)。

1.3.5.3 超聲時間對膠原蛋白肽得率的影響

向裝有雞膝軟骨的燒杯中，以1∶15的料液比加入蒸餾水，以超聲功率為200 W、超聲時間分別為20、25、30、35、40 min處理，其余步驟同1.3.5.1節(jié)。

1.3.5.4 酶提時間對膠原蛋白肽得率的影響

向裝有雞膝軟骨的燒杯中，以1∶15的料液比加入蒸餾水，以超聲功率為200 W、超聲時間為30 min處理，45 ℃恒溫水浴鍋中分別酶解3.5、4.0、4.5、5.0 h，其余步驟同1.3.5.1節(jié)。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

以單因素試驗得到的結(jié)果為基礎(chǔ)，以料液比、超聲功率和酶提時間為響應(yīng)因子，進(jìn)行3因素3水平的

Box-Behnken試驗，依據(jù)回歸分析確定各工藝條件的影響因素，以膠原蛋白肽得率為響應(yīng)值，分析優(yōu)化得到最佳提取條件，試驗的各因素水平見表1。

1.3.7 雞膝軟骨膠原蛋白肽抗氧化指標(biāo)測定

1.3.7.1 ABTS陽離子自由基清除能力測定

根據(jù)周先艷等[12]的方法進(jìn)行測定，略作修改。ABTS陽離子自由基制備方法為：7 mmol/L ABTS與4.95 mmol/L

過硫酸鉀溶液進(jìn)行1∶1（V/V）混合，室溫避光反應(yīng)16 h后得到ABTS陽離子自由基儲備液，使用之前用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）稀釋約20 倍得到工作液，使得該工作液在30 ℃、734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02，

在30 ℃條件下保溫備用。取50 μL不同質(zhì)量濃度（0、2、4、6、8、10、12 mg/mL）樣品溶液與100 μL ABTS陽離子自由基工作液混勻，10 s后30 ℃水浴6 min，于734 nm波長處測定吸光度（A1），去離子水用作空白對照（A0），溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，平行測定3 次，VC（質(zhì)量濃度同樣品溶液）作陽性對照，ABTS陽離子自由基清除率按式（3）計算。

（3）

1.3.7.2 羥自由基清除能力測定

分別取不同質(zhì)量濃度（0、2、4、6、8、10、12 mg/mL）

的膠原蛋白肽溶液1 mL加入10 mL離心管中，然后依次分別加入硫酸亞鐵（2 mL，1.8 mmol/L）、水楊酸-乙醇（1.5 mL，1.8 mmol/L）和H2O2（0.1 mL，8.8 mmol/L），

在37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中孵化30 min。取200 μL反應(yīng)液于96 孔板的酶標(biāo)儀上，在510 nm波長處測定吸光度，記為A1，空白樣品為去離子水，吸光度記為A0。平行測定3 次，VC（質(zhì)量濃度同樣品溶液）作陽性對照，羥自由基清除率按式（4）計算[13]。

（4）

1.3.7.3 還原力測定

參照郭德斌等[14]的方法，略作修改。首先配制0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液和2.5 mL 1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液;分別取1 mL不同質(zhì)量濃度（0、2、4、6、8、10、12 mg/mL）的膠原蛋白肽溶液加入10 mL離心管中，然后依次加入2 mL磷酸鹽緩沖溶液和鐵氰化鉀溶液混合均勻，在50 ℃水浴鍋中保溫20 min，冷卻至室溫;加入2 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，振蕩混勻，在4 000 r/min條件下離心40 min，取2 mL上清液，加入2 mL去離子水和0.4 mL 0.1 g/100 mL FeCl3，混勻后靜置15 min（顏色由黃色變?yōu)榫G色），在700 nm波長處測定吸光度，以去離子水代替樣品作為空白對照，設(shè)置3 個平行組，VC（質(zhì)量濃度同樣品溶液）作陽性對照。還原能力用吸光度（A700 nm）表示。

1.3.7.4 Fe2+螯合能力測定

參照周先艷等[12]的方法，吸取3 mL不同質(zhì)量濃度（0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18 mg/mL）的膠原蛋白肽溶液于10 mL離心管中，加入0.1 mL 2 mmol/L的FeCl2混勻，室溫放置5 min，加入0.2 mL 5 mmol/L菲啰嗪-鈉鹽（Ferrozine）試劑，而后放置30 min，在561 nm波長處測定吸光度，平行測定3 次，F(xiàn)e2+螯合率按式（5）計算。

（5）

式中：A對照為3.0 mL水+0.1 mL FeCl2+0.2 mL Ferrozine試劑的吸光度;A樣品對照為3.0 mL水+0.1 mL FeCl2+0.2 mL水的吸光度;A樣品為3.0 mL樣品+0.1 mL FeCl2+0.2 mL Ferrozine試劑的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，運用單因素ANOVA-圖基法對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素檢驗分析，P<0.05表示2 組數(shù)據(jù)間具有顯著性差異。Design-Expert 8.0.6軟件用于響應(yīng)面分析，得出最優(yōu)提取值，所有實驗均重復(fù)

3 次，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞膝軟骨基礎(chǔ)成分

將雞膝軟骨清洗后進(jìn)行基礎(chǔ)成分分析，由表2可知，雞膝軟骨中蛋白質(zhì)含量為42.69%，脂肪含量為38.89%，雞膝軟骨中蛋白質(zhì)含量較高，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，有利于后期膠原蛋白肽的提取與優(yōu)化[15]。

2.2 酶的選擇結(jié)果

小寫字母不同，表示差異顯著（P<0.05）。圖2～5同。

由圖1可知，以酶提所得膠原蛋白肽得率為指標(biāo)，5 種酶提取雞膝軟骨膠原蛋白肽的能力高低順序為堿性蛋白酶>胰蛋白酶>復(fù)合蛋白酶>胃蛋白酶>木瓜蛋白酶，即堿性蛋白酶作用最為顯著，所得膠原蛋白肽含量也最高，因此選用堿性蛋白酶提取雞膝軟骨膠原蛋白肽。對膠原有作用的蛋白酶頗多，但為獲得較高的經(jīng)濟價值，在選取酶的時候一般要考慮酶對膠原作用的強弱及酶的價格[16]。此外，還需考慮酶對膠原的作用位點，這將直接影響最后水解產(chǎn)物分子質(zhì)量的分布狀況。蛋白水解酶按作用位點可分為內(nèi)切酶和外切酶，本研究使用的酶多是內(nèi)切酶，主要作用于蛋白質(zhì)的內(nèi)部肽鍵上，使蛋白質(zhì)水解為小肽。木瓜蛋白酶優(yōu)先斷裂與Arg、Lys、Phe連接的肽鍵，終產(chǎn)物以長肽為主[17];胰蛋白酶對Arg和Lys的肽鍵具有選擇性水解作用，終產(chǎn)物以短肽為主[18];

胃蛋白酶主要作用于芳香族氨基酸或酸性氨基酸中氨基所組成的肽鍵，能較為完整地保留膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)和生物活性[19];堿性蛋白酶屬于內(nèi)切酶，作用于肽鏈的中間，生成2 個肽，主要酶切位點為Tyr、Phe、Trp，比中性蛋白酶水解能力強，作用底物更加廣泛[20]。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 料液比對膠原蛋白肽得率的影響分析

適宜的料液比對膠原蛋白肽的提取至關(guān)重要，不同的料液比意味著不同的提取液體積，其會直接影響酶的濃度與酶-底物絡(luò)合程度。由圖2可知，雞膝軟骨膠原蛋白肽得率在料液比1∶5～1∶25時呈穩(wěn)步上升趨勢，當(dāng)料液比達(dá)到1∶25時，其得率達(dá)到最大值，而后隨著料液比增加，膠原蛋白肽得率略有下降，漸趨穩(wěn)定。當(dāng)樣品量一定時，需保證蒸餾水沒過樣品，為酶提供更多的作用位點，使反應(yīng)進(jìn)行完全，所以料液比在一定區(qū)間內(nèi)，膠原蛋白肽得率隨著料液比的增加而增加;由于加入酶和雞膝軟骨塊的質(zhì)量是一定的，不同的料液比會影響其濃度，間接影響酶解速率，當(dāng)料液比達(dá)到1∶25時，雞膝軟骨組織逐漸疏松，此時繼續(xù)增大料液比，對整個反應(yīng)體系來說酶的濃度降低，其與底物的結(jié)合無法達(dá)到最佳狀態(tài)，膠原蛋白肽得率不再增加且略有下降，因此，最佳料液比選定為1∶25。料液比對膠原蛋白肽得率影響總體呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，這與萬麗娟等[21]研究中所描述的一致。

2.3.2 超聲功率對膠原蛋白肽得率的影響分析

超聲波技術(shù)具有綠色環(huán)保和高效省時的特點。由圖3可知，雞膝軟骨膠原蛋白肽得率在超聲功率為100～250 W時增長迅速，當(dāng)超聲功率為250 W時，膠原蛋白肽得率達(dá)到峰值，后隨著超聲功率的增加，膠原蛋白肽得率開始下降。適宜的超聲功率所產(chǎn)生的超聲波可加快水的振動且加大細(xì)胞的破碎程度，促進(jìn)后續(xù)酶的進(jìn)入，利于酶提反應(yīng)的進(jìn)行。楊萌萌等[22]將超聲波技術(shù)應(yīng)用于提取牛蹄筋的酶溶性膠原蛋白，研究超聲功率、超聲時間和加酶量對提取率的影響，得出在最佳條件下提取率提高10.69%。在超聲強度較低時，超聲波強度越大，所產(chǎn)生的空化效應(yīng)越明顯，但當(dāng)超聲強度增加到一定程度后，產(chǎn)生高溫現(xiàn)象，對樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成破壞，因此，最佳超聲功率選定為250 W。

2.3.3 超聲時間對膠原蛋白肽得率的影響分析

隨著超聲時間的延長，產(chǎn)生的空化效應(yīng)愈加強烈，有利于酶溶入樣品，加快膠原蛋白肽的提取。由圖4可知，雞膝軟骨膠原蛋白肽得率隨著超聲時間延長的變化相較于其他因素略不顯著。超聲時間20～25 min，雞膝軟骨膠原蛋白肽得率增加，這是由于超聲波在細(xì)胞內(nèi)引起渦流擴散，加大細(xì)胞內(nèi)外有效成分的濃度差，加速細(xì)胞溶質(zhì)傳質(zhì)速率，雞膝軟骨中大量膠原蛋白迅速溶出。超聲時間大于25 min后，超聲熱效應(yīng)愈加明顯，一些膠原發(fā)生變性，使溶解度逐漸降低，導(dǎo)致膠原蛋白肽得率開始下降，因此超聲時間25 min為試驗最佳值。

2.3.4 酶提時間對膠原蛋白肽得率的影響分析

酶作為一種生物催化劑，對底物的催化能力存在一定的飽和度，酶提時間反映酶與底物的接觸時間，影響膠原蛋白肽最終得率。由圖5可知，雞膝軟骨膠原蛋白肽得率在酶提時間3.5～4.0 h為遞增趨勢，隨著酶提時間的延長，底物與酶充分接觸，有利于膠原蛋白肽的提取。當(dāng)酶提時間為4.0 h時，膠原蛋白肽得率達(dá)到最大值，而后隨著酶提時間的延長，膠原蛋白肽得率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。這是由于酶量一定時，酶提時間越長，部分膠原蛋白肽發(fā)生水解;當(dāng)酶提時間小于4.0 h時，由于酶反應(yīng)緩慢，膠原蛋白肽溶液質(zhì)量濃度較低，膠原蛋白肽得率隨反應(yīng)時間延長而增加;當(dāng)酶提時間大于4.0 h時，酶反應(yīng)過度，部分膠原蛋白肽開始繼續(xù)水解，使膠原蛋白肽的產(chǎn)品質(zhì)量下降，膠原蛋白肽得率逐漸趨于平穩(wěn)，不再上升。因此，最佳酶提時間為4.0 h。這與王金梅等[23]使用超聲輔助酶法提取草魚皮膠原蛋白研究中的結(jié)論相符。

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.4.1 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性檢驗

通過Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)處理軟件對表3結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到A、B、C 3 個因素與Y之間的回歸方程，多元二次回歸模型方程為Y=43.19+0.66A+1.05B-0.46C+0.37AB-1.53AC+1.85BC-1.39A2-8.67B2-6.43C2。

由表4可知：模型的F=288.45>F0.01（14，4）=14.4，

P<0.000 1，表明本研究的模型高度顯著，不同處理間的差異極顯著;失擬項P>0.05，說明模型失擬度不顯著;模型的決定系數(shù)R2=0.979 2，實驗值與預(yù)測值非常接近，其線性關(guān)系和二次關(guān)系是極顯著的

（P<0.000 1），說明該模型可很好地解釋響應(yīng)值。模型的調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.993 9，說明該模型能解釋99.39%響應(yīng)值的變化，因而擬合程度較好，實驗誤差小，可用此模型對超聲波輔助酶法提取雞膝軟骨中膠原蛋白肽進(jìn)行分析和預(yù)測。對模型進(jìn)行方差分析，一次項A、B、C顯著（P<0.05）;交互項BC極顯著（P=0.000 1），AC顯著（P=0.000 3），AB不顯著（P=0.162 3）;二次項B2（P<0.000 1）和C2（P<0.000 1）極顯著，A2顯著（P=0.000 5）。表明料液比、超聲功率和酶提時間每個單一因素均對雞膝軟骨膠原蛋白肽得率具有顯著影響;超聲功率和酶提時間交互作用對雞膝軟骨膠原蛋白肽得率具有極顯著影響，料液比和酶提時間交互作用對雞膝軟骨膠原蛋白肽得率具有顯著影響。

2.4.2 各因素交互作用分析

由圖6可知，料液比和超聲功率的交互作用不顯著（P=0.162 3），膠原蛋白肽得率不受料液比和超聲功率的共同影響，但受到單個因素的影響。當(dāng)料液比為1∶26.39、超聲功率為253.04 W時，膠原蛋白肽得率可達(dá)到最大值43.32%。

由圖7可知，料液比和酶提時間交互作用顯著（P=0.000 3），膠原蛋白肽得率受料液比和酶提時間的共同影響。當(dāng)料液比為1∶26.39、酶提時間為3.97 h，膠原蛋白肽得率可達(dá)到最大值43.32%。

由圖8可知，超聲功率和酶提時間交互作用極顯著（P=0.000 1），膠原蛋白肽得率受超聲功率和酶提時間的共同影響。超聲功率為253.04 W、酶提時間為3.97 h時，膠原蛋白肽得率可達(dá)到最大值43.32%。

通過響應(yīng)曲面陡峭程度和三維等高線的形狀可直觀地判斷兩因素間交互作用程度。對比圖6～8各響應(yīng)面的陡峭程度和等高線的形狀可知，圖6整個坡面相對較緩，說明料液比和超聲功率的交互作用對膠原蛋白肽得率影響不大，圖7和圖8的響應(yīng)面圖坡面均較陡，圖8最陡，可得出料液比和酶提時間的交互作用對膠原蛋白肽得率影響較大，超聲功率和酶提時間的交互作用對膠原蛋白肽得率影響最大，這與方差分析的結(jié)果一致。所有的響應(yīng)曲面圖均開口朝下，這也說明試驗結(jié)果有最大值存在。

2.4.3 雞膝軟骨膠原蛋白肽提取工藝參數(shù)的優(yōu)化和模型驗證

通過響應(yīng)面法得到雞膝軟骨膠原蛋白肽的最優(yōu)提取工藝為料液比1∶26.39、超聲功率253.04 W、酶提時間3.97 h，預(yù)測膠原蛋白肽得率為43.32%?？紤]到實際工藝條件，將參數(shù)調(diào)整為料液比1∶26、超聲功率253 W、酶提時間4 h，為了進(jìn)一步驗證模型的可靠性，在此條件下進(jìn)行3 次平行實驗，膠原蛋白肽得率為42.83%，與理論值較為接近，說明該響應(yīng)面模型可用于優(yōu)化雞膝軟骨中膠原蛋白肽的提取工藝。

2.5 雞膝軟骨膠原蛋白肽體外抗氧化活性

2.5.1 ABTS陽離子自由基清除能力測定結(jié)果

ABTS陽離子自由基清除率目前已廣泛應(yīng)用于評價抗氧化能力。由圖9可知：雞膝軟骨膠原蛋白肽和VC的ABTS陽離子自由基清除率均隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，其中VC在2 mg/mL達(dá)到最大值，約為86%，之后隨著質(zhì)量濃度的增加，基本維持該值不變;雞膝軟骨膠原蛋白肽質(zhì)量濃度2 mg/mL時，ABTS陽離子自由基清除率為22.32%，約為VC的1/4，質(zhì)量濃度大于2 mg/mL后，其ABTS陽離子自由基清除率明顯處于上升趨勢，半抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為8 mg/mL，表明雞膝軟骨膠原蛋白肽有較好的ABTS陽離子自由基清除能力。周先艷等[12]在關(guān)于羅非魚皮膠原蛋白水解產(chǎn)物的體外抗氧化性分析中得出，羅非魚皮膠原蛋白對ABTS陽離子自由基的清除活性隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增大，二者呈線性相關(guān)，IC50為132.4 μg/mL。再結(jié)合尹劍等[24]研究可知，水產(chǎn)動物膠原蛋白肽的ABTS陽離子自由基清除能力可能比畜產(chǎn)動物膠原蛋白肽強。

2.5.2 羥自由基清除能力測定結(jié)果

生物體內(nèi)存在的H2O2極易裂解產(chǎn)生羥自由基，但羥自由基屬于生物需氧代謝過程生成的具有強氧化能力的帶氧自由基。羥自由基是當(dāng)前已知活性氧中對生物體毒性最強的一種自由基，因此研究具有羥自由基清除能力的物質(zhì)至關(guān)重要[25]。有相關(guān)研究報道：多肽序列中的精氨酸、甘氨酸、脯氨酸可能與羥自由基清除能力相關(guān)[26]。

由圖10可知：質(zhì)量濃度0～2 mg/mL時，VC的羥自由基清除率迅速上升，約為雞膝軟骨膠原蛋白肽的4 倍，質(zhì)量濃度大于2 mg/mL后，其羥自由基清除率基本趨于穩(wěn)定;雞膝軟骨膠原蛋白肽質(zhì)量濃度2～12 mg/mL時，羥自由基清除率呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢，即隨著膠原蛋白肽質(zhì)量濃度的增加而增加，IC50約為8.5 mg/mL，表明經(jīng)過優(yōu)化工藝提取的雞膝軟骨膠原蛋白肽具有較好的羥自由基清除能力。符群[27]在關(guān)于雞骨膠原蛋白肽的抗氧化性研究中表明，在1～32 mg/mL范圍內(nèi)，雞骨膠原蛋白肽對羥自由基的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，其IC50達(dá)到4.85 mg/mL，與本研究結(jié)果趨勢一致。

2.5.3 還原能力測定結(jié)果

考察物質(zhì)的抗氧化性時，還原能力測定一般作為自由基清除法的輔助手段[28]。研究表明，被測樣品的還原能力與它表現(xiàn)出來的抗氧化活性密切相關(guān)，因為還原作用可供出電子，清除自由基，從而表現(xiàn)出抗氧化性[29]。

由圖11可知：隨著溶液質(zhì)量濃度的增加，VC與雞膝軟骨膠原蛋白肽A700 nm都在不斷遞增，即VC和雞膝軟骨膠原蛋白肽的還原能力均在增強;在質(zhì)量濃度約為2 mg/mL時，VC的A700 nm約為膠原蛋白肽的4.5 倍，但在大于2 mg/mL

后，VC的A700 nm基本沒有變化，但雞膝軟骨膠原蛋白肽的A700 nm一直處于平穩(wěn)增長的狀態(tài)。雞膝軟骨膠原蛋白肽還原能力較強，可能是因為一些能與氧化物質(zhì)反應(yīng)的氨基酸殘基由于蛋白質(zhì)水解被暴露出來。張小娟[30]研究牛皮膠原蛋白的水解物及其抗氧化性得出，牛皮膠原蛋白肽的還原能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，在質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL時還原能力最大，其還原能力與DPPH自由基清除能力測定結(jié)果相一致。

2.5.4 Fe2+螯合能力測定結(jié)果

膠原蛋白肽組分中含有酸性氨基酸，其側(cè)鏈羧基可螯合金屬離子，從而鈍化金屬離子的氧化作用，弱化自由基鏈反應(yīng)，達(dá)到抗氧化的目的[31]。金屬離子螯合率越大，則其抗氧化性越強。由圖12可知，隨著膠原蛋白肽溶液質(zhì)量濃度的增加，其對Fe2+的螯合率不斷增強，質(zhì)量濃度0～0.08 mg/mL時，螯合率的上升速率最快，但0.08 mg/mL之后處在較平穩(wěn)上升階段。雞膝軟骨膠原蛋白肽對Fe2+的螯合率最大可達(dá)到79.26%，說明產(chǎn)物具有較高的Fe2+螯合能力。這與Janet等[32]關(guān)于菜豆堿性蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化性研究中得出木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物均具有較高的Fe2+螯合能力結(jié)論一致。

3 結(jié) 論

以膠原蛋白肽得率為考察對象，通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗，對雞膝軟骨中膠原蛋白肽的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝為料液比1∶26（m/V）、超聲功率253 W、酶提時間4 h。影響雞膝軟骨膠原蛋白肽得率的因素順序為超聲功率>料液比>酶提時間，超聲波輔助提取雞膝軟骨膠原蛋白肽得率可達(dá)42.83%，符合響應(yīng)面模型預(yù)測結(jié)果。

抗氧化能力測定結(jié)果顯示：經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化參數(shù)提取的雞膝軟骨膠原蛋白肽在ABTS陽離子自由基清除能力、羥自由基清除能力、還原能力和金屬離子螯合能力等方面均表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。綜上所述，雞膝軟骨膠原蛋白肽有良好的加工性能和一定的抗氧化性能，本研究為雞爪及其相關(guān)資源的高值化利用提供了理論依據(jù)，對膠原蛋白肽的抗氧化活性進(jìn)行基礎(chǔ)研究，其抗菌活性、增強免疫力和降血壓等生物特性還有待進(jìn)一步探究。

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