王飄，鄭晴，胡婷，張海銀，許言午，包怡敏

基于PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的三七總皂苷調(diào)控自噬抗H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷機(jī)制研究

王飄，鄭晴，胡婷，張海銀，許言午，包怡敏

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203

探討三七總皂苷（PNS）能否通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控自噬從而減輕H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷機(jī)制。將H9c2細(xì)胞分為正常組、缺氧/復(fù)氧（A/R）組、A/R＋PNS組、A/R＋PNS＋雷帕霉素（Rapa）組、A/R＋Rapa組、A/R＋羥氯喹（HCQ）組、A/R＋3-甲基腺嘌呤（3-MA）組。通過缺氧6 h、復(fù)氧2 h建立H9c2細(xì)胞A/R模型。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞損傷，Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Atg5、p62、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白PI3K、Akt、mTOR的表達(dá)，熒光法觀察細(xì)胞自噬流。與正常組比較，A/R組H9c2細(xì)胞存活率明顯下降，細(xì)胞損傷率明顯升高（＜0.05），自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin-1表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高（＜0.05），自噬體和自噬溶酶體數(shù)量顯著增加，自噬流顯著增強(qiáng)（＜0.05）；與A/R組比較，用PNS預(yù)處理后，H9c2細(xì)胞存活率明顯上升，細(xì)胞損傷率明顯降低（＜0.05），自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin-1表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯降低（＜0.05），p62蛋白表達(dá)明顯升高，與自噬抑制劑HCQ、3-MA作用相似，熒光結(jié)果顯示，PNS對(duì)自噬流有明顯抑制作用（＜0.05）；PNS預(yù)處理后p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.05）。PNS能有效減輕H9c2細(xì)胞A/R損傷，其機(jī)制與激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路從而抑制自噬流相關(guān)。

三七總皂苷；缺氧/復(fù)氧損傷；自噬；PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路；H9c2細(xì)胞

缺血性心臟病發(fā)病率逐年上升，迄今已成為發(fā)病率及致死率最高的疾病之一[1]。雖通過藥物或手術(shù)等手段可達(dá)到恢復(fù)血流灌注的目的[2]，但恢復(fù)過程中可引起不可逆的心肌組織損傷，即心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）[3]。目前研究表明，細(xì)胞自噬作為內(nèi)源性調(diào)節(jié)機(jī)制參與到MIRI過程中[4]，抑制過度自噬可減輕MIRI[5]。研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可抑制自噬并減少細(xì)胞氧化應(yīng)激的發(fā)生[6-7]。中藥毒副作用小、安全性高，對(duì)MIRI防治效果較好?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，三七主要成分三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）能通過抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等途徑減輕MIRI[8-9]，但其能否通過調(diào)節(jié)自噬減輕MIRI仍不清楚。因此，本研究通過觀察PNS對(duì)缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞的影響，運(yùn)用自噬激動(dòng)劑及自噬抑制劑等工具藥，觀察PNS對(duì)自噬流的作用，探討PNS能否通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控自噬流，從而達(dá)到減輕MIRI的目的。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和藥物

H9c2細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。血栓通注射液（成分PNS），昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)13HK03；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA），MCE，批號(hào)HY-19312；自噬抑制劑羥氯喹（HCQ），Selleck，批號(hào)S4430；自噬激動(dòng)劑雷帕霉素（Rapa），MCE，批號(hào)HY-10219。

1.2 主要試劑與儀器

CCK-8，上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào)40203ES76；乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒，同仁化學(xué)研究所，批號(hào)CK12；DAPRed，同仁化學(xué)研究所，批號(hào)D677；DALGreen，同仁化學(xué)研究所，批號(hào)D675；SQSTM1/p62（CST，貨號(hào)5114s）、Beclin-1（CST，貨號(hào)3495s）、LC3B/MAP1LC3B（Novus，貨號(hào)NB100-2220）、Atg 5（CST，貨號(hào)12994s）、Akt（CST，貨號(hào)4691s）、p-Akt（CST，貨號(hào)4060s）、PI3K（CST，貨號(hào)4257S）、p-PI3K（Abcam，貨號(hào)ab182651）、mTOR（CST，貨號(hào)2983S）、p-mTOR（CST，貨號(hào)5536S）抗體。全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，上海天能公司，型號(hào)Tanon-2500；激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)徠卡，型號(hào)TCS SP8；細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Scientific，型號(hào)class100；超凈臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備公司，型號(hào)SW-CS-IFD。

1.3 分組、造模及給藥

將H9c2細(xì)胞分為正常組、缺氧/復(fù)氧（A/R）組、A/R＋PNS組、A/R＋PNS＋Rapa組、A/R＋Rapa組、A/R＋HCQ組、A/R＋3-MA組。造模前H9c2細(xì)胞分別用含PNS（100 μg/mL）、Rapa（50 nmol/L）、HCQ（50 μmol/L）、3-MA（5 mmol/L）的培養(yǎng)液處理2 h。A/R模型制備時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含/不含藥物的無血清培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿置于缺氧條件下（95%N2和5%CO2）培養(yǎng)6 h，之后培養(yǎng)液更換為含/不含藥物的正常培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。正常組細(xì)胞正常條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。

1.4 細(xì)胞存活率檢測(cè)

將細(xì)胞按1×105個(gè)/孔鋪于96孔板，另設(shè)只添加培養(yǎng)液的空白組。造模前PNS組根據(jù)藥物濃度梯度給藥2 h；缺氧前PNS組和A/R組分別更換為含/不含藥物的無血清培養(yǎng)液；缺氧6 h后，更換為含/不含藥物的正常培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h；2 h后每孔加入10 μL CCK-8，培養(yǎng)1 h，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）＝（模型組OD值－空白組OD值）÷（正常組OD值－空白組OD值）×100%。

1.5 細(xì)胞損傷率檢測(cè)

根據(jù)LDH試劑盒說明書配制工作液。造模完成后，每孔加100 μL工作液，用鋁箔紙包裹96孔板，避光室溫反應(yīng)30 min；反應(yīng)結(jié)束后每孔加50 μL終止液，并于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)OD值，計(jì)算細(xì)胞損傷率。細(xì)胞損傷率（%）＝（模型組OD值－空白組OD值）÷（正常組OD值－空白組OD值）×100%。

1.6 細(xì)胞自噬熒光檢測(cè)

將細(xì)胞按2×105個(gè)/皿鋪于激光共聚焦專用皿中，培養(yǎng)24 h；依次使用1 μmol/L紅色熒光（DAPRed）和0.5 μmol/L綠色熒光（DALGreen）在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min[10]；隨后進(jìn)行A/R造模，最后在相同條件下使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光圖片拍攝。自噬體被DAPRed染色，自噬溶酶體被DALGreen染色。根據(jù)紅綠熒光強(qiáng)度判斷細(xì)胞自噬體、自噬溶酶體數(shù)量和自噬流的變化。

1.7 Western blot檢測(cè)

造模結(jié)束后收集細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清得細(xì)胞總蛋白；BCA法檢測(cè)蛋白濃度。蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1 h，加入稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑顯影蛋白條帶，Image J軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 三七總皂苷對(duì)模型細(xì)胞存活率及損傷率的影響

與正常組比較，A/R組H9c2細(xì)胞存活率明顯降低（＜0.05），細(xì)胞損傷率明顯升高（＜0.05）；與A/R組比較，PNS濃度為100、200 μg/mL時(shí)，H9c2細(xì)胞存活率明顯升高（＜0.05）；PNS濃度為50、100、200 μg/mL時(shí)，H9c2細(xì)胞損傷率明顯降低（＜0.05）。見圖1、圖2。綜合細(xì)胞存活率及損傷率結(jié)果可以看出，濃度為100 μg/mL PNS減輕A/R損傷效果最顯著。

注：與正常組比較，*P＜0.05；與A/R組比較，#P＜0.05

注：與正常組比較，*P＜0.05；與A/R組比較，#P＜0.05

2.2 三七總皂苷對(duì)模型細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，A/R組H9c2細(xì)胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；與A/R組比較，PNS預(yù)處理后，H9c2細(xì)胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），見圖3。

注：A.正常組；B. A/R組；C. A/R＋PNS組；與A/R組比較；#P＜0.05

2.3 三七總皂苷對(duì)模型細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，A/R組H9c2細(xì)胞Atg5、Beclin-1蛋白表達(dá)明顯升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著增加（＜0.05），p62蛋白表達(dá)無明顯變化；與A/R組比較，A/R＋PNS組H9c2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin-1表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著降低（＜0.05），p62蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.05），見圖4。表明PNS對(duì)自噬有明顯抑制作用，且可能抑制自噬流，其作用與自噬抑制劑HCQ和3-MA一致。此外，A/R＋PNS＋Rapa組H9c2細(xì)胞Atg5、Beclin-1蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯低于A/R＋Rapa組，提示PNS逆轉(zhuǎn)了Rapa增強(qiáng)自噬的作用。

2.4 三七總皂苷對(duì)模型細(xì)胞自噬流的影響

使用自噬熒光染料標(biāo)記H9c2細(xì)胞，DAPRed代表自噬體，DALGreen代表自噬溶酶體。結(jié)果顯示，正常組DAPRed和DALGreen熒光強(qiáng)度較弱，表明此時(shí)自噬程度較低。經(jīng)A/R造模后各組DAPRed和DALGreen熒光強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)，見圖5a，表明A/R后自噬增強(qiáng)。結(jié)果顯示，A/R組和A/R＋Rapa組DAPRed和DALGreen熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（＜0.05），表明自噬流水平顯著增加；與A/R組比較，A/R＋PNS組和A/R＋3-MA組DAPRed熒光強(qiáng)度明顯降低（＜0.05），見圖5b，表明此時(shí)自噬體形成較少，但PNS無3-MA作用強(qiáng)。A/R＋PNS組和A/R＋HCQ組DALGreen熒光強(qiáng)度明顯低于A/R組（＜0.05），見圖5c，表明此時(shí)自噬溶酶體數(shù)量減少，其可能與前期對(duì)自噬體生成抑制有關(guān)；也可能是PNS與HCQ作用效果一致，即對(duì)自噬溶酶體形成產(chǎn)生抑制作用。此外，A/R＋PNS＋Rapa組DALGreen熒光強(qiáng)度明顯低于A/R＋Rapa組（＜0.05），表明PNS可能通過抑制自噬溶酶體形成逆轉(zhuǎn)Rapa的作用。綜合自噬蛋白表達(dá)與熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PNS可通過抑制自噬體及自噬溶酶體的形成抑制自噬流。

A.正常組；B. A/R組；C. A/R＋PNS組；D. A/R＋PNS＋Rapa組；E. A/R＋Rapa組；F. A/R＋HCQ組；G. A/R＋3-MA組；與正常組比較，*P＜0.05；與A/R組比較，#P＜0.05；與A/R＋Rapa組比較，▲P＜0.05

注：A.正常組；B. A/R組；C. A/R＋PNS組；D. A/R＋PNS＋Rapa組；E. A/R＋Rapa組；F. A/R＋HCQ組；G. A/R＋3-MA組；與正常組比較，*P＜0.05；與A/R組比較，#P＜0.05；與A/R＋Rapa組比較，▲P＜0.05

3 討論

心肌缺血再灌注可引起心肌細(xì)胞損傷甚至死亡，表現(xiàn)為心功能下降、心律失常等。本研究采用H9c2細(xì)胞制備A/R模型，模擬在體心肌缺血/再灌注模型，觀察PNS對(duì)A/R損傷細(xì)胞的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A/R后H9c2細(xì)胞存活率明顯下降，100、200 μg/mL PNS處理后細(xì)胞存活率明顯升高。除細(xì)胞活力檢測(cè)外，細(xì)胞培養(yǎng)液LDH含量檢測(cè)也能部分反映細(xì)胞損傷情況。LDH在細(xì)胞受損或死亡時(shí)被釋放到細(xì)胞外環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度PNS處理細(xì)胞后，其培養(yǎng)液中LDH含量呈劑量依賴性降低，且濃度為50、100、200 μg/mL時(shí)較A/R組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明此濃度PNS對(duì)H9c2細(xì)胞A/R損傷有一定的改善作用。

現(xiàn)有研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可能因損傷、氧化應(yīng)激等刺激而被激活[11]，是保護(hù)心肌減輕MIRI的有效手段之一。此外，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活與自噬的發(fā)生密切相關(guān)[12]。當(dāng)發(fā)生MIRI時(shí)，PI3K被激活并可上調(diào)自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，包括Akt，PI3K可磷酸化Akt的Thr308和Ser473位點(diǎn)使Akt活化[13-14]，而活化的Akt可磷酸化mTOR[15]。mTOR是細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其mTORC1亞型也是自噬過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的上游活性因子之一[16]。磷酸化的mTOR可通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制由局部缺血誘導(dǎo)的瞬時(shí)自噬，從而降低MIRI[17-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A/R組p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表達(dá)無明顯變化，PNS組p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表達(dá)顯著升高，表明PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被激活。

為探討PNS能否通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控自噬，本研究進(jìn)行了自噬相關(guān)實(shí)驗(yàn)。心肌缺血時(shí)自噬增強(qiáng)，以清除受損的細(xì)胞器和細(xì)胞；再灌注時(shí)過高水平的自噬則加速心肌細(xì)胞死亡，導(dǎo)致MIRI[19]。自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin-1表達(dá)水平可反映細(xì)胞自噬起始階段的變化情況[20-21]。LC3存在于自噬小體，同時(shí)也對(duì)自噬體形成具有重要作用[22]，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3Ⅰ大量轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3Ⅱ，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加[23]。本研究中，A/R組H9c2細(xì)胞Atg5、Beclin-1蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高，表明此時(shí)自噬水平上升；而PNS處理后H9c2細(xì)胞Atg5、Beclin-1表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯降低，表明PNS逆轉(zhuǎn)了A/R所致的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)升高的趨勢(shì)，對(duì)自噬有一定的抑制作用。p62作為自噬下游階段的經(jīng)典標(biāo)志物之一，也可反映自噬的變化，其可與自噬體內(nèi)膜上的泛素化底物和LC3結(jié)合，并通過在溶酶體系統(tǒng)中形成自噬溶酶體而被降解[24]。當(dāng)自噬被抑制時(shí)，p62蛋白表達(dá)升高[25]。本研究結(jié)果顯示，PNS預(yù)處理后，H9c2細(xì)胞p62蛋白表達(dá)明顯升高，結(jié)合LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的變化，推測(cè)自噬體與溶酶體結(jié)合受阻，自噬流處于被抑制狀態(tài)。

為探明PNS對(duì)自噬流的作用，我們通過自噬熒光檢測(cè)自噬體和自噬溶酶體的形成情況，觀察PNS對(duì)自噬流上下游環(huán)節(jié)的作用。細(xì)胞自噬熒光檢測(cè)試劑可觀察自噬流的整個(gè)過程，以DAPRed標(biāo)記自噬體，其熒光強(qiáng)度較弱時(shí)，表明自噬體數(shù)量較少；以DALGreen標(biāo)記自噬溶酶體，其熒光強(qiáng)度弱時(shí)，表明自噬溶酶體數(shù)量較少，其生成可能受阻或被過度降解。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組DAPRed和DALGreen熒光強(qiáng)度較弱，表明自噬程度較低；A/R組H9c2細(xì)胞DAPRed和DALGreen熒光強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)，表明A/R可顯著增強(qiáng)自噬流。與A/R組比較，A/R＋PNS組和A/R＋3-MA組DAPRed熒光強(qiáng)度明顯降低，表明PNS與3-MA作用相似，即可抑制自噬體形成和發(fā)展[26]；由于PNS不能完全抑制自噬體的形成，因此使用自噬抑制劑HCQ，結(jié)果顯示，A/R＋PNS組和A/R＋HCQ組DALGreen熒光強(qiáng)度明顯降低，表明PNS與HCQ作用相似，可能抑制自噬溶酶體形成[27]。此外，A/R＋PNS＋Rapa組DALGreen熒光強(qiáng)度低于A/R＋Rapa組，表明PNS可通過抑制自噬溶酶體發(fā)揮逆轉(zhuǎn)Rapa的作用。綜合自噬蛋白表達(dá)及熒光結(jié)果，表明PNS影響自噬流的上下游環(huán)節(jié)，抑制自噬體及自噬溶酶體的形成，從而抑制自噬流。

綜上，PNS可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制自噬流，發(fā)揮對(duì)A/R H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用，從而達(dá)到減輕MIRI保護(hù)心臟的作用。

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Study on Panax Notoginseng Saponins Regulate Autophagy Against H9c2 Cells Anoxia/reoxygenation Injury via PI3K/Akt/mTOR Signaling Pathway

WANG Piao, ZHENG Qing, HU Ting, ZHANG Haiyin, XU Yanwu, BAO Yimin

To explore mechanism whether Panax notoginseng saponins (PNS) can regulate autophagy through the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway to reduce anoxia/reoxygenation (A/R) injury of H9c2 cells.H9c2 cells were divided into seven groups: control, anoxia-reoxygenation (A/R), A/R+PNS, A/R+PNS+ Rapamycin (Rapa), A/R+Rapa, A/R+hydroxychloroquine (HCQ), and A/R+3-methyladenine (3-MA). The A/R model of H9c2 cells was established by anoxia for 6 h and reoxygenation for 2 h. Cell survival rate was detected by CCk-8 method; cell damage was detected by LDH detection kit; autophagy-related proteins of Atg5, p62, Beclin-1, LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and PI3K/Akt/mTOR signaling pathway related proteins PI3K, Akt, mTOR expression were detected by Western blot; autophagy flow was observed by fluorescence.Compared with the control group, the cell viability of A/R group was decreased significantly while the cell damage rate was increased (<0.05). The expressions of autophagy-related proteins Atg5, Beclin-1 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio were increased significantly (<0.05); The numbers of autophagosome and autolysosome increased significantly, and the level of autophagic flow increased significantly (<0.05). Compared with the A/R group, PNS preconditioning increased cell viability, reduced cell damage rate (<0.05); The expressions of Atg5, Beclin-1, and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio were reduced significantly (<0.05), and the expression of p62 was increased significantly, which were similar to the autophagy inhibitors HCQ and 3-MA; Autophagy fluorescence detection also revealed an inhibition of autophagic flow (<0.05). The expressions of p-PI3K, p-Akt and p-mTOR protein were increased after PNS preconditioning (<0.05).PNS can effectively reduce A/R damage in H9c2 cells, and its mechanism is related to the inhibition of autophagic flow by activating the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

Panax notoginseng saponins; anoxia/reoxygenation injury; autophagy; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; H9c2 cells

R285.5

A

1005-5304(2021)08-0087-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202012070

國(guó)家自然科學(xué)基金（81303256）

包怡敏，E-mail：yiminbao@163.com

（收稿日期：2020-12-04）

（修回日期：2021-01-05；編輯：華強(qiáng)）