梁雪，田芳，蔡小堃，毛穎異，Nick A.Cellar，趙艷榮，朱惠蓮

（1.雅培營養(yǎng)中國研發(fā)中心，上海200233；2.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)學(xué)系，廣州510080；3.雅培營養(yǎng)品，美國 哥倫布OH 43219）

0 引 言

磷脂是一類存在于生物界的含磷脂質(zhì)，母乳和牛乳中磷脂主要包括磷脂酰乙醇胺（PE），磷脂酰肌醇（PI），磷脂酰絲氨酸（PS），磷脂酰膽堿（PC）和鞘磷脂（SM）5大類[1]。目前，乳制品磷脂總含量的測定主要采用稱重法[2-3]、比色法[4]、紫外分光光度[5]和紅外光譜(FTIR)法[6]等，而磷脂不同組分的分離和測定的方法有薄層層析色譜法（TLC）[7]、核磁共振波譜法（NMR）[8]和高效液相色譜法（HPLC）[9-10]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)[11]。HPLC-ELSD法普遍用于檢測牛奶、乳制品[12-18]和母乳[19-20]的磷脂，而檢測母乳中磷脂的研究中，只有Giuffrida等人[20]對母乳基質(zhì)中的方法進行驗證，但沒有提供磷脂的檢測限（LOD）和定量限（LOQ）的數(shù)據(jù)信息，并且PI和PS的分析范圍可能需要改進，以滿足母乳中這兩種較低水平磷脂的定量測定需要。因此，建立磷脂含量的準確、高效及簡便的測定方法是目前仍需解決的問題。

本文建立并優(yōu)化HPLC-ELSD法測定母乳和牛乳中5種磷脂質(zhì)量濃度及構(gòu)成，該方法操作簡便快速、精密度好、回收率高，對乳制品種磷脂的定量檢測提供參考依據(jù)。

1 實 驗

1.1 試劑耗材與儀器

三氯甲烷，HPLC級，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇，Thermo Fisher；甲酸、氯化鈉，anpel；三乙胺，Sigma-Aldrich）。

高效液相色譜儀（HPLC），Agilent1260；配置蒸汽發(fā)光檢測器（ELSD）Agilent1260，Agilent；色譜柱BETA SIL silica-100（200×3 mm，3μm），Thermo Fisher；Thermo REL5004V冰箱，Thermo Fisher；Gilson移液槍，Gilson；PTFE濾膜（13 mm×0.2μm），Agilent。

1.2 標準品

PI，P0639-25M G（PI鈉鹽），≥99%；PE，P7943-25MG（來自蛋黃），≥97%；PC，P3556-100MG（來自蛋黃），≥99%；SM，85615-50MG（來自蛋黃），≥98%；PS，P7769-25MG（來自牛腦），≥97%；均來自Sigma公司。

1.3 樣品

母乳樣品：廣州地區(qū)成熟乳（n=10，產(chǎn)后天數(shù)40～45 d）,母乳樣品從廣州中醫(yī)藥大學(xué)祈福醫(yī)院收集（全段乳）；

牛乳樣品（液態(tài)乳）：包括膜過濾牛乳、巴氏殺菌全脂牛乳、巴氏殺菌脫脂牛乳、超高溫瞬時滅菌（UHT）全脂牛乳、超高溫瞬時滅菌（UHT）低脂牛乳購于當?shù)厥袌?，詳細信息見?。

表1 牛乳生產(chǎn)基本信息

1.4 方法

1.4.1 標準曲線的制作

（1）配制儲備液。取標準品PE，PI，PS，PC，SM（均取25.00 mg，精確到0.01 mg），加溶劑氯仿/甲醇（9∶1）混合液，用容量瓶定容（PE，PS，PC，SM 10 mL，PI50 mL），配置成儲備液。

（2）配制系列混合標準工作液。混合標準儲備液的配制：分別取0.5 mL PC儲備液，0.5 mL PS儲備液，0.5 mL PE儲備液，0.5 mL PS儲備液，1.5 mL PI儲備液于玻璃管中，用移液管移取，充分混勻。

表2 系列混合標準工作液的配制

（3）繪制標準曲線。將磷脂混合標準系列測定液依次進行HPLC色譜測定。記錄各組分的色譜峰面積，以峰面積為縱坐標，以標準測定液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4.2 乳樣中磷脂的測定

參考Lopez等人[13]的方法，取250μL乳樣（母乳/牛乳，每組樣品都檢測相同的一個平行樣，檢測結(jié)果取平均值，以保證結(jié)果的穩(wěn)定性及準確性），加入250μL的水和9.5 mL氯仿-甲醇混合液（2∶1，體積比），放入50 mL玻璃管中，渦旋充分混勻。樣本溶液放入超聲波振蕩器中40℃超聲15 min，取出樣本溶液并加入2 m L的飽和氯化鈉溶液，渦旋混合30 s以上，充分混勻。離心（2 000 r/min，5 min），出現(xiàn)分層（上層為水相，下層為有機相），用玻璃滴管將下層有機相轉(zhuǎn)移到玻璃頂空瓶中。玻璃管剩余溶液加氯仿-甲醇混合液（6∶1，體積比）7 m L再次提取，渦旋30 s以上，充分混勻。再次離心(2 000 r/min，5 min)，吸取下層有機相溶液合并于頂空瓶中。在40℃水浴中氮吹將溶劑蒸發(fā)至干，樣品溶于250μL氯仿-甲醇混合液（9∶1，體積比），渦旋充分混勻，通過0.2μm×4 mm PTFE濾膜過濾，轉(zhuǎn)移到進樣小瓶，進行HPLC-ELSD分析。色譜柱為BETA SIL silica-100（200 mm×3 mm，3μm），柱溫為40℃，進樣量為25μL，ELSD檢測器蒸發(fā)溫度為85℃，噴霧溫度為40℃,流速N2為1.4 L/min，流動相A為三氯甲烷-甲醇-甲酸（濃度1 mol/L，三乙胺調(diào)p H=3）（87.5∶12∶0.5，體積比），流動相B為三氯甲烷-甲醇-甲酸（濃度1 mol/L，三乙胺調(diào)p H=3）（28∶60∶12，體積比）。HPLC參考色譜梯度洗脫程序見表3。

表3 HPLC參考色譜梯度洗脫程序

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)處理與分析。采用單因素ANOVA的多重比較來評估多個樣本間數(shù)據(jù)差異的顯著性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗證

本研究選用廣州地區(qū)收集的3例成熟母乳（40～45 d）樣品充分混勻，做為方法驗證的基質(zhì)樣品，對所建立的磷脂分析方法的檢出限（LOD）、定量限（LOQ）、分析范圍、精密度及準確性進行了全面的驗證。

2.1.1 標準曲線分析范圍，檢出限與定量限

使用標準系列混合工作液建立校準曲線，根據(jù)母乳樣品中各磷脂的質(zhì)量濃度水平確定合適的分析范圍。5種磷脂在驗證的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，分析范圍以mg/L母乳樣品表示。待測樣品的色譜峰信噪比為3時對應(yīng)的濃度為本方法磷脂的檢出限（LOD），以信噪比為10時對應(yīng)的濃度為本方法磷脂的定量限（LOQ），經(jīng)過計算得出，本方法的檢出限（LOD）范圍為0.69～2.97 mg/L，定量限（LOQ）范圍為2.29～9.90 mg/L，在此范圍內(nèi)，分析方法具有良好的靈敏度，可以滿足母乳樣品中5種磷脂的定量檢測，見表4。

表4 磷脂的分析范圍及相關(guān)系數(shù) g/L

2.1.2 精密度與準確性

選用廣州地區(qū)成熟乳制備混樣（n=3，產(chǎn)后天數(shù)40～45 d）（乳樣品是當天收集分裝，保存在-80°C冰箱?；旌蠘悠肥菍悠方鈨龀浞只靹?，分裝保存在-20°C冰箱），計算此混樣中各磷脂8天16次測定結(jié)果的平均值及標準偏差，5種磷脂檢測結(jié)果的RSD的范圍在2.73%～10.03%之間，說明此方法具有良好的精密度。以此樣品做為基質(zhì)，選用3個不同的磷脂質(zhì)量濃度水平（分別為基質(zhì)本底質(zhì)量濃度的50%、100%和150%）進行加標回收試驗，研究每個濃度水平3天6次檢測結(jié)果的平均回收率，以驗證此方法的準確性。5種磷脂在3種濃度水平的加標回收率均在80.17%～101.81%之間，總磷脂含量的回收率在90.06%～91.37%之間，說明此方法具有良好的準確性，能夠滿足磷脂分析的要求，驗證結(jié)果見表5。

表5 磷脂測定方法精密度和加標回收率的驗證結(jié)果

2.2 母乳和牛乳的測定與分析

采用上述方法對廣州地區(qū)收集的10個成熟乳樣品（40～45 d），以及5種市面上常見的牛乳樣品（膜過濾牛乳、巴氏殺菌全脂牛乳、巴氏殺菌脫脂牛乳、UHT全脂牛乳、UHT低脂牛乳）的磷脂質(zhì)量濃度進行測定，見表6。對母乳和牛乳磷脂質(zhì)量濃度進行單因素ANOVA分析，再采用LSD進行兩兩比較。

母乳樣品的總磷脂質(zhì)量濃度顯著高于3種不同生產(chǎn)工藝的全脂牛乳（膜過濾牛乳、巴氏殺菌全脂牛乳、UHT全脂牛乳）（P＜0.05），表現(xiàn)為母乳SM的質(zhì)量濃度約是3種全脂牛乳SM的2.1倍；3種全脂乳之間總磷脂質(zhì)量濃度無顯著差異（P＞0.05）；對于同一生產(chǎn)工藝的牛乳來說，全脂牛乳總磷脂的質(zhì)量濃度大于脫（低）脂牛乳（P＜0.05），表現(xiàn)為全脂牛乳PE、PC和PI的質(zhì)量濃度約是脫脂牛乳的1.6倍；不同工藝生產(chǎn)的脫（低）脂乳無差異（P＞0.05）。

對于母乳和牛乳磷脂的構(gòu)成比，采用卡方檢驗進行分析，母乳磷脂與3種全脂牛乳之間、不同生產(chǎn)工藝的全脂乳之間、同一生產(chǎn)工藝的脫（低）脂牛乳和全脂牛乳脂檢均無差異（P＞0.05），因此母乳和牛乳磷脂的構(gòu)成比無統(tǒng)計學(xué)差異。經(jīng)過多重比較，母乳與牛乳中PE和SM的百分含量差異顯著，成熟乳中的PE的構(gòu)成比比牛乳低大約10%，而SM的構(gòu)成比比牛乳高大約10%。結(jié)果表明，母乳磷脂與牛乳磷脂組成相似，其中以PE、PC和SM為主(約占磷脂總量的80%)。而3種優(yōu)勢類型的磷脂在母乳中的比值為PE∶PC∶SM=1.2∶0.8∶1.0，牛乳中的比值為PE∶PC∶SM=2.6∶1.6∶1.0。結(jié)果如表7所示。

表7 不同地區(qū)母乳磷脂的質(zhì)量濃度及構(gòu)成比

圖1 母乳和牛乳中磷脂構(gòu)成比的比較

3 討 論

本研究顯示，PE、PI、PS、PC和SM的分析范圍分別為11.9～142.9，9.5～57.2，11.5～69.1，14.2～113.6 mg/L和13.6～109.0 mg/L，定量限分別為4.1，9.9，6.3，4.3 mg/L和2.3 mg/L。這表明建立的方法靈敏度較高，可以對母乳和全脂牛乳中的5類磷脂進行定量分析，見表6。將樣品量增加到0.5 mL來檢測脫脂牛乳中的磷脂，以確保其檢測結(jié)果在方法分析范圍內(nèi)。該方法步驟相對較少，簡化了樣品制備過程，適用于大樣本量的常規(guī)分析。

表6 母乳和牛乳中磷脂質(zhì)量濃度 mg/L

分析方法、地理差異、樣品采集季節(jié)、哺乳期、胎齡、飲食等因素均可導(dǎo)致磷脂質(zhì)量濃度和組成的差異。用建立的HPLC-ELSD法測定母乳中總磷脂的平均質(zhì)量濃度為204.5±9.4 mg/L(n=10)，本研究結(jié)果位于世界各地報道的結(jié)果范圍內(nèi)，且與新加坡早期成熟乳的研究結(jié)果比較接近（具體數(shù)據(jù)見表7）。關(guān)于母乳的構(gòu)成，本研究結(jié)果顯示，成熟乳中磷脂的構(gòu)成以PE為主，其次是SM和PC，與日本早期成熟乳的研究結(jié)果相似，而在新加坡、德國和西班牙等地的研究中發(fā)現(xiàn)，SM在早期成熟乳的構(gòu)成中起主要作用。

本研究結(jié)果表明，不同的生產(chǎn)工藝，包括UHT、巴氏殺菌和膜過濾，對牛乳中磷脂的質(zhì)量濃度和構(gòu)成沒有顯著影響。膜過濾是一個相對溫和的處理過程，而巴氏殺菌和UHT則要經(jīng)過一定的熱處理。本研究結(jié)果表明，在牛乳熱處理過程中，磷脂是一類相對穩(wěn)定的活性物質(zhì)，磷脂是乳脂球膜(M FGM)的重要組成部分，同時具有親油性和親水性，有一定的乳化作用。有研究報道存在于乳化液中的磷脂對整個乳化體系的熱穩(wěn)定性有提升作用[22]，而分離出來的MFGM（富含磷脂）在空氣中儲存期間會經(jīng)歷嚴重的氧化反應(yīng)[23]。所以，磷脂的穩(wěn)定性會受到多方面因素的影響，與其存在的基質(zhì)和氧化條件密切相關(guān)。脫脂牛乳是通過去除全脂牛乳中的乳脂來生產(chǎn)的，Deeth等人[24]報道，脫脂奶中也含有膜成分，其含量和組成均與MFGM相似。本研究結(jié)果也表明，脫脂后的牛乳中仍有約60%的磷脂殘留在乳液中，且磷脂組成與全脂牛乳相似。這些都使牛乳及其加工制品（乳脂肪、乳粉等）成為嬰兒配方奶粉中磷脂的良好來源，為其提供與母乳相似的營養(yǎng)價值。

4 結(jié) 論

本研究建立的HPLC-ELSD方法具有良好的準確性和精密度，方法的分析范圍、檢出限和定量限均能滿足母乳和牛乳中磷脂的檢測要求。建立的方法適用于母乳和牛乳中5種磷脂(PE、PI、PS、PC、SM)的測定。該方法的應(yīng)用表明，該方法是常規(guī)分析中快速、準確地鑒定和定量5類磷脂的可靠的方法。全脂牛乳的總磷脂質(zhì)量濃度略低于早期成熟母乳(40～45 d)，而牛乳的磷脂構(gòu)成與母乳相似。這表明牛乳是一種很好的磷脂來源，可以為嬰兒配方奶粉提供這些重要的活性營養(yǎng)素，其質(zhì)量濃度和構(gòu)成與母乳相似。