張 寅,康 躍,薛 妍,張彭鵬

(包頭中藥有限責任公司,內(nèi)蒙古 包頭 014040)

冠心七味片是一種安全可靠[1]、療效確切[2]的冠心病、心絞痛用藥,蒙藥名稱為烏蘭溫度順-7,處方由丹參、檀香、降香、山柰、肉豆蔻、廣棗、沙棘七味藥材組成,功能主治：理氣,寬胸,止痛。用于寒凝氣滯、心脈不通所致的胸痹,癥見胸悶、心前區(qū)疼痛；冠心病心絞痛見上述證候者[3]。該品種質(zhì)量標準含量測定項指標性成分為丹參酮ⅡA[3],丹參酮ⅡA具菲醌結(jié)構(gòu),對濕和熱均不穩(wěn)定[4-6]。該品種生產(chǎn)過程中涉及提取工藝,提取過程涉及的濕熱因素會導致丹參酮ⅡA降解,竟而影響產(chǎn)品質(zhì)量,需要進行具體的分析和研究,以確定提取過程中的濕熱因素對丹參酮ⅡA含量的影響程度,從而優(yōu)化提取生產(chǎn)工藝、保障產(chǎn)品質(zhì)量。本研究對冠心七味片提取工藝中的濕熱因素進行了分析識別,通過單因素試驗法優(yōu)化提取生產(chǎn)工藝,為生產(chǎn)工藝關鍵控制點的制定提供了依據(jù)。

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀,LC-2030 (日本島津),FA2204B電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。丹參酮ⅡA對照品(中國藥品生物制品檢定所提供,批號：110766-202022,含量：98.9%),冠心七味片(由包頭中藥有限責任公司提供),乙腈、甲醇(色譜純),水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,流動相：乙腈-水(70:30),檢測波長：270nm。理論塔板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計算應不低于2000。

2.2 線性關系考察

精密稱取丹參酮ⅡA對照品8.40mg,置100mL棕色量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制得丹參酮ⅡA的對照品溶液。精密量取上述對照品溶液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL,分別置10mL棕色量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,分別取10μL注入液相色譜儀,以丹參酮ⅡA的濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標進行線性回歸分析,測定結(jié)果見表1,丹參酮ⅡA標準曲線見圖1?；貧w方程：Y=58435X-16876,相關系數(shù)r=0.9999,說明丹參酮ⅡA的濃度與峰面積在16.6～83.1μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

表1 線性關系表

2.3 重復性與中間精密度試驗

2.3.1 供試品溶液的制備

取冠心七味片20片,精密稱定,研細,取約1g,精密稱定,置50mL量瓶中,加甲醇40mL,超聲處理20分鐘,放冷,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液即得。

2.3.2 對照品溶液的制備

取丹參酮ⅡA對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1mL含40μg的溶液,即得。

圖1 丹參酮ⅡA標準曲線

2.3.3 測定法

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL注入液相色譜儀,測定。

2.3.4 重復性及中間精密度試驗

按照2.3.1至2.3.3實驗內(nèi)容,重復進行6份樣品的檢驗,更換儀器及檢驗人員,再進行6份樣品的檢驗。結(jié)果(見表2)表明,丹參酮ⅡA重復性、精密度良好。

表2 重復性與中間精密度試驗結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性試驗

取冠心七味片30片,研細,稱取三份,按“2.3.1”項下的配制方法處理,制得三份供試品溶液。分別取上述三份供試品溶液各10μL,在0、4、8小時測定峰面積,結(jié)果(見表3)表明,供試品溶液在8小時內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.5 加樣回收率測定

精密稱取丹參酮ⅡA對照品12.43mg,用甲醇定容至250mL的容量瓶中,作為加樣回收對照品溶液。取已知含量的冠心七味片粉末,每份精密稱取0.5g,取6份,分別置50mL量瓶中,精密加入上述加樣回收對照品溶液25mL,加甲醇15mL,超聲處理20分鐘,放冷,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,作為加樣回收供試品溶液。分別精密吸取加樣回收對照品溶液與加樣回收供試品溶液10μL注入液相色譜儀測定。計算加樣回收率,結(jié)果見表4。

2.6 提取工藝單因素試驗

2.6.1 冠心七味片提取生產(chǎn)工藝

冠心七味片質(zhì)量標準制法項下內(nèi)容為[3]粉碎(取檀香、降香、山柰、肉豆蔻四味,混合粉碎成細粉)以及提取(丹參、廣棗和沙棘用乙醇提取2小時,濾過；藥渣加70%乙醇提取2小時,濾過；合并濾液,回收乙醇得稠膏狀物；藥渣加水煎煮2小時,濾過,濾液濃縮成稠膏；兩膏合并,將檀香、降香、山柰和肉豆蔻四味藥材細粉與稠膏拌勻,低溫干燥,粉碎成細粉)。

表4 加樣回收試驗結(jié)果

2.6.2 濕熱因素分析及研究內(nèi)容的確定

分析提取工藝中與濕熱有關的因素并確定研究內(nèi)容,見表5。

表5 提取工藝中與濕熱有關的因素分析及研究內(nèi)容的確定

2.6.3 考察因素水平的確定

根據(jù)以上分析結(jié)果,確定將要考察的因素水平如表6所示。

表6 單因素試驗考察因素和水平

下面根對確定的考察因素和水平進行單因素試驗法進行試驗。

2.6.4 一遍煎液與二遍煎液合并濃縮、分開濃縮對丹參酮ⅡA含量的影響

試驗方法：分別進行兩組冠心七味片工藝試驗,A組按“粉碎”和“提取”步驟進行試驗(即一遍煎液與二遍煎液合并濃縮),B組按“粉碎”和“提取”步驟進行試驗,并在進行“提取”步驟試驗時,將一遍煎液和二遍煎液分開濃縮,再混合,繼續(xù)后續(xù)工藝步驟。根據(jù)丹參酮ⅡA對濕熱不穩(wěn)定的特性,另外兩個因素固定為醇提膏與水提膏出膏后24h內(nèi)開始混合烘干、混合膏低溫干燥(烘干溫度控制在55～60℃之間)。每組分別進行兩個重復試驗,并使用2.1項下色譜條件、2.3.1項下供試品溶液制備方法(將膏粉作為冠心七味片研細后的粉末進行處理)、2.3.2項下對照品溶液制備方法以及2.3.3項下測定法對所得膏粉進行丹參酮ⅡA含量測定,計算轉(zhuǎn)移率。

試驗結(jié)果：試驗結(jié)果(見表7)表明,A組試驗結(jié)果的丹參酮ⅡA含量和轉(zhuǎn)移率均顯著高于B組,說明一遍煎液與二遍煎液合并濃縮較分開濃縮更有利于減少丹參酮ⅡA的降解,后續(xù)試驗選用一遍煎液與二遍煎液合并濃縮的方法進行。

表7 A組與B組試驗結(jié)果對比

2.6.5 醇提膏與水提膏合并放置時間對丹參酮ⅡA含量的影響

試驗方法：按照“粉碎”和“提取”步驟進行C組試驗(即一遍煎液與二遍煎液合并濃縮),將“提取”中兩膏合并得到的稠膏在常溫、避光、密閉條件下放置至第5天(稠膏放置時間113h)進行混合、烘干,根據(jù)丹參酮ⅡA對濕熱不穩(wěn)定的特性,另一因素固定為低溫干燥(烘干溫度控制在55～60℃之間),繼續(xù)后續(xù)工藝步驟。每組分別進行兩個重復試驗。對所得膏粉進行丹參酮ⅡA含量測定,計算轉(zhuǎn)移率。

試驗結(jié)果：試驗結(jié)果與A組(A組為兩膏出膏后當天進行混合烘干,兩膏合并后的稠膏放置時間為4h,另外兩個因素均與D組試驗相同)進行對比,見表8,可以看出,A組試驗結(jié)果的丹參酮ⅡA含量和轉(zhuǎn)移率均顯著高于C組,說明醇提膏與水提膏混合所得稠膏在常溫、避光、密閉條件下的放置過程中,丹參酮ⅡA發(fā)生明顯降解,其丹參酮ⅡA含量已降低至質(zhì)量標準以下(根據(jù)成品標準推算膏粉含量標準為不低于1.0mg/g),后續(xù)試驗選用兩膏出膏后當天進行混合烘干。

表8 A組與C組試驗結(jié)果對比

2.6.6 藥材細粉與稠膏拌勻后的烘干溫度

試驗方法：按照“粉碎”和“提取”步驟進行D組試驗(即一遍煎液與二遍煎液合并濃縮),將“提取”中藥材細粉與稠膏拌勻后的混合膏烘干溫度控制在80～85℃之間,另一因素固定為兩膏出膏后當天進行混合烘干,繼續(xù)后續(xù)工藝步驟。每組分別進行兩個重復試驗。所得膏粉進行丹參酮ⅡA含量測定,計算轉(zhuǎn)移率。

試驗結(jié)果：試驗結(jié)果與A組(A組烘干溫度為55～60℃,另外兩個因素與D組相同)進行對比(見表10),A組試驗結(jié)果的丹參酮ⅡA含量和轉(zhuǎn)移率均顯著高于D組,說明烘干溫度由55～60℃改變?yōu)?0～85℃導致丹參酮ⅡA的含量和轉(zhuǎn)移率顯著下降，見表9。

表9 A組與D組試驗結(jié)果對比

2.7 單因素試驗工藝優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)以上試驗結(jié)果,確定優(yōu)化的工藝為：一遍煎液與二遍煎液合并濃縮；烘干溫度控制在55～60℃之間；結(jié)合生產(chǎn)實際,確定醇提膏與水提膏的放置時間不超過24h,且為避免受到水分影響,進一步要求兩膏出膏后分開放置,至烘干前再進行合并。

2.8 驗證試驗

根據(jù)以上試驗結(jié)果,按照“粉碎”和“提取”步驟進行三組平行試驗(及一遍煎液與二遍煎液合并濃縮),設置兩膏出膏后當天開始混合烘干,烘干溫度控制在55～60℃之間,試驗規(guī)模放大至中試規(guī)模,對所得膏粉進行丹參酮ⅡA含量測定,結(jié)果見表11,其中丹參酮ⅡA含量能夠滿足質(zhì)量標準要求(膏粉含量標準為不低于1.0mg/g),且轉(zhuǎn)移率較高,轉(zhuǎn)移率RSD為1.64%,表明丹參酮ⅡA含量穩(wěn)定,方法可行,見表10。

表10 驗證試驗結(jié)果

進一步的,將烘干后的膏粉在常溫、避光、密閉條件下放置至第五天進行第二次丹參酮ⅡA含量測定,與初次檢測結(jié)果對比(見表11),只有第三組試驗的丹參酮ⅡA含量是下降的,且下降幅度較小,為3.32%,說明混合膏烘干后,丹參酮ⅡA含量較為穩(wěn)定,短時間內(nèi)未發(fā)生明顯降解反應；作為對比,C組試驗稠膏狀態(tài)放置五天再烘干后的含量與A組試驗的未放置情況相比,含量下降明顯,含量均值下降了27.9%,進一步證明了丹參酮ⅡA對“濕”的不穩(wěn)定性,也說明在沒有加熱和光照的條件下,“濕”的因素可單獨影響丹參酮ⅡA的含量。

表11 膏粉在常溫、避光、密閉儲存條件下的含量變化情況

3 討論

冠心七味片提取過程中存在較多濕熱因素,是造成指標性成分丹參酮ⅡA降解的主要因素,其降解機理可能與丹參酮ⅡA在水中轉(zhuǎn)化成酮類,發(fā)揮遞氫作用,促進氧化還原反應有關[6]。本研究對提取工藝中的濕熱因素進行了分析和識別,通過單因素試驗法確定了優(yōu)化的提取工藝,為回答有關的濕熱因素能否優(yōu)化、如何優(yōu)化的問題以及生產(chǎn)工藝關鍵控制點的制定提供了依據(jù)。

試驗過程中發(fā)現(xiàn),一遍煎液與二遍煎液先混合后濃縮的情況,較先濃縮后混合的情況丹參酮ⅡA含量高,推測先混合后濃縮時,提高了二遍煎液的含醇量,使二遍煎液中的丹參酮ⅡA受濕熱的影響導致降解的情況更少發(fā)生,同時雖然一遍煎液的含醇量有所降低,但對一遍煎液中丹參酮ⅡA的含量影響較??；也有可能由于濃縮過程中藥液中的含醇量不斷下降,導致濃縮成稠膏時,部分丹參酮ⅡA成分析出,粘附容器壁,造成含量損失,而兩遍煎液先濃縮后混合的情況可能會加劇這種情況的發(fā)生,從而導致含量和轉(zhuǎn)移率更低。

以往對丹參酮ⅡA降解規(guī)律的研究,或單獨研究受熱因素對丹參酮ⅡA的降解影響[4],或?qū)駸嵋蛩貙Φ⑼駻的降解影響放在一起進行研究[5-6],本研究試驗過程中發(fā)現(xiàn),在沒有加熱和光照的條件下,“濕”的因素也會對丹參酮ⅡA產(chǎn)生顯著的降解影響,其意義在于提示水分對丹參酮ⅡA含量的影響,如：含丹參酮ⅡA成分的中間品在貯存環(huán)節(jié)需要注意水分對丹參酮ⅡA含量的影響；丹參藥材貯存過程中常發(fā)生丹參酮ⅡA的含量隨貯存時間的延長含量下降[7],結(jié)合本研究結(jié)果,提示要注意貯存環(huán)節(jié)丹參藥材本身的水分和環(huán)境濕度對丹參酮ⅡA含量的影響；《中國藥典》規(guī)定丹參飲片的炮制方法為除去雜質(zhì)和殘莖,洗凈、潤透、切厚片,干燥[8],實際生產(chǎn)過程中應評估和控制其中水分對丹參酮ⅡA的降解影響。