方 濤，楊婉浠，李 昕，叢志成，張沛宗，祁 泉，宋 兵*

(蘭州大學(xué) 1.第一臨床醫(yī)學(xué)院；2.第一醫(yī)院 心血管外科，甘肅 蘭州 730000)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是造成人類死亡的常見原因之一，每年大約導(dǎo)致730 萬人死亡[1]。在過去的幾十年間，盡管對(duì)其的診療取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，但仍造成54%的患者在發(fā)病5 年內(nèi)死亡[2]。治療性血管新生是通過將外源性血管生長(zhǎng)因子植入到缺血組織中以達(dá)到缺血組織重新獲得血液供應(yīng)的目的。血管生成素1(angiopoietin1，Ang1)不但可以促進(jìn)活性血管的生成，也能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。但其應(yīng)用仍受到多種因素的制約：1)Ang1難于提取、制備、應(yīng)用；2)Ang1半衰期短，難于維持足夠的局部血藥濃度；3)持續(xù)注射，會(huì)產(chǎn)生較大副作用[3]。

PLGA-PEG能夠有效增加小分子蛋白的穩(wěn)定性，提高其生物利用度，是一種較好的藥物載體，特別適用于蛋白質(zhì)等藥物的注射治療[4]?；诖耍狙芯客ㄟ^將PLGA-PEG和Ang1偶聯(lián)，進(jìn)行心肌梗死周圍局部注射,改善心肌梗死大鼠心臟功能，為其以后的臨床應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

重組人血管生成素1和血管生成素1酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA)均(R&D Systems公司)；PLGA(濟(jì)南岱罡生物工程有限公司)；PEG(JenKem科技公司)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(甘肅華譜生物科技有限公司)；CD31一抗(上海允麥生物科技有限公司)；α-SMA(上海信帆生物科研所)；Fluor? 594 熒光二抗和Fluor? 488 熒光二抗(Abcam公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京盛科博源生物科技有限公司)。年齡6～8周SPF級(jí)雄性SD大鼠(體質(zhì)量200～250 g)中科院蘭州獸研所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，許可證號(hào)：SCSK(甘2015-0001)。本研究中所有程序均符合“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南”(國(guó)家衛(wèi)生研究院，第85-23號(hào)出版物，修訂版)，并在蘭州大學(xué)動(dòng)物使用委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 納米微粒的制作及物理表征：用雙乳液法制備了Ang1的PLGA-PEG納米微粒[5]。并使用Philips CM120透射電子顯微鏡檢測(cè)粒徑和形態(tài)，通過Elisa法檢測(cè)其包封率(包封率%=納米微粒中Ang1的測(cè)得量/制備載藥納米粒時(shí)Ang1的加入量×100%)以及體外釋放過程。

1.2.2 大鼠的分組及處理：復(fù)制大鼠心肌梗死模型[6]。1 周后彩超檢測(cè)心臟，將大鼠隨機(jī)分組：模型組(心肌梗死周圍區(qū)域注射100 μL PBS溶液)(n=8)、Ang-1組[注射含Ang1的PBS溶液(100 μL，25 ng/μL)](n=8)、Ang1-PLGA-PEG組[注射100 μL納米微?；鞈乙?，約含(1.61±0.05)μg Ang1](n=9)，注射深度約3 mm。于4 周后收集超聲心動(dòng)圖數(shù)據(jù)，并分析。然后，處死大鼠并收取心臟組織。用4%甲醛灌注心臟20 min，用PBS漂洗約10 min。然后將心臟樣品進(jìn)行固定、包埋并切片。

1.2.3 Masson染色檢測(cè)組織增生：在鏡下觀察纖維結(jié)締組織增生情況，并且使用Image J軟件測(cè)量以下數(shù)據(jù)：心室壁厚度(mm)、隔膜厚度(mm)、瘢痕厚度(mm)、左室腔面積(mm2)和整個(gè)左室面積(mm2)。每個(gè)參數(shù)測(cè)量進(jìn)行3 次。然后，計(jì)算每個(gè)參數(shù)的平均值。纖維結(jié)締組織可根據(jù)增生情況分為4 級(jí)[7]。相對(duì)瘢痕厚度：瘢痕壁的平均厚度值與未受影響的心室壁的平均厚度值的比例。梗死擴(kuò)張指數(shù):(左室腔面積/整個(gè)左室面積)/相對(duì)瘢痕厚度[8]。

1.2.4 免疫熒光染色檢測(cè)血管新生：先使用CD31和α-SMA抗體進(jìn)行血管染色，然后在滴加相應(yīng)的Fluor? 594 熒光二抗和Fluor? 488 熒光二抗。在熒光顯微鏡下通過α-SMA和CD31陽性來識(shí)別梗死周邊區(qū)域的小動(dòng)脈和毛細(xì)血管形成情況并拍照，隨機(jī)選擇8個(gè)圖像，并計(jì)算1 mm2內(nèi)小動(dòng)脈和毛細(xì)血管數(shù)量的平均值。以α-SMA陽性的血管數(shù)量相對(duì)于血管的總數(shù)量來計(jì)算成熟指數(shù)[9]。使用Image J軟件進(jìn)行所有測(cè)量。

1.2.5 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡：使用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野中凋亡細(xì)胞核和總細(xì)胞核，使用Image J軟件計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞核和總細(xì)胞核數(shù)目。TUNEL陽性細(xì)胞核的百分比定義為凋亡細(xì)胞核數(shù)與細(xì)胞核總數(shù)的比值[10]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 納米微粒檢測(cè)

經(jīng)檢測(cè)，確定制備的納米微粒的平均大小為180 nm，Ang1在微粒中的包封率為64.3%±2.4%[即為每毫克納米顆粒包含(321.5±1.1)ng的Ang1]。Ang1-PLGA-PEG納米微粒在前3 d釋放了46.3%的Ang1，前10 d釋放了73.9%，在隨后的時(shí)間，Ang1的釋放速率減慢直到第30天(圖1)。

圖1 Ang1-PLGA-PEG 納米微粒中Ang1的體外釋放曲線Fig 1 In vitro released profiles of angiopoietin 1

2.2 彩超檢查心臟

注射后4 周：與模型組和Ang1組相比，Ang1-PLGA-PEG組左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)明顯增大，且左室縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)也增加；而左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-systole，LVIDs)減小，同樣左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-diastole，LVIDd)也有類似的趨勢(shì)(圖2)。

A.representative echocardiographic images from each group；B.the left ventricular ejection fraction(LVEF)；C.left ventricular fractional shortening(LVFS)；D.left ventricular internal diameter at end-systole(LVIDs);E.left ventricular internal diameter at end-diastole(LVIDd)was assessed via two-dimensional echocardiography;*P<0.05 compared with the model control group;#P<0.05 compared with Ang1 group；Ang1-PLGA-PEG.angiopoietin1 loaded in PLGA-PEG NPs圖2 超聲心動(dòng)圖評(píng)估Fig 2 Echocardiographic

2.3 Masson染色檢測(cè)瘢痕組織增生

與模型組和Ang1組相比，Ang1-PLGA-PEG組相對(duì)瘢痕厚度顯著增加，梗死擴(kuò)張指數(shù)明顯減小(圖3)；且纖維結(jié)締組織增生情況較低(表1)。可見模型組和Ang1組梗死部位形成大量的纖維結(jié)締組織,可見較少的心肌肌纖維組織，梗死部位的周邊纖維結(jié)締組織與心肌組織之間緊密相間分布,梗死壁厚度較小。Ang1-PLGA-PEG組梗死部位形成少量的纖維結(jié)締組織,可見較多的心肌肌纖維組織，梗死部位的周邊心肌組織和纖維結(jié)締組織稀疏相間，梗死壁厚度較大。

A.representative Masson’s trichrome staining,scale bars=2 mm；B.quantification of the relative scar thickness;C.infarct expansion index based on Masson’s trichrome staining；*P<0.05 compared with the model control group;#P<0.05 compared with Ang1 group；Ang1-PLGA-PEG.angiopoietin1 loaded in PLGA-PEG NPs圖3 Masson染色檢測(cè)瘢痕組織增生Fig 3 Scar tissue hyperplasia was detected by Morphological

表1 梗死中心部位纖維結(jié)締組織增生情況table 1 Proliferation of fibrosis in central area of myocardial infarction (×40，n=8)

2.4 免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡和血管形成

與模型組和Ang1組相比，Ang1-PLGA-PEG組血管形成較多且血管成熟指數(shù)更高(圖4)；而凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖5)。

A.representative immunohistochemical staining of blood vessel in the peri-infarct myocardial tissue;CD31(red)and α-SMA (green)staining for the blood vessels;scale bars=50 μm;B.quantification of the capillary density;C.maturation index;*P<0.05 compared with the model control group;#P<0.05 compared with Ang1 group；Ang1-PLGA-PEG.angiopoietin1 loaded in PLGA-PEG NPs圖4 血管形成的免疫熒光染色Fig 4 Immunofluorescence assessment of the

A.representative photomicrographs of TUNEL staining (green)and DAPI(blue)staining for the PEG-PLGA-Ang1 nanoparticles group，angiopoietin1 group，normal model control group in peri-infarct region,scale bars=50 μm；B.quantification of the percentage of TUNEL-positive nuclei;*P<0.05 compared with the model control group；#P<0.05 compared with Ang1 group；Ang1-PLGA-PEG.angiopoietin1 loaded in PLGA-PEG NPs圖5 TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡Fig 5 Cardiomyocyte apoptosis was detected by

3 討論

目前，心肌梗死的主要治療方式有:溶栓、冠狀動(dòng)脈搭橋、支架植入等。盡管患者病死率已顯著下降,生存率不斷提高，但仍有部分患者經(jīng)治療后亦發(fā)生心力衰竭。局部注射促血管生成活性蛋白或干細(xì)胞改善梗死部位血液供應(yīng)為一種新興的治療策略[11-12]。眾所周知，Ang1是一種重要的促血管生成活性蛋白，在血管生成過程中具有重要作用。將Ang1搭載到PLGA-PEG納米微粒中，使其緩慢、持續(xù)釋放具有生物學(xué)活性的Ang1，以克服其半衰期短的局限性。

雖然Ang1組和Ang1-PLGA-PEG組在治療后4周均增加了新生血管密度，但后者的程度明顯更高，這種作用可能歸因于Ang1與PLGA-PEG納米微粒結(jié)合后，在同等劑量下能夠長(zhǎng)久、持續(xù)的作用于組織細(xì)胞。相對(duì)于Ang1組來說，Ang1-PLGA-PEG組不僅促進(jìn)新生血管，而且誘導(dǎo)血管的成熟Ang1-PLGA-PEG組血管成熟指數(shù)高于Ang1以及單純模型組。

TUNEL染色結(jié)果表明:Ang1-PLGA-PEG組僅有少量細(xì)胞凋亡，已經(jīng)有效抑制心肌細(xì)胞凋亡。但Ang1組與模型組具有相似程度的大量細(xì)胞凋亡，可能Ang1組藥物抑制細(xì)胞凋亡僅維持?jǐn)?shù)分鐘或數(shù)小時(shí)，這仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，誘導(dǎo)血管新生能夠挽救受損的缺血組織并啟動(dòng)自我修復(fù)途徑[13]。Ang1-PLGA-PEG納米微粒誘導(dǎo)梗死心肌周圍組織中血管密度及血管成熟度增加將減輕周圍區(qū)域的局部缺血，通過向梗死區(qū)域輸送更多的營(yíng)養(yǎng)及氧氣，這也增大其抑制細(xì)胞凋亡的效能。

心肌細(xì)胞凋亡后，纖維結(jié)締組織增生以替代原有的心肌組織，導(dǎo)致心室病理性重塑的發(fā)生。Masson染色結(jié)果顯示相對(duì)于其他兩組，Ang1-PLGA-PEG納米微?？梢杂行p弱心室病理重塑。而且，病理性重塑會(huì)導(dǎo)致心肌組織中小動(dòng)脈的減少，會(huì)加重組織缺血導(dǎo)致更多的心肌細(xì)胞凋亡這一惡性循環(huán)的發(fā)生。

心肌修復(fù)的目的在于恢復(fù)心臟功能，心臟彩超結(jié)果表明Ang1組與Ang1-PLGA-PEG組盡管在治療4 周后都顯示出LVEF增大、LVIDs及LVIDd減小，但以Ang1-PLGA-PEG組左室功能改善更加明顯，更加有效防止左室功能惡化。

綜上所述，Ang1-PLGA-PEG納米微粒用于心肌梗死后局部心肌內(nèi)注射，可以誘導(dǎo)血管形成、抑制心肌細(xì)胞凋亡及減輕心臟不良重塑從而改善心肌梗死后的心臟功能，對(duì)受損心臟起到一定程度的治療和保護(hù)作用,為其臨床應(yīng)用增加了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。