陳 熹，宋紅權(quán)，焦曉輝

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；

2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001

CMTM是人類趨化因子樣基因超家族的新成員，該家族還包括CMTM 1-8［1］。CMTM6是一種廣泛表達(dá)的蛋白，以簇狀形式存在于人類染色體3p23上。它與其他家族成員的蛋白產(chǎn)物具有序列同源性，并具有潛在的四次膜穿透結(jié)構(gòu)。近年來，CMTM6與腫瘤發(fā)生的關(guān)系受到了越來越多的關(guān)注。CMTM6在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，其表達(dá)與抑制性T細(xì)胞表達(dá)呈正相關(guān)［2］。相關(guān)報告中表示CMTM6在非小細(xì)胞肺癌中與更長的總生存期顯著相關(guān)［3］。之前的研究表明CMTM6在不同的腫瘤中發(fā)揮不同的作用。腫瘤免疫微環(huán)境（Tumor immune microenvironment）是指腫瘤細(xì)胞存在的周圍微環(huán)境，包括周圍的血管、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓源性炎性細(xì)胞、各種信號分子和細(xì)胞外基質(zhì)。腫瘤和周圍環(huán)境密切相關(guān)，不斷進(jìn)行交互作用，腫瘤可以通過釋放細(xì)胞信號分子影響其微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的血管生成和誘導(dǎo)免疫耐受，而微環(huán)境中的免疫細(xì)胞可影響癌細(xì)胞增長和發(fā)育。在肺鱗癌中，CMTM6表達(dá)與CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)，與CD4+T細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)［4］。因此，充分了解CMTM6與免疫微環(huán)境之間的關(guān)系對于免疫微環(huán)境的研究，對于患者進(jìn)一步治療具有重要意義。在這項研究中，使用包括PrognoScan和Kaplan-Meier Plotter等在內(nèi)的數(shù)據(jù)庫，將CMTM6在泛癌癥中的預(yù)后景觀可視化。然后，利用TIMER數(shù)據(jù)庫探討了CMTM6表達(dá)與免疫浸潤水平之間的潛在關(guān)系。這項研究的結(jié)果表明，CMTM6可能是通過它與浸潤性免疫細(xì)胞之間的相互作用，影響癌癥患者的預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 TIMER中計算CMTM6基因表達(dá)量

TIMER（http://cistrome.org/TIMER/）是一款腫瘤浸潤免疫細(xì)胞組分分析網(wǎng)站，既可以比較腫瘤樣本和正常組織中基因表達(dá)量的差異，同時輸入腫瘤樣本的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，也可以預(yù)測每個腫瘤樣本中浸潤的免疫細(xì)胞組成。

1.2 PrognoScan和Kaplan-Meier Plotter中的生存分析

PrognoScan、Kaplan-Meier Plotter中分析了CMTM6的表達(dá)與泛癌中的生存的相關(guān)性［5］。具體而言，在PrognoScan的所有可用微陣列數(shù)據(jù)集中搜索CMTM6的表達(dá)水平，以確定其與包括總體生存期（OS）和無疾病生存期（DFS）在內(nèi)的預(yù)后的關(guān)系。閾值設(shè)置為Cox P＜0.05。我們探討了CMTM6表達(dá)在每種可獲得的癌癥類型中對OS和DFS的影響。Kaplan-Meier Plotter是一個強大的線上工具，可以用來評估21種癌癥類型中54 000個基因?qū)ι娴挠绊憽Ｑ芯空叻治隽薈MTM6在腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、肝細(xì)胞癌（LIHC）、胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）、膀胱癌（BLCA）乳腺癌（BRCA）、胸腺瘤（THYM）、甲狀腺腺瘤（THCA）中的表達(dá)與總生存期（OS）、無復(fù)發(fā)生存期（RFS）的關(guān)系，計算了log-rank P值和95%置信區(qū)間（CI）的風(fēng)險比率（HRs）。

1.3 TIMER中CMTM6表達(dá)與免疫細(xì)胞的相關(guān)性

用TIMER測定CMTM6表達(dá)與免疫浸潤的關(guān)系［6］。TIMER是系統(tǒng)分析多種癌癥類型免疫浸潤的理想資源。TIMER應(yīng)用先前發(fā)表的統(tǒng)計反褶積方法，從基因表達(dá)譜中推斷腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的豐度［7］。TIMER數(shù)據(jù)庫包含來自TCGA的多種癌癥類型的10 897個樣本，以評估免疫浸潤的豐度。分析CMTM6的表達(dá)與總共6種免疫浸潤細(xì)胞的豐度之間的關(guān)系，包括B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。ESTIMATE（使用表達(dá)數(shù)據(jù)估計惡性腫瘤組織中的基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞）是一種預(yù)測腫瘤純度以及使用基因表達(dá)數(shù)據(jù)預(yù)測腫瘤組織中浸潤的基質(zhì)/免疫細(xì)胞的工具。利用ESTIMATE算法來推斷每個樣品的免疫評分。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Kaplan-Meier法評估生存曲線。為了比較生存曲線，采用時序檢驗來計算Kaplan-Meier Plotter中的HR值和logrank P值。采用單變量Cox回歸模型在PrognoScan中計算HR和Cox P值。用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)評價基因表達(dá)的相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 泛癌中CMTM6的mRNA表達(dá)水平

為了明確在泛癌中的CMTM6表達(dá)，用TIMER檢測了TCGA中的RNA測序數(shù)據(jù)。腫瘤和鄰近正常組織中差異的CMTM6表達(dá)模式如圖1所示。腎嫌色細(xì)胞癌（KICH）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、肝細(xì)胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）中CMTM6的表達(dá)低于正常組織。在皮膚黑色素瘤（SKCM）中，CMTM6在原發(fā)部位的表達(dá)要低于轉(zhuǎn)移部位。同時，CMTM6的表達(dá)在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、結(jié)腸腺癌（COAD）、食道癌（ESCA）、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）、胃癌（STAD）、甲狀腺癌（THCA）中明顯高于正常組織。在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）中，HPV陽性的CMTM6表達(dá)稍高于HPV陰性。

圖1 CMTM6在TCGA的不同種癌癥中的表達(dá)水平（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

2.2 CMTM6在癌癥中的預(yù)后價值

在不同數(shù)據(jù)庫中研究了CMTM6對泛癌的預(yù)后價值。在PrognoScan中，探討了每個癌癥中CMTM6表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果總結(jié)在圖2中。值得注意的是，CMTM6的表達(dá)與總共9種癌癥類型顯著相關(guān)，包括星形細(xì)胞瘤（Astrocytoma）、神經(jīng)膠質(zhì)瘤（Glioma）、乳腺癌（BRCA）、濾泡性淋巴瘤（FL）、結(jié)直腸癌（COREAD）、皮膚黑色素瘤（SKCM）、葡萄膜黑色素瘤（UVM）、卵巢癌（OV）、肺腺癌（LUAD）（圖2）。其中，CMTM6在3種癌癥類型中發(fā)揮了不利作用，包括星形細(xì)胞瘤（Astrocytoma）［OS：總數(shù)=77，HR=2.83，Cox P=0.004 306］，神經(jīng)膠質(zhì)瘤（Glioma）［OS：總數(shù)=74，HR=2.49，Cox P=0.021 147］，結(jié)直腸癌（COREAD）［DFS（無病生存期）：總數(shù)=145，HR=2.40，Cox P=0.019 720］。同時，CMTM6在其他6種癌癥類型中起保護作用，包括乳腺癌（BRCA）［RFS（無復(fù)發(fā)生存期）：總數(shù)=77，HR=0.14，Cox P=0.036 128］，濾泡性淋巴 瘤（FL）［OS：總數(shù)=180，HR=0.45，Cox P=0.001 493］，皮膚黑色素瘤（SKCM）［OS：總數(shù)=38，HR=0.21，Cox P=0.014 290］，葡萄膜黑色素瘤（UVM）［DMFS（無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期）：總數(shù)=63，HR=0.69，Cox P=0.039 375］，卵巢癌（OV）［OS：總數(shù)=185，HR=0.72，Cox P=0.000 359］，肺腺癌（LUAD）［RFS：總數(shù)=204，HR=0.46，Cox P=0.000 03］。

圖2 CMTM6在PrognoScan的不同種癌癥中高低表達(dá)的Kaplan-Meier生存曲線的比較（a-i）

使用來自TCGA的主要基于Affymetrix微陣列信息的Kaplan-Meier Plotter，研究者進(jìn)一步評估了CMTM6相關(guān)總生存期（OS）（圖3）。CMTM6在4種癌癥中預(yù)后較差，腎透明細(xì)胞癌（KICH）［HR=1.43（1.05～1.93），logrank P=0.022］，肝細(xì)胞癌（LIHC）［HR=1.46（1.03～2.06），logrank P=0.033］，胰 腺 導(dǎo) 管 腺 癌（PDAC）［HR=1.94（1.28～2.95），logrank P=0.001 5］，嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）［HR=4.93（0.89～27.18），logrank P=0.043］。在另外5種癌癥中，CMTM6則起到了預(yù)后較好的作用：膀胱癌（BLCA）［HR=0.59（0.43～0.81），logrank P=0.001］，乳 腺 癌（BRCA）［HR=0.67（0.48～0.95），logrank P=0.025］，胸腺瘤（THYM）［HR=0.25（0.07～0.99），logrank P=0.034］，甲狀腺腺瘤（THCA）［HR=0.33（0.1～1.01），logrank P=0.041］，子宮體子宮內(nèi)膜癌（UCEC）［HR=0.62（0.4～0.96），logrank P=0.03］。

圖3 CMTM6在Kaplan-MeierPlotter的不同種癌癥中高低表達(dá)的Kaplan-Meier生存曲線的比較（a-i）

2.3 CMTM6表達(dá)與免疫浸潤的相關(guān)性

腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞可以影響患者生存率，上述發(fā)現(xiàn)支持CMTM6在泛癌中的預(yù)后作用。因此，探索免疫浸潤與CMTM6表達(dá)之間的關(guān)系是有意義的。

研究列舉了與免疫浸潤相關(guān)性最強的三種癌癥。在腎透明細(xì)胞癌（KIRC）中，CMTM6的表達(dá)水平與B細(xì)胞（R=0.38，P=1.02E-19），CD4+T細(xì)胞（R=0.37，P=1.03E-18），CD8+T細(xì)胞（R=0.392，P=5.65E-21），巨噬細(xì)胞（R=0.619，P=1.93E-57），中 性 粒 細(xì) 胞（R=0.573，P=1.07E-47）和樹突狀細(xì)胞（R=0.585，P=3.63E-50）的浸潤水平呈顯著正相關(guān)。在頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）中，CMTM6的表達(dá)水平與B細(xì)胞（R=0.154，P=0.000 599），CD4+T細(xì)胞（R=0.387，P=3.52E-19），CD8+T細(xì)胞（R=0.192，P=1.7E-05），巨 噬 細(xì) 胞（R=0.302，P=6.54E-12），中性粒細(xì)胞（R=0.347，P=1.88E-15）和樹突狀細(xì)胞（R=0.396，P＜0.000 1）的浸潤水平呈顯著正相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)強烈提示CMTM6通過與結(jié)腸腺癌（COAD）、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）等癌癥的免疫浸潤相互作用而影響患者的生存期。對于結(jié)腸腺癌（COAD）來說，CMTM6表達(dá)水平與B細(xì)胞（R=0.303，P=3.54E-11），CD8+T細(xì)胞（R=0.519，P=6.04E-33），CD4+T細(xì)胞（R=0.18，P=0.000 11），巨噬細(xì)胞（R=0.362，P=1.22E-15），中 性 粒 細(xì) 胞（R=0.374，P=1.1E-16）和樹突狀細(xì)胞（R=0.397，P=9.84E-19）的浸潤水平呈顯著正相關(guān)。

為了探討CMTM6表達(dá)與免疫評分之間的潛在相關(guān)性，我們應(yīng)用了ESTIMATE算法來計算TCGA隊列中每個樣品的免疫評分（圖4）。CMTM6表達(dá)與乳腺癌（BRCA）、宮頸癌（CESC）、結(jié)腸腺癌（COAD）、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBC）、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、急性髓性白血病（LAML）、腦低級別膠質(zhì)瘤（LGG）、肝細(xì)胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）、肉瘤（SARC）、皮膚黑色素瘤（SKCM）、胸腺癌（THYM）的免疫浸潤相關(guān)。結(jié)果表明，在某些癌癥類型中，CMTM6表達(dá)與高免疫浸潤有關(guān)。

圖4 CMTM6表達(dá)和免疫評分的關(guān)系

3 討論

腫瘤微環(huán)境（TME）含有多種細(xì)胞。其中，浸潤性免疫細(xì)胞占很大比例。一方面，與傳統(tǒng)觀念將免疫細(xì)胞作為抗腫瘤策略的組成部分不同，TME中的免疫浸潤反映了腫瘤細(xì)胞避免被殺死的策略。此外，除了巨噬細(xì)胞，幾乎所有類型的免疫細(xì)胞，包括B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC），都存在于TME中，有些參與了癌癥的發(fā)展。相反作為經(jīng)典抗癌治療的替代療法，針對免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間相互作用的免疫治療，近年來已經(jīng)被開發(fā)出來，用以重新激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)和固有免疫系統(tǒng)，并創(chuàng)造一個強大的抗腫瘤免疫反應(yīng)。然而，只有在某些特定癌癥類型中，有限比例的患者對現(xiàn)有的免疫治療反應(yīng)良好。因此，有必要探索其他潛在靶向。

本研究探討了CMTM6的表達(dá)水平，在TIMER數(shù)據(jù)庫中，發(fā)現(xiàn)與正常組織中的表達(dá)水平相比，CMTM6在皮膚黑色素瘤（SKCM）中，CMTM6在原發(fā)部位的表達(dá)要低于轉(zhuǎn)移部位。同時，CMTM6的表達(dá)在膀胱癌（BLCA）、COAD結(jié)腸腺癌（COAD）、食道癌（ESCA）、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）、胃癌（STAD）、甲狀腺癌（THCA）中高表達(dá)，而在腎嫌色細(xì)胞癌（KICH）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、肝細(xì)胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）中的表達(dá)水平較低。在多種數(shù)據(jù)庫中確定了在CMTM6表達(dá)的預(yù)后價值。對于患者的預(yù)后來說，在Prognoscan數(shù)據(jù)庫中，CMTM6在三種癌癥類型中發(fā)揮了不利作用，包括星形細(xì)胞瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，結(jié)直腸癌（COREAD）。同時，CMTM6在其他六種癌癥類型中起保護作用，包括乳腺癌，濾泡性淋巴瘤，皮膚黑色素瘤（SKCM），葡萄膜黑色素瘤（UVM），卵巢癌（OV），肺腺癌（LUAD）。在Kaplan-Meier Plotter對CMTM6的分析表明，CMTM6在四種癌癥中有害，包括腎透明細(xì)胞癌（KIRC），肝細(xì)胞癌（LIHC），胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC），嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）。在另外五種癌癥中，CMTM6則起到了保護作用，包括膀胱癌（BLCA），乳腺癌（BRCA），胸腺瘤（THYM），甲狀腺腺瘤（THCA），子宮體子宮內(nèi)膜癌（UCEC）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)有力地表明CMTM6可以作為泛癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。

腫瘤免疫浸潤細(xì)胞從血液遷移到腫瘤組織，并在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。越來越多的研究表明，腫瘤免疫浸潤細(xì)胞與免疫檢查點抑制和預(yù)后的功效密切相關(guān)。為了闡明CMTM6表達(dá)與各種免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，使用TIMER檢查了癌癥類型中浸潤免疫細(xì)胞類型的相對分?jǐn)?shù)，確定CMTM6表達(dá)是否與不同癌癥的免疫浸潤水平相關(guān)。與CD8+T細(xì)胞有關(guān)的癌癥有腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）、膀胱癌（BLCA）、乳腺癌（BRCA）、結(jié)腸腺癌（COAD）、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBC）、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）、腎嫌色細(xì)胞癌（KICH）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、腎乳頭狀細(xì)胞癌（KIRP）、腦低級別膠質(zhì)瘤（LGG）、肝細(xì)胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）、間皮瘤（MESO）、胰腺癌（PAAD）、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）、前列腺瘤（PRAD）、直腸癌（READ）、肉瘤（SARC）、皮膚黑色素瘤（SKCM）、胃癌（STAD）、甲狀腺癌（THCA），與CD4+T細(xì)胞有關(guān)的癌癥有頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、腎乳頭狀細(xì)胞癌（KIRP）、腦低級別膠質(zhì)瘤（LGG）、肝細(xì)胞癌（LIHC）、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）、皮膚黑色素瘤（SKCM）、胸腺癌（THYM），與中性粒細(xì)胞有關(guān)的癌癥為腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）、乳腺癌（BRCA）、宮頸癌（CESC）。

然而，盡管在多個數(shù)據(jù)庫中整合了信息，但這項研究仍然有局限性。首先，通過分析腫瘤組織信息，收集了大量的微陣列和測序數(shù)據(jù)。因此，免疫細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞水平分析可能引入了系統(tǒng)誤差。為了克服這一問題，日后應(yīng)進(jìn)行更高分辨率的研究，如使用單細(xì)胞測序。其次，這些數(shù)據(jù)庫中沒有反映CMTM6的分子功能。最后，本研究僅對CMTM6在不同數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)和患者生存期進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，未進(jìn)行體內(nèi)或體外實驗。未來在細(xì)胞和分子水平上對CMTM6的機制研究可以幫助闡明CMTM6的作用，可以幫助提供一個明確的答案。

總之，CMTM6可影響泛癌預(yù)后，并與免疫浸潤有關(guān)，CMTM6與TME中有關(guān)。CMTM6可作為泛癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。這些發(fā)現(xiàn)可能提供了一種基于免疫的抗腫瘤策略，包括控制腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境浸潤的能量系統(tǒng)。