秦天元，許德蓉，王一好，孫 超，畢真真，劉玉匯，張俊蓮，白江平*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省作物遺傳改良與栽培種創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.），在生物分類學(xué)中屬于茄科（Solanaceae）龍葵亞屬（Subg.Solanum），一年生植物，是全世界第一大糧菜兼用型作物[1,2]。馬鈴薯是塊莖類作物，在整個(gè)馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育過程中，逆境脅迫能夠改變馬鈴薯生長(zhǎng)期內(nèi)的源庫(kù)關(guān)系，進(jìn)而影響塊莖的形成，從而造成馬鈴薯產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降[3-5]。為了避免逆境脅迫造成的不利影響，植物通過調(diào)節(jié)自身細(xì)胞產(chǎn)生有利的化感物質(zhì)或啟動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)來響應(yīng)逆境脅迫，從而形成抵抗各種脅迫的自我保護(hù)機(jī)制，維持自身正常的生長(zhǎng)發(fā)育[6,7]。在響應(yīng)逆境脅迫的機(jī)制中，植物蛋白激酶磷酸化起著非常重要的作用，其中，SnRK2蛋白激酶家族是普遍存在于植物中的一類蔗糖非酵解型蛋白激酶，其功能主要參與脫落酸（Abscisic acid,ABA）依賴及非ABA依賴的非生物脅迫，從而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育[8,9]。根據(jù)前人的研究，在玉米中共發(fā)現(xiàn)SnRK2基因家族有11個(gè)成員，其中有7個(gè)家族成員分別受NaCl、低溫和熱處理誘導(dǎo)表達(dá)[10,11]。此外，楊樹中SnRK2家族成員PtSnRK2.5和PtSnRK2.7在擬南芥中的過表達(dá)表明，鹽脅迫下擬南芥的葉綠素含量和根系伸長(zhǎng)量相對(duì)于對(duì)照均保持不變，提高了植株的存活率。同時(shí)，PtSnRK2.7 或還可影響脂質(zhì)代謝、類黃酮代謝相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子和一些離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)[12]；甘蔗SnRK2 家族成員SoSnRK2.1在煙草中的過量表達(dá)可以提高煙草的抗旱性[13]；研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥種子在萌發(fā)、生長(zhǎng)和休眠等生育期AtSnRK2.2/3/6 基因在干旱脅迫后其表達(dá)量發(fā)生變化，表明這些基因可響應(yīng)ABA 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14-18]；此外，在水稻中關(guān)于SnRK2 家族成員的研究表明，在鹽脅迫下，SAPK4 基因可通過調(diào)節(jié)水稻體內(nèi)的離子平衡，來響應(yīng)逆境脅迫[19]。目前，越來越多的植物研究表明，SnRK2家族蛋白激酶可參與響應(yīng)植物非生物脅迫和ABA依賴[16,20,21]。

目前，關(guān)于SnRK2家族基因已在多種作物中得到了廣泛的研究。例如小麥[22,23]、玉米[24]、水稻[19,25]、高粱[26]、煙草[27]等。馬鈴薯作為全球第四大糧食作物，研究干旱脅迫下馬鈴薯相關(guān)基因的表達(dá)模式和分子機(jī)制，對(duì)于提高馬鈴薯品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要意義。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于馬鈴薯中StSnRK2基因家族成員的研究相對(duì)較少[28-30]。通過對(duì)前期在干旱條件下馬鈴薯StSnRK2基因成員表達(dá)譜的分析，發(fā)現(xiàn)StSnRK2家族成員中不同基因的表達(dá)存在差異。因此，本文采用比對(duì)的方法，從新發(fā)布的馬鈴薯全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中系統(tǒng)地鑒定并分析了StSnRK2 基因家族成員，并對(duì)其序列特征、染色體定位和基因復(fù)制等方面進(jìn)行了綜合分析。這些結(jié)果為進(jìn)一步分析馬鈴薯StSnRK2基因家族的分化過程和生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為馬鈴薯抗逆基因的挖掘和篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 馬鈴薯StSnRK2基因家族成員的鑒定

從Spud DB數(shù)據(jù)庫(kù)下載馬鈴薯最新雜合二倍體參考基因組序列（http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/rh_potato_download.shtml）鑒定馬鈴薯基因組中的StSnRK2基因家族成員[31]。利用SnRK2基因家族的隱馬爾可夫模型（注冊(cè)號(hào)：PF00069.25）和本地Blast等多種比對(duì)的方法進(jìn)行多重搜索[32]。此外，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中關(guān)于擬南芥、水稻、玉米等物種的SnRK2基因序列作為種子序列，為了盡可能地搜索真正的StSnRK2基因家族成員，使用e 值≤1e-20 來基于Blast算法進(jìn)行搜索。將經(jīng)過多重比對(duì)后的StSnRK2家族成員的蛋白序列提交到CDD 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/）來進(jìn)一步確認(rèn)符合StSnRK2保守域的最終家族基因成員[31,33,34]。

1.2 馬鈴薯StSnRK2基因的生物信息學(xué)分析

利用CDD 和Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)將最終鑒定到的StSnRK2基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。將所有家族成員基因的蛋白序列先使用ClustalX（版本1.83）軟件[35]結(jié)合系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行比對(duì)。將比對(duì)后的文件保存為meg格式后，再使用MEGA7軟件[36]進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，使用方法為最大似然數(shù)法，其中將Bootstrap 值設(shè)置為1 000，最后根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，可以將馬鈴薯StSnRK2基因成員分為不同的亞族。ExPASy網(wǎng)站（http://web.expasy.org/protparam/）[31]可用來計(jì)算StSnRK2基因成員的氨基酸數(shù)量、分子量和等電點(diǎn)（pI）等指標(biāo)。利用本地MEME工具（版本4.11.2，http://alternate.meme-suite.org/tools/meme）采用Perl 語(yǔ)言來搜索馬鈴薯StSnRK2 家族成員序列中的保守基序[31,37]。通過在線軟件（PG2C，http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）和（GSDS,http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）來分別構(gòu)建馬鈴薯StSnRK2家族成員基因的染色體位置圖和外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖。采用Perl 語(yǔ)言編寫代碼來提取馬鈴薯StSnRK2 家族成員基因編碼區(qū)上游1.5kb的序列，并提交到在線數(shù)據(jù)庫(kù)PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）中進(jìn)行該基因家族中重要的順式作用元件的鑒定。利用MCScanX[38]和Circos[39]軟件來研究馬鈴薯不同染色體間StSnRK2 基因的串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制現(xiàn)象，并借助于煙草參考基因組來進(jìn)一步探究馬鈴薯StSnRK2 基因與煙草之間的比對(duì)基因組分析[31]。

1.3 馬鈴薯StSnRK2的基因表達(dá)模式分析

本試驗(yàn)利用馬鈴薯數(shù)據(jù)庫(kù)（http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml）中已上傳的關(guān)于馬鈴薯二代Illumina 的公共RNA-seq 數(shù)據(jù)，并自主進(jìn)行Cufflink和Tophat的分析。具體挑選為馬鈴薯StSnRK2 基因在150 mmol/L NaCl 下處理24 h、260 μmol/L 甘露醇（Mannitol）下處理24 h、50 μmol/L ABA下處理24 h 和10 μmol/L吲哚乙酸（Indoleacetic acid，IAA）下處理24 h的FPKM值，并根據(jù)其FPKM 值進(jìn)一步研究馬鈴薯StSnRK2 基因家族中不同基因的表達(dá)模式，運(yùn)用R 軟件中的Heatmap包來繪制馬鈴薯StSnRK2基因家族的表達(dá)模式熱圖。

1.4 馬鈴薯StSnRK2基因的qPCR分析驗(yàn)證

采用RNA prep Pure Plant Kit（TIANGEN）試劑盒來提取馬鈴薯的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性、用核酸測(cè)定儀（P100）檢測(cè)RNA的濃度與純度。檢測(cè)合格后，使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（TOYOBO）反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后期基因表達(dá)量的測(cè)定。使用QuantStudio5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（ABI，美國(guó)）進(jìn)行qPCR 的測(cè)定。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex Tap TM 10 μL，引物F（10 μmol/L）0.8 μL，引物R（10 μmol/L）0.8 μL，cDNA 2 μL，ROX Reverence Dye（2X）0.4 μL，ddH2O 6 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，58℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃變性15 s，58℃退火60 s，95℃處理15 s。試驗(yàn)以肌動(dòng)蛋白（actin）為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算馬鈴薯StSnRK2 基因的相對(duì)表達(dá)量[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯StSnRK2基因家族成員的鑒定與分析

采用本地Blast的生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析，從馬鈴薯‘RH89-039-16’全基因組中共鑒定和分析了StSnRK2基因38個(gè)StSnRK2，再通過局部保守序列的BLASTP發(fā)現(xiàn)28個(gè)序列。刪除兩種方法比對(duì)后的重復(fù)序列，最終保留26 個(gè)特征序列，并提交至CDD 和Pfam在線數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行保守StSnRK2蛋白結(jié)構(gòu)域的確認(rèn)。最后，共鑒定到23 個(gè)StSnRK2 家族成員，分別命名為StSnRK2.1～StSnRK2.23（表1）。表1 列出了基因ID、染色體位置、氨基酸數(shù)、分子量和pI。馬鈴薯中StSnRK2 家族基因長(zhǎng)度范圍從286（RHC11H2G0520）到491 個(gè)氨基酸（RHC01H2G4721）不等。StSnRK2 的分子量為32.6（RHC11H2G0520）～55.4 kD（RHC01H2G4721）。StSnRK2 基因分布于12對(duì)馬鈴薯染色體上。StSnRK2 基因的預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為4.51（RHC11H2G0520）～9.47（RHC02H2G1792）。以上結(jié)果表明，StSnRK2基因家族中，不同基因的長(zhǎng)度相差較大，且與分子量有關(guān)。此外，大多數(shù)StSnRK2蛋白（65%）的pI小于7.0，由于pI主要取決于氨基酸中酸性氨基酸和堿性氨基酸的比值，因此推斷該家族大多數(shù)基因蛋白可能是一類酸性蛋白（表1）。

表1 馬鈴薯StSnRK2基因家族信息Table 1 Information of StSnRK2 gene family in potato

2.2 馬鈴薯StSnRK2氨基酸序列同源性比對(duì)及其進(jìn)化分析

StSnRK2基因家族成員蛋白主要由2部分組成，其中70%的部分為N末端激酶結(jié)構(gòu)域，另外30%的部分位于C末端。其中，能夠響應(yīng)非生物脅迫的激活區(qū)域（Domain Ⅰ）和ABA激活結(jié)構(gòu)域（Domain Ⅱ）的部分主要分布在C末端。對(duì)馬鈴薯23條StSnRK2氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因家族在N端具有較高的保守性，屬于StSnRK2基因家族成員的核心區(qū)域。C末端存在響應(yīng)非生物脅迫的激活區(qū)域（Domain Ⅰ），該結(jié)構(gòu)域存在于所有家族成員中。除StSnRK2.4和StSnRK2.20兩個(gè)蛋白外，其余21個(gè)StSnRK2蛋白C末端均存在能夠響應(yīng)ABA的結(jié)構(gòu)域（Domain Ⅱ）（圖1）。

圖1 馬鈴薯23個(gè)StSnRK2蛋白多序列比對(duì)Figure 1 Alignment of amino acid sequences of StSnRK2 in potato

為了進(jìn)一步了解馬鈴薯StSnRK2基因家族成員的同源性，利用水稻、擬南芥、玉米等物種中已鑒定出的SnRK2基因?yàn)榉N子序列，共同構(gòu)建了與馬鈴薯StSnRK2 的系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類結(jié)果顯示為3 個(gè)亞族：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，分別含有13、8、2個(gè)StSnRK2基因（圖2）。

圖2 馬鈴薯StSnRK2基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 2 Unrooted phylogenetic tree of potato StSnRK2 gene family

2.3 馬鈴薯StSnRK2基因家族的結(jié)構(gòu)特征分析

馬鈴薯StSnRK2基因家族3個(gè)亞族間的基因結(jié)構(gòu)有顯著差異。其中，I亞族中外顯子的數(shù)目為1～10個(gè)，且有部分基因在進(jìn)化過程中可能完全丟失了內(nèi)含子；II亞族為7～9個(gè)，而III亞族成員外顯子數(shù)目只有9 個(gè)（圖3A）。同一亞族的基因外顯子結(jié)構(gòu)相似，但相似的外顯子長(zhǎng)度卻有不同的基因全長(zhǎng)，這說明內(nèi)含子長(zhǎng)度可能有很大的差異。由圖3B可知，馬鈴薯StSnRK2基因家族蛋白共鑒定獲得10個(gè)保守基序（Motif）。其中，I亞族的蛋白保守序列較II和III亞族結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，第I亞族中包含所有保守基序?yàn)镸otif 1～Motif 10，第II亞族和第III亞族中均只包含Motif 1～Motif 9，Motif 10 只特異性位于亞族Ⅰ中。這些結(jié)果表明，馬鈴薯StSnRK2 基因家族均含有Motif 1～Motif 9結(jié)構(gòu)域，但部分成員的其他結(jié)構(gòu)域并不完整。從3 個(gè)亞族的結(jié)構(gòu)來看，I 亞族包含Motif 10的基因均不含Motif 4和Motif 8；II亞族和III亞族中Motif在各個(gè)基因上的分布基本一致。說明這些基因在遺傳進(jìn)化過程中可能存在遺傳信息的遺失與改變（圖3B）。

圖3 馬鈴薯StSnRK2基因家族成員的結(jié)構(gòu)特征Figure 3 A structural characteristics of StSnRK2 family in potato

2.4 馬鈴薯StSnRK2基因啟動(dòng)子與脅迫相關(guān)的順式元件分析

為了進(jìn)一步研究StSnRK2基因在非生物脅迫反應(yīng)中的潛在調(diào)控機(jī)制，利用Perl 語(yǔ)言提取StSnRK2家族基因編碼區(qū)上游1.5 kb的序列提交到PlantCare網(wǎng)站進(jìn)行順式元件的預(yù)測(cè)。共檢測(cè)到6個(gè)非生物脅迫響應(yīng)元件，分別為脫落酸響應(yīng)元件ABRE，生長(zhǎng)素響應(yīng)元件AuxRR-core，與分生組織表達(dá)有關(guān)的作用元件CAT-box，參與干旱誘導(dǎo)相關(guān)的作用元件MBS，赤霉素響應(yīng)元件TATC-box以及參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的作用元件TC-rich。通過3個(gè)亞族中不同順式元件的分布情況可知，馬鈴薯StSnRK2基因家族均含有ABRE，CAT-box，MBS和TATC-box 順式作用元件，其中Ⅰ亞族基因相對(duì)于Ⅱ亞族富含更多參與生長(zhǎng)素響應(yīng)元件AuxRR-core，而Ⅱ亞族基因相對(duì)于Ⅲ亞族富含更多參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的作用元件TC-rich（圖4）。以上結(jié)果表明，StSnRK2基因的表達(dá)與這些非生物脅迫應(yīng)激相關(guān)且StSnRK2基因?qū)Σ煌姆巧锩{迫作出不同反應(yīng)可能也與此相關(guān)。

圖4 馬鈴薯StSnRK2基因啟動(dòng)子順式元件預(yù)測(cè)分析Figure 4 Predicted analysis of cis-elements in StSnRK2 promoters

2.5 馬鈴薯StSnRK2基因家族的染色體定位分析與基因復(fù)制

依據(jù)馬鈴薯StSnRK2染色體位置信息，23條基因不均勻地分布在馬鈴薯其中9對(duì)染色體，共計(jì)15條染色體上（圖5）。其中4_1號(hào)染色體上分布的基因較多為3 條，其余染色體上大多分布于1 到2 條基因。3_2、4_1、7_1和11_2號(hào)染色體上的基因主要分布在其上端，1_1、1_2、2_1、5_1、5_2、8_1和8_2號(hào)染色體的基因則分布在其下端。通過3個(gè)亞族基因在染色體上分布情況比較，發(fā)現(xiàn)I亞族基因主要集中在1_1、1_2、2_1、2_2、3_2 和7_1 號(hào)染色體上；Ⅱ亞族基因主要集中在4_1、4_2和11_2號(hào)染色體上；Ⅲ亞族基因主要集中在8_1 和8_2 號(hào)染色體上。此外，12_1和12_2號(hào)染色體上共同含有Ⅰ亞族和Ⅱ亞族基因。在進(jìn)化過程中，串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制共同參與了基因家族的產(chǎn)生，為了進(jìn)一步研究馬鈴薯StSnRK2基因家族在進(jìn)化過程中遺傳信息是否發(fā)生了串聯(lián)重復(fù)或大片段基因復(fù)制現(xiàn)象，通過MCScanX及下游程序?qū)υ摷易寤虻墓簿€性和串聯(lián)重復(fù)基因進(jìn)行了分析（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15 個(gè)基因被證實(shí)為串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制基因，占StSnRK2基因家族所有基因的65.2%。其中，位于1_1、1_2、4_1、4_2、5_1、5_2、8_1 和8_2 號(hào)染色體上的8個(gè)基因?yàn)?對(duì)獨(dú)立的串聯(lián)重復(fù)基因，占所有共線性基因的53.3%，其余7 個(gè)基因不但發(fā)生了串聯(lián)重復(fù)同時(shí)也發(fā)生了片段復(fù)制，且不均勻分布于4_1、4_2、7_1、12_1 和12_2 號(hào)染色體，占所有共線基因的46.7%。根據(jù)以上結(jié)果，可以推斷，串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制共同促進(jìn)了馬鈴薯StSnRK2 基因家族的擴(kuò)大。

圖5 StSnRK2基因在馬鈴薯染色體上的位置Figure 5 Chromosome location of StSnRK2 genes in potato

圖6 馬鈴薯StSnRK2基因家族的共線性分析與基因復(fù)制Figure 6 Collinearity analysis and gene replication of potato StSnRK2 gene family

2.6 煙草和馬鈴薯StSnRK2基因家族的比較基因組分析

為了更進(jìn)一步研究馬鈴薯StSnRK2 基因的進(jìn)化機(jī)制，基于煙草和馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建物種間全基因組共線性關(guān)系。結(jié)果顯示（圖7），共有10 條StSnRK2 基因與5 條煙草NtStSnRK2 基因構(gòu)成10 條共線性關(guān)系，其中共線性關(guān)系主要集中于馬鈴薯1、3、4、7、8 和12 這6 對(duì)染色體與煙草1、8、9和11號(hào)染色體之間。在對(duì)煙草和馬鈴薯基因組間共線性進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯StSnRK2基因與煙草之間的共線性主要集中在1 號(hào)染色體上，馬鈴薯1號(hào)、4號(hào)和12號(hào)染色體的下半部分與煙草的1號(hào)染色體上半部分同源，而7號(hào)和12號(hào)染色體上半部分與煙草的11 號(hào)染色體下半部分同源。對(duì)于上述結(jié)果中存在的同源基因?qū)Φ奈恢眉邦愋筒町?，推測(cè)可能與近緣物種的祖先分化有關(guān)，也進(jìn)一步為染色體間能夠進(jìn)行基因片段復(fù)制融合提供了有力證據(jù)，同時(shí)也說明同源染色體間可能還存在一些染色體間不同位置的重排現(xiàn)象。

圖7 煙草和馬鈴薯StSnRK2基因家族基因的比較基因組分析Figure 7 Comparative genomic analysis of StSnRK2 gene family genes in tobacco and potato

2.7 馬鈴薯StSnRK2基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式分析

本研究中使用的馬鈴薯RNA-seq 數(shù)據(jù)為FPKM。與原始讀取計(jì)數(shù)相比，F(xiàn)PKM值可以更好地減少樣本差異。利用基于R語(yǔ)言的DESeq2軟件，分析并調(diào)取23 個(gè)馬鈴薯StSnRK2 基因在150 mmol/L NaCl下處理24 h、260 μmol/L Mannitol下處理24 h、50 μmol/L ABA下處理24 h和10 μmol/L IAA下處理24 h的FPKM值，并根據(jù)其FPKM值進(jìn)行不同脅迫下的基因表達(dá)分析。結(jié)果顯示，馬鈴薯StSnRK2基因家族的3個(gè)亞族基因在不同脅迫處理下具有不同程度的表達(dá)趨勢(shì)。其中，在亞族I中的基因主要響應(yīng)NaCl、甘露醇和ABA脅迫，且53.8%的基因在ABA處理24 h后表達(dá)量顯著升高；II亞族基因主要響應(yīng)ABA 脅迫，87.5%的基因在ABA 處理24 h 后高表達(dá)；III亞族基因則主要響應(yīng)NaCl和甘露醇脅迫，在脅迫24 h時(shí)基因表達(dá)量有明顯的上升。3個(gè)亞族內(nèi)部呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，有15 個(gè)StSnRK2 基因在ABA 脅迫24 h 時(shí)表達(dá)量發(fā)生上調(diào)，證明這部分基因?qū)︸R鈴薯響應(yīng)ABA 脅迫具有重要的作用。此外干旱脅迫下的差異表達(dá)模式表明，StSnRK2 基因家族在不同脅迫條件下3 個(gè)亞族內(nèi)基因具有不同的反應(yīng)和調(diào)控機(jī)制（圖8）。隨后重新處理了材料，并在3個(gè)亞族內(nèi)隨機(jī)選取了8個(gè)基因StSnRK2.2、StSnRK2.5、StSnRK2.6、StSnRK2.9、StSnRK2.10、StSnRK2.12、StSnRK2.16和StSnRK2.22進(jìn)行qPCR驗(yàn)證（圖9）。并利用qPCR結(jié)果和RNAseq 數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，qPCR與RNAseq之間具有較強(qiáng)的相關(guān)性，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的可靠性（圖10）。以上結(jié)果表明，StSnRK2基因家族成員可響應(yīng)鹽、ABA、IAA等多種非生物脅迫。

圖8 馬鈴薯StSnRK2基因在不同脅迫下的表達(dá)模式分析Figure 8 Expression patterns of potato StSnRK2 genes under different stresses

圖9 馬鈴薯StSnRK2基因家族部分基因在不同脅迫下的基因表達(dá)Figure 9 Gene expressions of some genes in potato StSnRK2 gene family under different stresses

圖10 馬鈴薯StSnRK2基因家族部分基因qPCR和RNAseq數(shù)據(jù)間的相關(guān)性分析Figure 10 Correlation analysis between qPCR and RNAseq data of some genes in potato StSnRK2 gene family

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目前，中國(guó)馬鈴薯主要種植于年平均降水量小于500 mm的干旱和半干旱地區(qū)。干旱脅迫會(huì)極大的影響馬鈴薯的植株長(zhǎng)勢(shì)，嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)量的下降甚至絕收[40,41]。SnRK2是一類植物中特有的蔗糖非酵解型蛋白激酶，越來越多的研究表明StSnRK2家族成員在植物響應(yīng)抗逆脅迫中發(fā)揮重要的作用[42-44]。隨著許多植物全基因組序列的獲得，SnRK2基因已經(jīng)在多個(gè)物種中被鑒定出來，如擬南芥[17,28]、小麥[22,23]、玉米[24]和水稻[19,25]等。

本研究從馬鈴薯最新發(fā)表的參考基因組‘RH89-039-16’中經(jīng)過Fgensh[45]和Blast[46]方法克隆得到了馬鈴薯StSnRK2基因家族中的23成員，分別命名為StSnRK2.1～StSnRK2.23。序列比對(duì)結(jié)果表明，馬鈴薯StSnRK2 基因家族成員在N 端相對(duì)保守，而在C端高度特異，這與馬宗桓等[47]在葡萄中的研究結(jié)果一致。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示StSnRK2基因可分為3個(gè)不同的亞家族，而不同亞族的結(jié)構(gòu)域差異又決定了其功能的多樣性，這與Li等[26]在高粱中的研究結(jié)果相似。除此之外，有研究表明植物在受到干旱等逆境脅迫時(shí)，通過調(diào)控體內(nèi)信號(hào)傳遞，進(jìn)而激活相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子并調(diào)控植物體內(nèi)相關(guān)抗逆基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[48]。本試驗(yàn)通過對(duì)馬鈴薯StSnRK2基因家族順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)3 個(gè)亞族基因中均含有ABRE，CAT-box，MBS 和TATC-box 順式作用 元件，這對(duì)研究該家族響應(yīng)抗逆性順式作用元件的功能提供一定的參考。

研究發(fā)現(xiàn)基因家族的擴(kuò)展和基因組進(jìn)化機(jī)制主要取決于基因復(fù)制事件，其主要的復(fù)制模式為串聯(lián)復(fù)制和片段復(fù)制[31,49]。在本研究中，通過基因共線性分析發(fā)現(xiàn)，在馬鈴薯StSnRK2家族成員中共檢測(cè)到15個(gè)StSnRK2重復(fù)基因，其中包括8個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因和7 個(gè)片段重復(fù)基因（圖6），這表明串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制共同促進(jìn)了馬鈴薯StSnRK2基因家族的進(jìn)化，這與Qin等[50]在小麥中關(guān)于SWEET基因家族成員擴(kuò)展的研究結(jié)果相似。與煙草比對(duì)基因組研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同染色體間不僅能夠進(jìn)行基因片段復(fù)制融合而且還可能存在一些染色體間不同位置的重排現(xiàn)象，這種復(fù)制現(xiàn)象在大多數(shù)植物中非常普遍，且在現(xiàn)代植物核型形成的重要分子機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[51]。

SnRK2s是植物特有的能夠響應(yīng)非生物脅迫的蛋白激酶家族之一，有研究表明SnRK2s能夠通過結(jié)合脫落酸反應(yīng)元件（ABFs）來激活下游基因，從而激活A(yù)BA響應(yīng)基因的表達(dá)[21,52]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)有15個(gè)StSnRK2 基因在50 μmol/L 的ABA 處理24 h 時(shí)表達(dá)量發(fā)生明顯的上調(diào)表達(dá)，推測(cè)這些成員能夠響應(yīng)ABA激素信號(hào)傳導(dǎo)并參與植物調(diào)控脅迫應(yīng)激過程。除上述ABA誘導(dǎo)途徑外，SnRK2s亞家族成員對(duì)其他非生物脅迫（NaCl、Mannitol、IAA）也高度敏感。上述結(jié)果表明馬鈴薯StSnRK2基因家族成員可以通過多種途徑對(duì)逆境脅迫做出反應(yīng)，進(jìn)而維持植物細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)發(fā)育。本研究為馬鈴薯StSnRK2基因家族成員提供了較全面的信息，為進(jìn)一步研究該基因家族每個(gè)成員的功能和作用機(jī)理提供了理論依據(jù)。

本研究通過對(duì)馬鈴薯StSnRK2家族進(jìn)行全基因組分析，最終確定出23個(gè)StSnRK2基因。基于生物信息學(xué)方法，對(duì)StSnRK2基因在基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育和逆境相關(guān)順式元件等方面進(jìn)行了全面分析，并根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化和基因結(jié)構(gòu)特征將馬鈴薯StSnRK2家族基因分為3個(gè)亞族，不同亞族內(nèi)基因的結(jié)構(gòu)、保守Motif及順式作用元件等均不同；StSnRK2基因不均等地分布在12 對(duì)染色體上，并有多個(gè)基因發(fā)生了片段復(fù)制，且染色體間不僅能夠進(jìn)行基因片段復(fù)制融合還可能存在一些染色體間不同位置的重排現(xiàn)象。StSnRK2 基因家族3 個(gè)亞族之間具有明顯的響應(yīng)不同逆境脅迫的差異性表達(dá)，且有部分基因協(xié)同調(diào)控了馬鈴薯應(yīng)對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)。