寧燕夏, 蘇月華, 楊 梅

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福州 350117)

先天性免疫主要包括細(xì)胞免疫和體液免疫，它們既可以單獨發(fā)揮作用也能相互聯(lián)系一起抵御入侵的病原生物(Lemaitre and Hoffmann, 2007)。當(dāng)機體接收到免疫刺激，如病原微生物入侵或物理機械創(chuàng)傷等，昆蟲中的血細(xì)胞和脂肪體等會快速合成并釋放抗菌肽(例如：天蠶素、凝集素、溶菌酶)等進(jìn)行防御。目前多種昆蟲的溶菌酶被研究，例如：棉鈴蟲Helicoverpaarmigera在幼蟲到蛹的變態(tài)發(fā)生時溶菌酶表達(dá)瞬時增加(Zhangetal., 2009)，蠟螟Galleriamellonella也是幼蟲到蛹的變態(tài)發(fā)生時溶菌酶活性顯著增強(Altincicek and Vilcinskas, 2006)，而岡比亞按蚊Anophelesgambiae在不同組織以及不同發(fā)育階段均有溶菌酶的表達(dá)(Lietal., 2005)。

溶菌酶屬于堿性蛋白酶，通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的完整結(jié)構(gòu)(水解肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的糖苷鍵)，最終導(dǎo)致細(xì)菌裂解死亡，可稱其為胞壁質(zhì)酶(muramidase)(York, 2018)。依據(jù)來源進(jìn)行分類，可分為4種類型：動物溶菌酶(c型溶菌酶、g型溶菌酶和i型溶菌酶)、植物溶菌酶、真菌和細(xì)菌溶菌酶、噬菌體溶菌酶(Shahmohammadi, 2017; Jietal., 2019)。溶菌酶是一種小分子抗菌肽，是從昆蟲的血淋巴中分離純化出來的抗菌因子之一，又稱其為細(xì)胞壁溶解酶，主要通過水解細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)的肽聚糖來殺死入侵的病原體，在昆蟲的體液免疫中扮演著重要角色。它以非特異性的方式在包括昆蟲在內(nèi)的多種生物體中產(chǎn)生，并作為針對入侵病原體的先天免疫防御的武器庫，在缺乏獲得性免疫系統(tǒng)的昆蟲中起著重要作用(Nayaketal., 2018)。

小菜蛾P(guān)lutellaxylostella屬鱗翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，別名吊絲蟲，是危害十字花科蔬菜的世界性害蟲之一(Linetal., 2018)，每年全球由小菜蛾造成的經(jīng)濟損失以及防治成本高達(dá)40～50億美元(Furingetal., 2013)。由于小菜蛾世代周期短、繁殖能力強，并對多種殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性，使得對小菜蛾的防治日趨嚴(yán)峻。隨著近年來昆蟲天然免疫系統(tǒng)研究的深入，科學(xué)家開始把眼光集中在基于害蟲天然免疫系統(tǒng)為靶標(biāo)的生物防治技術(shù)的開發(fā)上。而溶菌酶是動物天然免疫系統(tǒng)中的一類重要效應(yīng)因子，有研究表明，在蚊子心臟中發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)型免疫因子(溶菌酶 c-1)參與了蚊子的免疫應(yīng)答(Cardoso-Jaimeetal., 2021)；Liao等(2018)從紅色沼澤螯蝦克氏原螯蝦Procambarusclarkii克隆了一種c型溶菌酶，發(fā)現(xiàn)這種溶菌酶能夠幫助消除小龍蝦血淋巴中的侵入細(xì)菌，并通過促進(jìn)血細(xì)胞吞噬作用來保護小龍蝦免于死亡；Mai等(2014)從紅斑石斑魚Epinephelusakaara中克隆了編碼c型溶菌酶的基因，其編碼蛋白為一種組成型和可誘導(dǎo)的急性期蛋白，參與了大腸桿菌Escherichiacoli的先天免疫防御。因此，研究小菜蛾溶菌酶的功能，有助于深入認(rèn)識小菜蛾的免疫防御機理，為小菜蛾的生物防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 供試生物材料和試劑

1.1.1供試?yán)ハx及飼養(yǎng)：小菜蛾取自福建省福州市閩侯縣南通鎮(zhèn)，人工飼養(yǎng)，溫度為25±2℃，相對濕度為70%～80%，光周期為16L∶8D。幼蟲飼喂人工飼料(含小麥胚芽粉37.5 g，酵母20 g，蔗糖10 g，蘿卜子粉3 g，尼泊金0.5 g，山梨酸1 g，復(fù)合維生素0.8 g，維生素C 1 g，菜籽油1 mL，亞油酸0.1 mL，瓊脂粉6 g，加雙蒸水250 mL)，成蟲喂以10%的蜂蜜溶液。

1.1.2菌株、質(zhì)粒和試劑：大腸桿菌E.coliDH5α和pET-29a載體由本實驗室保存；pMD19-T載體購自TaKaRa公司；大腸桿菌Origami 2(DE3)菌株由福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院舒正玉老師惠贈;停滯棒桿菌Corynebacteriumstationis和藤黃微球菌Micrococcusluteus均購自廣東省微生物菌種保藏中心；志賀氏菌Shigellasp.由福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院付新苗老師惠贈；蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)、金黃色葡萄球菌Staphyloccocusaureus、大腸桿菌和沙門氏菌Salmonellasp.為本實驗室保存。

Wizard? SV Gel和PCR Clean-Up System DNA膠回收試劑盒和Eastep? Super總RNA提取試劑盒均購自Promega公司；RACE反轉(zhuǎn)試劑盒SMARTer? RACE 5′/3′ Kit Components、ExTaq酶、DNA Marker、T4 DNA連接酶、DNA限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III均購自TaKaRa公司。

1.2 小菜蛾溶菌酶基因RACE克隆

根據(jù)TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒說明書提取小菜蛾3齡幼蟲總RNA，按SMARTer? RACE 5′/3′ Kit Components試劑盒合成5′ RACE-Ready cDNA與3′ RACE-Ready cDNA。利用引物(5′-RACE F1: 5′-CTGGCACTTGTTCTTCCA TCCATACC-3′; 3′-RACE F1: 5′-TCTTCTGACTGTGA GCTGGTGAGGG-3′)分別與UPM引物組合，進(jìn)行第1輪PCR擴增；擴增產(chǎn)物稀釋10倍后作為模板，以引物5′-RACE引物(F2: 5′-ACTGCGACGCCTTCG TGATGT-3′)和3′-RACE引物(F2: 5′-GAGACACG GGCAAGGTGAGCA-3′)分別與UPS組合，進(jìn)行第2輪PCR擴增5′端與3′端目標(biāo)序列，經(jīng)膠回收后連接pMD19-T，送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序，測序結(jié)果用DNAStar進(jìn)行拼接。

1.3 小菜蛾溶菌酶基因生物信息學(xué)分析

對1.2節(jié)拼接獲得的小菜蛾溶菌酶基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用ExPASy網(wǎng)站的Protparam(http:∥web.expasy.org/protparam/)分析該蛋白的理化性質(zhì)；通過SignalP 4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析該蛋白質(zhì)是否有信號肽序列；利用在線工具TMHMM-2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析該蛋白質(zhì)是否有跨膜結(jié)構(gòu)；通過MEGA 7.0軟件對序列進(jìn)行同源比對，同時采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.4 小菜蛾溶菌酶的原核表達(dá)與純化

根據(jù)1.2節(jié)擴增獲得的小菜蛾溶菌酶基因序列，并結(jié)合表達(dá)載體pET-29a酶切位點信息設(shè)計含酶切位點的引物(上游引物引入BamH I，下游引物引入Hind III)：F′引物：5′-CGCGGATCCAAGGTA TTTTCTTCAGACTGTGAGCTGG-3′；R′引物：5′-CCC AAGCTTGCACTTGCTAACATCAGGTAGGGCT-3′。并由上海生物工程有限公司合成。PCR擴增獲得目的基因，擴增體系(20 μL)：ddH2O 10.9 μL，10×ExTaqBuffer 1.5 μL，dNTP Mixture 0.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，以1.2節(jié)的pMD19-T-Pxlys為模板1 μL，ExTaq0.15 μL。擴增程序：95℃ 5 min; 95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min。擴增產(chǎn)物連接pMD19-T，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α細(xì)胞，測序正確后，提取質(zhì)粒；用BamH I酶和Hind III酶對重組質(zhì)粒pMD19-T-Pxlys和pET-29a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，以構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-29a-Pxlys。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Origami 2(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，篩選重組工程菌。以空載pET-29a作為對照，在嚴(yán)格無菌的條件下，取50 μL驗證正確的重組表達(dá)菌株接種于含100 mg/mL卡那霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 230 r/min條件下過夜震蕩培養(yǎng)。次日按照1%的接種量，接種于含100 mg/mL卡那霉素的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 230 r/min震蕩培養(yǎng)，使其菌濃度至OD600約為0.6左右，重組菌于IPTG終濃度0.6 mmol/L，溫度為16℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h，以未加IPTG誘導(dǎo)作為對照組，SDS-PAGE法分析蛋白表達(dá)情況。批量發(fā)酵工程菌株，超聲波破碎后，利用ATKA蛋白純化儀進(jìn)行Ni柱親和層析，純化重組表達(dá)蛋白Pxlys，以HiTrapTMDesating柱脫去蛋白液中的咪唑，SDS-PAGE法分析蛋白純化情況。

1.5 小菜蛾重組蛋白Pxlys的抑菌活性鑒定

1.5.1抗菌譜的檢測：參考張洋(2016)和王藝穎(2018)的研究方法，利用牛津杯法檢測重組溶菌酶蛋白Pxlys的抗菌譜，該方法是通過觀察抑菌圈的大小來判斷樣品對該菌的抑菌能力，抑菌圈越大說明該蛋白的抗菌能力就越強(馬俊, 2016)。取革蘭氏陽性細(xì)菌停滯棒桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌以及革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌和蘇云金芽孢桿菌劃線活化，挑取活化后的單菌落過夜培養(yǎng)，次日按1%的接種量加到30 mL的LB液體培養(yǎng)基中發(fā)酵至OD600為0.5，備用。

離心收集1 mL待測菌液，用PBS緩沖液洗滌3次，用1 mL的PBS緩沖液懸浮菌體，經(jīng)微孔濾膜過濾除菌，取100 μL備好的OD600為0.5的菌液均勻涂布于LB平板；待平板上的菌液干后，用鑷子將滅菌后的牛津布置于LB培養(yǎng)基表面，每個平板均勻放置3個牛津杯，吸取1.4節(jié)純化后200 μL的小菜蛾重組蛋白Pxlys液加入到牛津杯中，25℃培養(yǎng)，觀察抑菌圈現(xiàn)象，測量抑菌圈的直徑采用十字交叉法量取，重復(fù)3次。

1.5.2最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)的檢測：參考李勇(2016)采用液體生長抑制法，離心收集1.5.1節(jié)中1 mL已培養(yǎng)好的停滯棒桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，用1 mL LB液體培養(yǎng)基制成菌懸液，并將待測菌稀釋至原濃度(OD600約為0.5)的10-4倍；1.4節(jié)純化的重組蛋白Pxlys液經(jīng)微孔濾膜過濾除菌后，再用已滅菌的PBS緩沖液按2倍比例稀釋，取無菌的96孔板，每孔中分別加入100 μL稀釋好的小菜蛾重組蛋白Pxlys液和100 μL新鮮配制的菌液，以不加蛋白液用PBS代替的孔為對照組，重復(fù)3次；過夜培養(yǎng)，利用酶標(biāo)儀檢測OD600處的吸光值，根據(jù)試驗孔與對照孔中細(xì)菌的生長情況，進(jìn)行比較判斷；菌液吸光值沒有增加且肉眼觀察無明顯細(xì)菌生長的對應(yīng)最低蛋白濃度即為所測菌的MIC。

1.5.3掃描電鏡觀察細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)：離心收集1.5.1節(jié)中1 mL已培養(yǎng)好的停滯棒桿菌和大腸桿菌菌液，用PBS 緩沖液(pH 7.4)洗滌3次，制成菌懸液，并將待測菌稀釋至原濃度(OD600約為0.5)的10-2倍。在停滯棒桿菌中分別加入Pxlys使得終濃度為1×MIC(50 μg/mL)和4×MIC(200 μg/mL)，25℃孵育8 h；在大腸桿菌中分別加入Pxlys使得終濃度為1×MIC(100 μg/mL)和4×MIC(400 μg/mL)，25℃孵育8 h；只加1 mL PBS不加溶菌酶的處理為對照。孵育結(jié)束后，離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌菌體3～4次，再加入2.5%戊二醛溶液，置于4℃冰箱固定2 h，離心棄去上清，用0.1 mol/L PBS(pH 7.4)沖洗4～5次，再用乙醇梯度脫水，將處理好樣品置于硅片上，室溫干燥后，用離子濺射鍍膜儀噴金，在掃描電鏡Nova NanoSEM 230中進(jìn)行觀察，拍照。

2 結(jié)果

2.1 小菜蛾溶菌酶基因克隆和序列分析

RACE擴增的5′端與3′端分別出現(xiàn)單一條帶，與預(yù)期結(jié)果大小相近，表明擴增獲得小菜蛾溶菌酶基因5′端和3′端的產(chǎn)物?；跀U增得到的5′端和3′端產(chǎn)物進(jìn)行回收測序，并利用SeqMan進(jìn)行序列拼接，結(jié)果顯示成功克隆獲得的小菜蛾溶菌酶基因，命名為Pxlys(GenBank登錄號：MN702780)，開放閱讀框長423 bp，編碼140個氨基酸。Protparam分析結(jié)果表明該蛋白相對分子質(zhì)量為15.79 kD，理論等電點是8.91。SignalP 4.1分析結(jié)果表明該蛋白有信號肽存在，且位于第19-20位氨基酸之間，該蛋白為分泌蛋白，而TMHMM預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

2.2 小菜蛾溶菌酶基因系統(tǒng)進(jìn)化

序列比對(圖1)和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明(圖2)，Pxlys序列與棉鈴蟲Heliothisvirescens、家蠶Bombyxmori、大豆食心蟲Leguminivoraglycinivorella和亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis等的溶菌酶序列都具有60%以上的一致性，與NCBI中小菜蛾溶菌酶序列具有100%的一致性，確定本研究所獲得的基因Pxlys為小菜蛾溶菌酶基因。

圖1 小菜蛾P(guān)xlys與同源蛋白序列比對

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的小菜蛾P(guān)xlys與同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(重復(fù)1 000次)

2.3 小菜蛾溶菌酶原核表達(dá)及純化

重組工程菌大腸桿菌Origami 2(DE3)-pET-29a-Pxlys經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，與未誘導(dǎo)的對照組(泳道1)相比較，誘導(dǎo)的樣品(泳道2)約在19 kD出現(xiàn)目標(biāo)條帶，說明成功表達(dá)目標(biāo)蛋白；從泳道3可看出蛋白液與鎳柱較好地結(jié)合；經(jīng)不同濃度的洗脫液洗脫(泳道4-7)，成功純化目標(biāo)蛋白(圖3)。

圖3 小菜蛾溶重組蛋白Pxlys的純化

2.4 小菜蛾溶菌酶Pxlys的抑菌活性

結(jié)果表明，溶菌酶Pxlys對革蘭氏陽性細(xì)菌停滯棒桿菌、藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌以及革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌、志賀氏菌和沙門氏菌均有明顯的抑菌活性，對革蘭氏陽性細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌也有抑菌活性(圖4)；但溶菌酶對不同類型的細(xì)菌表現(xiàn)出不一樣的抑菌活性，對革蘭氏陽性細(xì)菌表現(xiàn)出的抑菌圈比對革蘭氏陰性細(xì)菌的更大(表1；圖4)；其中對停滯棒桿菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌這4種細(xì)菌的抑菌圈直徑(分別為20.0±1.1, 19.0±0.5, 16.5±0.5和16.3±0.5 mm)與對革蘭氏陰性細(xì)菌的相比均表明溶菌酶Pxlys對這4種細(xì)菌表現(xiàn)出較強的抑菌作用。

表1 小菜蛾溶菌酶重組蛋白Pxlys(2.5 mg/mL)的抑菌活性

圖4 小菜蛾重組溶菌酶蛋白Pxlys(2.5 mg/mL)的抑菌效果

采用液體生長抑制法測定重組小菜蛾溶菌酶蛋白Pxlys對2種革蘭氏陽性細(xì)菌和1種革蘭氏陰性細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果表明，Pxlys對停滯棒桿菌的最小抑菌濃度為50 μg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為64 μg/mL，對大腸桿菌的最小抑菌濃度為100 μg/mL。

用重組Pxlys分別處理停滯棒桿菌和大腸桿菌，以不加Pxlys為對照組，分別收集對應(yīng)的菌體，在掃描電鏡下進(jìn)行觀察結(jié)果顯示，未經(jīng)Pxlys處理的對照組，正常的停滯棒桿菌呈短棒狀，細(xì)胞的表面完整、光滑，細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生改變,且未見細(xì)胞壁或細(xì)胞膜發(fā)生損傷(圖5: A)；而在50 μg/mL Pxlys處理后，停滯棒桿菌細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞表面損傷,細(xì)胞出現(xiàn)裂痕，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞斷裂，細(xì)胞內(nèi)容物泄露(圖5: B，紅色箭頭所示)；在更高濃度200 μg/mL Pxlys處理后，細(xì)菌的完整結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞,細(xì)胞表面粗糙不平，細(xì)胞破裂,出現(xiàn)大量的細(xì)胞碎片，細(xì)菌死亡，其中部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞骨架崩塌現(xiàn)象(圖5: C，紅色箭頭所示)。未經(jīng)過Pxlys處理的對照組，正常的大腸桿菌呈長桿狀，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整,菌體飽滿、表面光滑,未見細(xì)胞壁或細(xì)胞膜損傷(圖5: D)；經(jīng)100 μg/mL Pxlys處理后，細(xì)胞腫脹、凸起，細(xì)胞發(fā)生明顯損傷，細(xì)胞表面不再完整,出現(xiàn)裂痕，小部分內(nèi)容物流出(圖5: E，紅色箭頭所示)；經(jīng)更高濃度(400 μg/mL)Pxlys處理后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度漲破，大量胞漿內(nèi)容物流出，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡(圖5: F，紅色箭頭所示)。

3 討論

本研究通過RACE技術(shù)從小菜蛾中克隆獲得一條溶菌酶基因序列，命名為Pxlys。抑菌試驗表明，重組Pxlys對停滯棒桿菌的最小抑菌濃度最小，對其抑菌活性最大；其次對金黃色葡萄球菌的抑菌作用也大于對大腸桿菌的抑菌作用(圖4; 表1)，也進(jìn)一步說明，重組小菜蛾溶菌酶不僅對革蘭氏陽性細(xì)菌有抑菌能力，對革蘭氏陰性細(xì)菌也具有一定的抑菌作用，并且小菜蛾溶菌酶對革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出比對革蘭氏陰性菌更強的抑菌能力。抑菌分析表明，Pxlys表現(xiàn)出了廣譜的抗菌活性，說明溶菌酶在昆蟲先天性免疫抵御病原菌入侵中起著重要作用。同時也為生物防治小菜蛾提供了理論基礎(chǔ)。研究表明，溶菌酶主要是通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁來起到抗菌作用，因此其對革蘭氏陽性菌比對革蘭氏陰性菌具有更強的抗菌活性。為了探明小菜蛾溶菌酶對革蘭氏陽性細(xì)菌與革蘭氏陰性細(xì)菌的作用機制是否存在差異，我們通過掃描電鏡觀察Pxlys處理待測菌后細(xì)胞的形態(tài)變化來初步探究Pxlys抑菌作用的機理。掃描電子顯微鏡下，經(jīng)Pxlys處理過的停滯棒桿菌和大腸桿菌的溶菌特征不同(圖5)，表明Pxlys對于這兩種細(xì)菌有不同的抑菌機理。

前期研究表明，溶菌酶是一種陽離子抗菌肽(Sowa-Jasileketal., 2014)，它能夠在帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜中插入并成孔(Derdeetal., 2013; Hukietal., 2017)。多數(shù)研究表明，溶菌酶水解細(xì)菌的作用是由其作為肽聚糖水解酶來發(fā)揮作用的，使得細(xì)菌由于細(xì)胞壁出現(xiàn)裂痕，導(dǎo)致胞漿內(nèi)容物泄露，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡(Brottetal., 2019)。盡管革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌結(jié)構(gòu)存在差異，但Pxlys對其均有抑菌活性，那么對這兩種細(xì)菌的抑菌作用方式是否存在差異呢？為了闡明小菜蛾溶菌酶抗菌機制，本研究采用掃描電鏡技術(shù)，從細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的角度來分析其抗菌機制。電鏡結(jié)果顯示(圖5)，正常的停滯棒桿菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，而經(jīng)Pxlys處理過的停滯棒桿菌，其細(xì)胞邊緣粗糙、外形不平，細(xì)胞出現(xiàn)裂痕，細(xì)胞骨架崩塌，出現(xiàn)大量的細(xì)胞碎片；與大腸桿菌的細(xì)胞腫脹、凸起進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞漲破不同，提示Pxlys對停滯棒桿菌與大腸桿菌的抑菌機理不同。前期研究認(rèn)為，溶菌酶對革蘭氏陽性細(xì)菌的抗菌作用主要是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)來起到殺菌作用，而溶菌酶對革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌作用可能涉及到膜的破壞，增強了膜的通透性(Derdeetal., 2013)。雖然該機制較好地解釋了小菜蛾溶菌酶對革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌作用效果的不同，但該機制仍需后續(xù)進(jìn)一步深入的研究。