李紅梅，魏艷麗，扈進冬，楊凱，劉寶軍，楊合同，李紀順

(齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 山東省科學院生態(tài)研究所 山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250103)

病原真菌引起的土傳病害能夠造成農(nóng)作物及設施瓜果蔬菜大面積減產(chǎn)，甚至絕產(chǎn)，且難以防治。由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、灰霉菌(Botrytiscinerea)等致病菌引起的土傳病害危害極大[1-3]，這些病原菌都能夠在土壤中以菌核、分生孢子或菌絲體越冬，如果上茬作物發(fā)病嚴重，需要對土壤進行消毒后才能種植下茬，否則土傳病害會大面積發(fā)生，造成絕產(chǎn)。目前土壤消毒方法主要有物理消毒法和化學消毒法[4]，化學消毒法不但使病原菌產(chǎn)生抗藥性，且容易造成土壤污染，而生產(chǎn)上常用的高溫燜棚等物理消毒方法易受季節(jié)影響。因此，亟需尋找一種綠色、高效的土壤處理方法。

臭氧是一種強氧化消毒劑，可殺滅各種微生物[5-6]，溶于水后具有更強的殺菌作用[7]，且臭氧水易于分解、無污染、廉價高效，是理想的新型殺菌劑。臭氧水對病原真菌的抑制和殺滅效果的研究多見于只針對一種病原真菌[8-10]，少數(shù)研究針對兩種病原真菌[11]，而針對3種及以上多種土傳病原真菌的研究較少。本研究利用臭氧水對3種土傳病原真菌進行殺滅試驗，篩選適宜的臭氧水質(zhì)量濃度及最佳作用時間，以期為土壤的綠色消毒技術提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

臭氧水發(fā)生器(山東澤恩農(nóng)業(yè)科技股份有限公司)；啟立DOZ-30臭氧濃度檢測儀(廣州啟立環(huán)保設備有限公司)。

1.1.2 菌株及培養(yǎng)基

病原真菌(尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、灰霉菌)及深綠木霉20111(Trichodermaatroviride)均為本實驗室分離保存。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L，蒸餾水1 L， pH自然。

1.2 方法

1.2.1 真菌孢子懸浮液制備

將本實驗室保藏的病原真菌尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、灰霉菌轉接至PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，待有大量孢子產(chǎn)生時，刮取孢子至無菌生理鹽水中震蕩混勻，無菌擦鏡紙過濾，濾液即為孢子懸浮液。

1.2.2 臭氧水對真菌孢子的殺滅試驗

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1.2.3 臭氧水對土壤中病原真菌的殺滅試驗

將培養(yǎng)好的病原菌制備孢子懸浮液，并稀釋到一定質(zhì)量濃度，在顯微鏡下用血球計數(shù)板進行計數(shù)，將孢子懸浮液與土壤混勻，調(diào)整土壤中孢子數(shù)為105cfu/g干土，作為病土裝入花盆(19 cm×16 cm)，1000 g/盆，澆灌臭氧水質(zhì)量濃度設為5 、10 mg/L，澆灌量500 mL/盆(以盆底有水流出為宜)，進行以下處理：(1)對照CK，澆灌自來水；(2)處理T1，臭氧水澆灌1次；(3)處理T2，臭氧水澆灌2次，間隔5 d；(4)處理T3，臭氧水澆灌3次，各間隔5 d。每處理3個重復，處理結束后，取各處理土壤，采用選擇性培養(yǎng)基對土壤進行病原菌計數(shù)[12-14]，殺滅率按公式(1)計算。

1.2.4 臭氧水處理對接種尖孢鐮刀菌白菜幼苗的影響

將制備好的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液與土壤混勻至105cfu/g干土，裝入花盆(19 cm×16 cm)，1000 g/盆，澆灌臭氧水質(zhì)量濃度設為5 mg/L，澆灌量500 mL/盆，共澆灌3次，間隔5 d，處理如下：(1)對照CK，澆灌自來水；(2)臭氧處理：土壤澆灌臭氧水；(3)木霉處理：土壤澆灌自來水，白菜種子浸種木霉20111孢子懸浮液(濃度為4.3×105cfu/mL)；(4)臭氧處理+木霉處理：土壤澆灌臭氧水，白菜種子用木霉20111孢子液浸種(濃度同處理(3))。以上各處理3個重復，土壤濕度合適時進行播種，常規(guī)管理。4周后調(diào)查白菜發(fā)病情況及株高、干重、葉綠素含量等生長指標，計算各處理的病株率和防治效果。

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1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件中的Duncan′s 方法進行分析，結果為3次重復的平均值±標準差。

2 結果

2.1 臭氧水對病原真菌孢子的殺滅作用

由圖1可知，各質(zhì)量濃度的臭氧水對3種病原真菌都有殺滅作用，在1.0～5.0 mg/L范圍內(nèi)，殺滅率隨臭氧水質(zhì)量濃度增加而增大。當質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時，0.5 min內(nèi)對尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌及灰霉菌的殺滅率分別為70.4%、74.2%、72.7%，隨著時間的延長，殺滅率沒有明顯升高；當質(zhì)量濃度上升到2.0 mg/L時，0.5 min內(nèi)對3種病原真菌的殺滅率分別為96.2%、97.5%、97.4%；當質(zhì)量濃度達到5.0 mg/L時，0.5 min對3種病原真菌的殺滅率都達到100%?？梢姵粞跛|(zhì)量濃度顯著影響病原菌的殺滅率，而處理時間對殺滅率沒有顯著影響。

注：圖中不同小寫字母表示P<0.05水平差異顯著。圖1 臭氧水對3種病原真菌孢子的殺滅效果Fig.1 The sterilizing effect of ozone water on the spores of the pathogenic fungi

2.2 臭氧水對土壤中病原真菌的殺滅作用

利用兩種質(zhì)量濃度的臭氧水對土壤中的3種病原真菌進行滅菌處理，由圖2可以看出，當臭氧水質(zhì)量濃度為5 mg/L時，對3種病原菌的殺滅率隨處理次數(shù)的增加而顯著增加；質(zhì)量濃度為10 mg/L時，處理2次、3次對3種病原真菌的殺滅率與處理1次差異顯著，而處理2次與3次之間差異不顯著。

注：圖中不同小寫字母表示P<0.05水平差異顯著。圖2 臭氧水對土壤中病原真菌的殺滅效果Fig.2 The sterilizing effect of ozone water on the pathogenic fungi in soil

2.3 臭氧水處理對接種尖孢鐮刀菌白菜幼苗的影響

臭氧水處理接種病原菌的土壤后種植大白菜，結果如表1所示。臭氧水消毒土壤后，能顯著降低白菜枯萎病的發(fā)病率，臭氧處理和臭氧+木霉處理發(fā)病率降低至2.5%和6.25%，與對照以及木霉處理間存在顯著差異。臭氧水處理土壤后直接播種，對白菜幼苗的生長有一定影響，植株明顯矮小，株高和單株干重與其他處理間差異顯著。木霉浸種處理能有效緩解臭氧水消毒土壤后對植株的影響，其株高和干重都與對照無顯著差異。臭氧水處理土壤后白菜幼苗葉片的葉綠素含量不受影響，各處理間無顯著差異。

表1 臭氧水處理對白菜幼苗的影響

3 討論

臭氧水殺菌作用強，可殺滅各種微生物。本文用臭氧水處理105數(shù)量級的真菌孢子懸浮液，當臭氧水質(zhì)量濃度為1 mg/L時，0.5 min內(nèi)對3種病原菌孢子的殺滅率在70.4%～74.2%；當臭氧水質(zhì)量濃度上升為2 mg/L時，0.5 min的殺滅率迅速升高到96.2%～97.4%。而作用時間對殺滅率無顯著影響，可見質(zhì)量濃度是影響臭氧水殺菌效果的關鍵因素，這與已報道的試驗結果[15]一致。

臭氧水對土壤中3種病原真菌的殺滅試驗表明，5 mg/L的臭氧水處理3次與10 mg/L的臭氧水處理2次都能達到很好的殺菌效果。實際生產(chǎn)中高濃度臭氧水不易獲得，所以采用多次澆灌的方法能有效防治土壤病蟲害。

臭氧對微生物的殺滅作用無選擇性，所以對土壤處理后有益微生物菌群會受到破壞。本試驗中臭氧處理的白菜幼苗生長受到影響，植株明顯矮小，株高和單株干重都與其他處理差異顯著，而添加木霉處理的植株不受影響，株高和單株干重都與對照無顯著差異，這可能是木霉的施入明顯改善了土壤消毒后的有益菌群，使植株健康生長。有報道稱植株在生長期進行臭氧水澆灌，能顯著提高葉片的葉綠素含量、SPAD值[16-17]，本試驗中，種植前土壤澆灌臭氧水，各處理間的葉綠素含量無顯著差異，這可能與臭氧水澆灌時間以及臭氧水質(zhì)量濃度有關。

試驗結果表明，臭氧水澆灌可作為土壤綠色消毒技術，但消毒后需要添加有益微生物來重建土壤中的微生物生態(tài)系統(tǒng)，以達到植株健康生長的目的。