史沉魚， 韋云秀

(河池學院 化學與生物工程學院，廣西 宜州 546300)

近幾年來，由于經(jīng)濟的快速發(fā)展，土壤中重金屬污染造成的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟損失問題受到世界許多國家的關注[1]。2006年全國土壤現(xiàn)狀調(diào)查顯示，全國受污染的耕地約有1 000萬hm2，據(jù)估算，全國糧食因重金屬污染造成的經(jīng)濟損失超過200億元[2]。2011年2月，國務院正式批復《重金屬污染綜合防治十二五規(guī)劃》，這是我國出臺的第一個“十二五”專項規(guī)劃，充分體現(xiàn)了國家對重金屬污染防治的重視程度[3]。Pb是土壤環(huán)境污染中受關注度較高的重金屬之一，具有積累性、隱蔽性、難治性和長期性等特點[4]，對環(huán)境和生物體健康的影響也備受關注[5-6]。研究表明，高濃度Pb能抑制小麥種子萌發(fā)，降低發(fā)芽率，顯著抑制莖、株高和根的生長[7-10]。隨著Pb濃度的增加和處理時間的延長，南瓜中Pb的積累量也不斷增多[11]。高濃度Pb能抑制金銀花的生長，使其葉綠素含量降低，產(chǎn)量下降[12]。在小麥幼苗、竹柏幼苗、瓜果類和一些草本植物中，重金屬對其生理生長影響的相關研究也很多[13-19]。

油菜素內(nèi)酯(EBR)作為第六大植物激素，能通過調(diào)控植物生長發(fā)育來提高產(chǎn)量品質(zhì)。油菜素內(nèi)酯對植物生理方面影響的研究已經(jīng)取得顯著進展，對抗逆性的影響的研究包括低溫、高溫、漬水、干旱、低氧、弱光、重金屬、農(nóng)藥污染等。研究發(fā)現(xiàn)，外源噴施EBR能有效改善油菜幼苗植株氣孔的限制，通過提高其光合作用和水狀況來提高耐鹽性[20]。外源EBR作用于水稻后，通過提高抗氧化酶活性和調(diào)節(jié)內(nèi)源激素來緩解高溫脅迫對水稻的結實率的影響，從而保證水稻的產(chǎn)量[21]。尹博[22]的研究表明，EBR能緩解銅脅迫對番茄植株的危害。重金屬Pb脅迫下緩解施用一定量的EBR，能增加株高，增大葉面積，增粗莖稈，提高坐果率，以提高作物產(chǎn)量[23-24]。雖然EBR在植物生長發(fā)育和信號轉導等生理和分子作用機制的研究已取得了顯著成績，但在不同重金屬脅迫下EBR對植物生理的改善有待進一步研究。

番茄營養(yǎng)價值豐富，是重要的果蔬之一，其品質(zhì)的安全關系到人的健康，同時也涉及種植戶的經(jīng)濟效益，在植物富集重金屬、植物修復及EBR對重金屬脅迫的緩解效應方面都有研究，但Pb脅迫下的研究鮮見報道。本文探究Pb處理后番茄種子和幼苗生長的生理變化以及幼苗葉面噴施EBR后番茄的響應，旨在了解Pb脅迫對種子及幼苗的影響及EBR對脅迫的緩解效應，對提高番茄產(chǎn)量和品質(zhì)具有一定的經(jīng)濟價值和現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)及設計

供試材料番茄品種為中蔬四號，挑選出顆粒飽滿且形態(tài)相近的種子，用40 ℃溫水浸種3～4 h，撈出擦干后再用1% KMnO4消毒，沖洗凈殘留，用濾紙擦干種子，置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。每天用濃度分別為50、100、200、300、400 mg·L-1的5 mL Pb溶液進行脅迫處理，對照組(CK)使用等量清水處理。每天觀察種子發(fā)芽和幼苗生長狀況，當番茄幼苗長至27 d后，葉面噴施0.1 mg·L-1EBR(正反面均要噴施，噴施量以葉面滴水為準)，第33天進行各項生理指標的測定。每處理設10盆，每盆3株，重復3次。

1.2 化學試劑及儀器

試劑：硝酸鉛、油菜素內(nèi)酯(EBR)、濃硫酸、蒽酮、乙醇、磷酸、標準葡萄糖溶液、考馬斯亮藍。儀器：紫外分光光度計、離心機、漏斗、研缽、具塞比色管、玻璃棒、容量瓶、試管、燒杯、比色管、直尺、卷尺、電子天平、鑷子、手術刀、離心管、蓋玻片、移液管、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)箱。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 形態(tài)指標的測定

番茄幼苗葉面噴施EBR 6 d后，每個處理選取健康的番茄幼苗用卷尺或尺子進行相關測量，精確到0.1 cm，每次測量重復5次。根長為根與莖的分隔處到主根根尖的距離；株高為從根與莖的分隔處到植株最高點的長度；莖粗為子葉節(jié)下部1 cm處的直徑；記錄真葉數(shù)。

1.3.2 生理指標的測定

參照楊敏文[25]的丙酮-乙醇提取法進行葉綠素含量的測定，按照Arnon公式[26]計算;可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法[27]。

1.3.3 氣孔指標的測定

參考楊再強[28]等的方法，在10:00～12:00時選取健康的番茄植株，采摘根部往上第3～4片的真葉，蒸餾水沖洗干凈后用紙巾擦干，然后將葉片放在緩沖液下光照3 h，濾紙吸干多余液體后，用透明膠黏貼法制片，將葉片下表皮平鋪黏貼在透明膠上，黏貼好后快速撕取表皮，連同透明膠一起黏貼在載玻片上，將樣片置于光學顯微鏡(Olympus CX-31)×40倍下進行氣孔長度、開度、密度的測定[29]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)整理分析以及圖表的繪制使用Excel 2010和SPSS 22.0，采用單因素方差分析和LSD檢驗對各項指標進行顯著差異分析。

2 結果與分析

2.1 外源EBR對Pb脅迫下番茄幼苗外觀形態(tài)的影響

株高、根長、莖粗和真葉長勢等外觀形態(tài)指標可作為植物生長發(fā)育是否健康的依據(jù)之一。由表1可知，株高在各濃度Pb處理下與對照組的生長基本上一致，總體上呈增長趨勢。當Pb濃度為200 mg·L-1時，株高值達到最大，比對照增長16.6%，與對照組差異顯著，其他處理組與對照組差異不顯著。

表1 外源EBR對Pb脅迫下番茄幼苗外部形態(tài)的影響

植物通過根的吸收，把重金屬運輸?shù)饺恚琍b的毒害作用最開始作用于植物根部。Pb脅迫對番茄幼苗根的伸長產(chǎn)生抑制作用，根長均低于對照，分別降低41.3%、12.1%、16.7%、9.6%、18.7%。當Pb濃度為50、200、400 mg·L-1時，與對照組差異顯著。

各濃度Pb處理莖粗與對照間差異不顯著。處理能有效促進葉的生長，增加真葉數(shù)。當Pb濃度為50 mg·L-1時，真葉數(shù)顯著低于對照，當Pb濃度為200、400 mg·L-1時，真葉數(shù)顯著高于對照。由此說明，在Pb脅迫下對番茄幼苗莖葉噴施EBR，能增加莖粗，加快真葉生長，對莖和葉的生長起到促進作用。

2.2 外源EBR對Pb脅迫下番茄幼苗生理指標的影響

2.2.1 葉綠素含量

葉綠素含量越高，說明植物光合作用越強，反之則越弱。葉綠素的合成與植物體內(nèi)光合作用酶和電子傳遞鏈有關，除植物本身的影響外，外界因素也會產(chǎn)生一定影響。Pb在番茄中積累，使植物生理系統(tǒng)紊亂，從而破壞葉綠體結構，降低葉綠素含量，導致植物光合作用受阻，影響植物生長。

從表2可以看出，50～300 mg·L-1濃度Pb處理下，與對照相比，葉綠素a分別降低了9.5%、7.4%、10.7%、17.4%，當Pb濃度為400 mg·L-1時，葉綠素a含量比對照略有增加，但差異不顯著。葉綠素b、葉綠素a+b含量也均有所下降，除了Pb濃度為50、400 mg·L-1降低不顯著外，其他均顯著低于對照。在Pb脅迫處理下外源噴施EBR，葉綠素a/b的值并未隨著Pb濃度的升高而降低，基本高于對照，說明外源EBR能提高番茄幼苗中葉綠素a/b的值，能緩解Pb脅迫對番茄生長的毒害作用。

表2 外源EBR對Pb脅迫下番茄幼苗葉綠素含量的影響

2.2.2 可溶性蛋白含量

高等植物能通過光合作用積累可溶性蛋白、調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓來增強植物對重金屬脅迫的抗性。當植物受到逆境脅迫時，通過可溶性蛋白的積累來緩解逆境對植物體的傷害，具有維持滲透壓的作用，是衡量植物抵抗不良環(huán)境的重要指標之一。

從圖1中可以看出，在Pb濃度為50 mg·L-1時，番茄葉片中可溶性蛋白顯著低于對照，其他處理濃度均接近或高于對照組，但差異不顯著。其中，Pb濃度為200 mg·L-1時，葉片中可溶性蛋白含量最高。

柱間無相同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖3、4同。圖1 外源EBR對Pb脅迫下番茄幼苗可溶性蛋白含量的影響

2.3 外源EBR對Pb脅迫下番茄幼苗葉片氣孔的影響

2.3.1 葉片氣孔長度與開度

由圖2、3可知，Pb處理下番茄葉片氣孔長度呈增加趨勢，且隨著Pb濃度的升高，氣孔長度增大，分別比對照組增加24.1%、5.4%、24.0%、23.2%、35.0%；除Pb濃度為100 mg·L-1時對氣孔長度影響不顯著外，其他處理均達到顯著差異；Pb濃度為400 mg·L-1時，氣孔長度最大。Pb處理的氣孔開度高于對照組，分別增加26.7%、2.8%、23.1%、0.5%、12.1%。Pb濃度為50、200 mg·L-1時，氣孔開度顯著高于對照。

圖2 EBR處理對Pb脅迫下番茄氣孔形態(tài)的影響

圖3 外源EBR對Pb脅迫下番茄幼苗葉片氣孔長度與開度的影響

2.3.2 葉片氣孔密度

從圖2、4可以看出，Pb脅迫下番茄幼苗葉片氣孔密度呈先降低后升高再下降的趨勢。當Pb濃度在200 mg·L-1時，氣孔密度達到最大，較對照組增加3.3%，但與對照組差異不顯著。當Pb濃度為50、100、300、400 mg·L-1時，氣孔密度均低于對照組，濃度為50和400 mg·L-1時與對照差異顯著。

圖4 外源EBR對Pb脅迫下番茄幼苗葉片氣孔密度的影響

3 討論

3.1 外源EBR對Pb脅迫下番茄幼苗外觀形態(tài)的影響

Pb作為植物生長的非必需元素，高濃度Pb能破壞植物內(nèi)部結構，抑制植物生長。Pb能通過拮抗作用導致植物一系列生理生化過程紊亂，影響植物生長發(fā)育，主要表現(xiàn)為葉片失綠黃化、莖稈細弱、根系變短和植株矮小。有研究表明，外源噴施EBR能促進小麥株高增加，增加根莖葉的質(zhì)量。本試驗中，對不同Pb濃度處理的番茄幼苗葉片噴施EBR，其株高、根長、莖粗、真葉數(shù)隨著Pb脅迫濃度的升高逐漸下降，與對照組相比差異不顯著，可見EBR可促進植株增高、莖稈增粗以及根長和葉的生長，這與孫士林等[30]的研究結果一致。

3.2 外源EBR對Pb脅迫下番茄幼苗生理指標的影響

3.2.1 葉綠素含量

葉綠素在植物光合作用中對光能的吸收、傳遞和轉化起到核心作用。Pb能通過影響電子傳遞鏈、光合系統(tǒng)和相關酶活性來降低葉綠素的合成。Pb濃度過高會降低植物對鎂和鐵的吸收，影響鐵進入葉綠素的卟啉環(huán)，從而減少葉綠素分子的產(chǎn)生，導致葉綠素合成降低。本試驗中，對不同濃度Pb脅迫處理下的番茄幼苗葉面噴施EBR，隨著Pb脅迫濃度的升高，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b的含量逐漸下降，當濃度達到400 mg·L-1時，葉綠素含量又呈回升趨勢，說明外源EBR能緩解Pb脅迫對番茄幼苗葉綠素等光合系統(tǒng)的破壞，降低對植物光合作用的影響。EBR能通過增加植物葉綠素的含量來緩解重金屬對植物光合作用的影響，試驗中隨著處理濃度的增加逐漸增大，這與葉綠素a、葉綠素b的變化有關，說明EBR對Pb脅迫具有一定的緩解作用，但不同濃度的脅迫對植物影響不同，相關作用機理還有待進一步研究。

3.2.2 可溶性蛋白含量

在低濃度處理下，當Pb離子進入植物體內(nèi)時，植物通過啟動自身防御系統(tǒng)形成相關蛋白與金屬離子的結合，降低重金屬對植物體的毒害。本試驗中，可溶性蛋白的含量先下降再升高后下降。在50 mg·L-1Pb處理下，番茄幼苗細胞內(nèi)的蛋白合成酶受到毒害，從而降低了幼苗中的可溶性蛋白含量；當濃度達到100 mg·L-1后，番茄幼苗抵抗系統(tǒng)達到一定閾值，Pb離子刺激金屬螯合蛋白生成，可溶性蛋白含量逐漸升高。隨著Pb濃度的升高，番茄自身防御系統(tǒng)遭到破壞，無法通過自身調(diào)節(jié)抵御毒害，相關酶的合成及代謝系統(tǒng)紊亂或被破壞，可溶性蛋白含量下降。外源EBR作用后，提高了番茄幼苗可溶性蛋白含量，增強了對Pb的抗性。這與王芳[31]等研究EBR能對Pb脅迫下玉米幼苗緩解作用一致。

3.3 外源EBR對Pb脅迫下番茄幼苗葉片氣孔的影響

3.3.1 葉片氣孔長度與開度

本試驗中，隨著Pb處理濃度增加，氣孔的長度、開度均增大，氣孔長度的增幅比開度更為明顯。當濃度達到400 mg·L-1時，氣孔長度達到最大值，說明隨著處理濃度的升高，氣孔的抵御能力也在不斷增加。氣孔開度受脅迫影響較小，基本與對照組一致，說明外源EBR能降低Pb離子對幼苗保衛(wèi)細胞的毒害，葉面噴施EBR對氣孔的開放起到促進作用，從而緩解Pb對番茄幼苗呼吸作用和光合作用的影響。對蠶豆氣孔的研究表明，EBR能誘導氣孔關閉，有顯著抑制ABA誘導氣孔關閉的效應[32]，與本試驗Pb脅迫下緩解抑制作用一致。

3.3.2 葉片氣孔密度

氣孔密度反映出植物葉片氣孔的分布情況，其與氣孔長度、開度等多種因素有關。陳強等[33-35]研究表明，在重金屬脅迫處理下，氣孔密度呈下降趨勢。本試驗中，Pb脅迫處理下對番茄幼苗葉面噴施EBR，氣孔密度先下降再上升后下降，可能與EBR的緩解作用有關，降低了Pb對氣孔的毒害作用。

4 小結

在對番茄進行Pb脅迫處理時，番茄幼苗的響應機制表現(xiàn)為低濃度促進、高濃度抑制。當Pb濃度達到100 mg·L-1時，能顯著抑制種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率以及幼苗株高、根長、莖粗、真葉的生長，隨著處理濃度的升高，體內(nèi)葉綠素含量降低，光合作用能力下降。Pb脅迫下，番茄啟動自身防御系統(tǒng)，通過增加可溶性蛋白含量來抵抗Pb脅迫的毒害作用。Pb脅迫下氣孔長度、開度及密度均會下降。0.1 mg·L-1EBR能明顯促進番茄生長，為最適促進濃度。在本試驗中，外源噴施EBR能有效緩解Pb脅迫對番茄幼苗株高、根長、莖粗和真葉生長的抑制作用，表現(xiàn)出各生長指標差異不顯著；葉綠素含量和可溶性蛋白含量與對照相近；氣孔長度、開度、密度的值均有所提高，說明外源噴施EBR能有效緩解Pb脅迫對番茄幼苗的傷害，提高番茄對Pb脅迫的抗性，有利于提高番茄產(chǎn)量品質(zhì)，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。