趙健， 許秀琴， 呂燕

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 寧波市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心，浙江 寧波 315040)

呋蟲胺作為新型煙堿類殺蟲劑，已廣泛應(yīng)用于水稻蟲害的防治，對(duì)二化螟、稻飛虱等具有良好的防效。但隨著呋蟲胺的大量使用，呋蟲胺在環(huán)境、植物中殘留風(fēng)險(xiǎn)也隨之增大，對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生間接危害[1]。2012年農(nóng)藥殘留聯(lián)席會(huì)議(JMPR)，規(guī)定呋蟲胺在植物體內(nèi)的殘留定義為呋蟲胺、UF及DN之和[2]。伏馬毒素是水稻在生長(zhǎng)或儲(chǔ)存過程中被真菌污染后而不斷產(chǎn)生的毒素，即使在低濃度范圍內(nèi)也會(huì)對(duì)人和動(dòng)物正常生理功能產(chǎn)生干擾和產(chǎn)生毒害[3-4]。

目前，國(guó)內(nèi)單獨(dú)檢測(cè)伏馬毒素或呋蟲胺及代謝物的方法已有報(bào)道，呋蟲胺及其代謝物主要采用液相色譜法[5-6]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[7-8]等進(jìn)行檢測(cè)，伏馬毒素主要采用酶聯(lián)免疫技術(shù)[9-10]、液相色譜法[11-12]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[13-14]等進(jìn)行檢測(cè)，但同時(shí)測(cè)定伏馬毒素、呋蟲胺及其代謝物的檢測(cè)方法仍較少見。

本文開發(fā)了一種基于UPLC-MS/MS的檢測(cè)方法，可同時(shí)提取、凈化和測(cè)定伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、呋蟲胺、DN和UF，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，滿足大米中5種藥物快速定性定量檢測(cè)分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈、甲酸、甲醇為色譜純；凈化材料N-丙基乙二胺、弗羅里硅土購(gòu)于上海安譜，多壁碳納米管購(gòu)于江蘇先豐；試驗(yàn)用水為超純水；伏馬毒素B1、伏馬毒素B2購(gòu)于TRC，呋蟲胺、DN、UF購(gòu)于anpel，大于95%；大米磨粉后，-20 ℃保存。Waters UPLC-XEVO TQ MS超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀；SIGMA 3K15離心機(jī)；Mettler-Toledo XPE205電子天平、PL3002電子天平；IKA控溫?fù)u床；Organomation N-EVAP112氮吹儀；IKA T25 digital勻漿機(jī)。

1.2 溶液配制

1.2.1 儲(chǔ)備標(biāo)液配制

分別準(zhǔn)確稱取伏馬毒素、呋蟲胺等適量固體標(biāo)樣，用乙腈溶解，得到100 mg·L-1儲(chǔ)備液；用乙腈稀釋配制5 mg·L-1工作液。

1.2.2 基質(zhì)標(biāo)液配制

按1.3節(jié)得到的空白基質(zhì)溶液，將5 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液依次稀釋至100、50、20、10、5、2 μg·L-1基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3 提取溶液配制

按照體積比，移取適量乙腈、超純水和甲酸試劑，配制乙腈/水(體積比85∶15)、乙腈/水/甲酸(體積比85∶14∶1)、乙腈/水(體積比75∶25)、乙腈/水/甲酸(體積比75∶24∶1)4種提取液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱大米粉5.00 g于塑料離心管，添加20 mL提取液，勻漿機(jī)10 000轉(zhuǎn)·min-1勻漿1 min，搖床振蕩15 min，9 000轉(zhuǎn)·min-1離心5 min。分取4.00 mL提取液到含40 mg多壁碳納米管的離心管，9 000轉(zhuǎn)·min-1渦旋1 min，再離心3 min；分取2.50 mL凈化溶液至另一離心管，氮吹儀上水浴40 ℃吹近干，用1 mL乙腈/0.1%甲酸水溶液(體積比1∶9)溶解殘液，過0.22 μm濾膜，UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.4 超高效液相色譜條件

色譜柱為Waters UPLC BEH Shield RP18，1.7 μm，柱溫40 ℃，樣品室溫度20 ℃，流速0.3 mL·min-1；流動(dòng)相為乙腈(A)和0.1%(體積比)甲酸水溶液(B)。

梯度洗脫。0～1 min(10%A)，1～3 min(10%A～50%A)，3～5 min(50%A～90%A)，5～6 min(90%A)，6～6.1 min(90%A～10%A)，6.1～9 min(10%A)，進(jìn)樣量10 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，毛細(xì)管電壓2.5 KV，霧化氣1 000 L·h-1，錐孔氣50 L·h-1；源溫150 ℃；霧化溫度500 ℃。各化合物的質(zhì)譜條件如下：伏馬毒素B1，定性離子對(duì)722.30/352.29(m/z，下同)，定量離子對(duì)722.30/334.28，錐孔電壓50 V，碰撞能量36、42 V；伏馬毒素B2，定性離子對(duì)706.30/354.29，定量離子對(duì)706.30/336.33，錐孔電壓48 V，碰撞能量32、38 V；呋蟲胺，定性離子對(duì)203.10/113.28，定量離子對(duì)203.10/129.02，錐孔電壓14 V，碰撞能量10、12 V；UF，定性離子對(duì)159.10/85.00，定量離子對(duì)159.10/102.04，錐孔電壓16 V，碰撞能量14、10 V；DN，定性離子對(duì)158.17/67.00，定量離子對(duì)158.17/102.06，錐孔電壓32 V，碰撞能量20、12 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化

大米中含水量較低，含有豐富淀粉和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)組分。文中選擇藥物均含有酸堿性基團(tuán)，所以在優(yōu)化提取液時(shí)，選擇可有效沉淀蛋白等雜質(zhì)的乙腈為有機(jī)相，另加入少量水或酸性水溶液，以提高回收率。本文測(cè)試了1.2.3節(jié)中配制的4種提取液，結(jié)果表明，當(dāng)水相為純水時(shí)，伏馬毒素回收率均低于40%，當(dāng)水相含有甲酸時(shí)，回收率均在70%～120%；而呋蟲胺及其代謝物在4種提取液中回收率均在70%～120%。為提高方法靈敏度，需對(duì)提取液進(jìn)行濃縮，最終選擇乙腈/水/甲酸(體積比85∶14∶1)作為提取液。

2.1.2 凈化材料的選擇

樣品提取后，提取液中仍含有影響組分靈敏度或干擾組分峰形的雜質(zhì)，雖使用的儀器具有很強(qiáng)的抗干擾能力，但仍會(huì)出現(xiàn)組分在大米樣品中的基質(zhì)效應(yīng)，因此，需對(duì)提取液進(jìn)行凈化。本文選擇N-丙基乙二胺、弗羅里硅土和多壁碳納米管等凈化材料對(duì)提取液進(jìn)行凈化。結(jié)果表明，弗羅里硅土對(duì)DN具有較強(qiáng)的吸附作用，回收率均在60%以下；而多壁碳納米管、N-丙基乙二胺均取得較好的回收率，但多壁碳納米管具有更好的凈化效果，4 mL提取液中最佳使用量為40 mg。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

為優(yōu)化5種藥物的流動(dòng)相體系，得到更好的靈敏度和分離度，本文對(duì)甲醇+水、乙腈+水、甲醇+0.1%甲酸水溶液和乙腈+0.1%甲酸水溶液4種流動(dòng)相體系進(jìn)行了優(yōu)化篩選。結(jié)果表明，水相為純水時(shí)，2種伏馬毒素峰形很差；水相為0.1%甲酸水時(shí)，5種藥物峰形均得到較好改善；乙腈作為流動(dòng)相靈敏度優(yōu)于甲醇，故選擇乙腈+0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

5種藥物電離化模式均采用ESI+。將藥物配成2 mg·L-1，使標(biāo)樣隨著選定的流動(dòng)相進(jìn)入質(zhì)譜，通過調(diào)節(jié)得到各種藥物的母離子，然后應(yīng)用儀器軟件優(yōu)化得到目標(biāo)物、定性定量離子的毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和碰撞能量等，建立MRM方法。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

大米提取液雖然經(jīng)過凈化，但仍可能存在對(duì)檢測(cè)藥物具有較強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)的雜質(zhì)，若使用試劑配制標(biāo)樣，則會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成較大偏差。因此，驗(yàn)證凈化溶液的基質(zhì)效應(yīng)就顯得很有必要。分別用試劑和基質(zhì)空白配制濃度依次為100、50、20、10和2 μg·L-1的2種系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)儀器分析后，計(jì)算2種標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程及其斜率比。由表1中試劑和基質(zhì)空白標(biāo)樣的斜率比可以看出，DN斜率比均超出0.8～1.2的閾值，說明在大米基質(zhì)中仍有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，故最終選擇基質(zhì)標(biāo)樣進(jìn)行定量。

2.4.2 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

在優(yōu)化的液相和串聯(lián)質(zhì)譜條件下，對(duì)大米基質(zhì)空白配制的100、50、20、10、5和2 μg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行儀器檢測(cè)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。表1顯示，在2～100 μg·L-1各種藥物的決定系數(shù)在0.999 2～0.999 6。經(jīng)加標(biāo)試驗(yàn)，以10倍信噪比時(shí)空白基質(zhì)加標(biāo)濃度為方法定量限。

表1 溶劑標(biāo)液和基質(zhì)標(biāo)液的線性回歸方程和斜率比

表2 不同處理及標(biāo)液對(duì)添加回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和定量限的影響

2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度

取大米空白樣品，添加5、20、80 μg·kg-13個(gè)濃度水平，5次平行，結(jié)果見表2。各處理準(zhǔn)確度回收率83.6%～111.0%，精密度RSD2.2%～11.0%，滿足大米中5種藥物定性定量檢測(cè)，譜圖見圖1。

圖1 20 μg·L-1基質(zhì)標(biāo)液MRM色譜

2.5 樣品檢測(cè)

通過檢測(cè)，獲得的12個(gè)大米樣品檢測(cè)結(jié)果，有2個(gè)樣品檢出呋蟲胺和UF，呋蟲胺含量為29.6～86.8 μg·kg-1，UF為15.9～28.2 μg·kg-1；DN和2種伏馬毒素均未檢出。

3 小結(jié)

文中建立起一種可實(shí)現(xiàn)大米中伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、呋蟲胺、DN和UF 5種藥物同時(shí)提取、凈化、檢測(cè)的快速分析方法，方法簡(jiǎn)單、快速、重現(xiàn)性好，適用于大米中5種藥物同時(shí)定性定量快速分析。