張乃斌，陳真，李春煥，張迅杰，由鵬飛

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101)

脂肪乳注射液是由大豆油(供注射用)、甘油三酸酯、油酸、精制蛋黃卵磷脂(E80)、氫氧化鈉、甘油(供注射用)以及注射用水等主要成分制成的白色乳狀液體，臨床作為胃腸外營養(yǎng)和能量補(bǔ)充藥劑使用。脂肪乳注射液作為腸外營養(yǎng)劑可用于補(bǔ)充能量和必需氨基酸，臨床注射用量較大，最大日劑量為4 g·kg-1，其元素含量需要嚴(yán)格控制[1]。但由于其成分較為復(fù)雜，同時(shí)含有大量的油脂，元素檢測較為困難，如若采用原子吸收法測定元素，又存在靈敏度差，操作復(fù)雜，結(jié)果不穩(wěn)定，無法同時(shí)測定多種元素等諸多缺點(diǎn)[2]。如若采用直接進(jìn)樣的方式進(jìn)行電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)測定，高溫燃燒后的樣品會(huì)導(dǎo)致采樣錐的錐孔堵塞，對樣品的前處理要求較高[3-6]。

脂肪乳注射液的包裝材料多為中硼硅玻璃輸液瓶和注射液用溴化丁基橡膠塞6720GC，在樣品長期存儲(chǔ)過程中，容易發(fā)生包材與注射液相互侵蝕或者包材表面碎片脫落等問題，通過陽性破壞試驗(yàn)和電鏡掃描可清楚地觀察到上述現(xiàn)象，所以兩者相容性問題就尤為突出[7-9]。

脂肪乳注射液作為腸外營養(yǎng)劑，長期的存儲(chǔ)過程中，其包材中元素會(huì)向藥物產(chǎn)生遷移，這對藥物質(zhì)量安全有著重要影響[10]，但由于脂肪乳注射液含有大量油脂，分析困難，導(dǎo)致現(xiàn)有的可參考文獻(xiàn)中并未有對脂肪乳注射液以及其包材中元素遷移的研究[11-12]。本研究基于對藥液質(zhì)量和用藥安全性的考慮，對脂肪乳注射液及其包材中的元素進(jìn)行檢測。參考《化學(xué)藥品注射劑與藥用玻璃包裝容器相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》《化學(xué)藥品與彈性體密封件相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》《2015-藥包材標(biāo)準(zhǔn)》及《ICH Q3D元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則》相關(guān)要求，結(jié)合包材的生產(chǎn)、加工、使用過程等工藝及包裝藥品的特性，經(jīng)過嚴(yán)格的方法學(xué)驗(yàn)證，確立了脂肪乳注射液包材(中硼硅玻璃輸液瓶、溴化丁基橡膠塞)的前處理方法，確立了能夠同時(shí)檢測脂肪乳注射液及其包材中鉛、砷、鎘、汞、鈷、釩、鎳、鋁、鐵、鋅、鋇、銻、鋰、銅、鈰、鈦、硼、硅共18種元素的含量測定的有效方法，為研究脂肪乳注射液包材相容性實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 試驗(yàn)儀器 電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜儀(珀金埃爾默)；超純水機(jī) (Q-POD ElementMilli-Q)；掃描電子顯微鏡(TM4000Plus，HTACHI)。

1.2 試驗(yàn)試劑 超純水(自制)；硝酸(江蘇晶瑞化學(xué)股份有限公司)；亞甲基藍(lán)(國藥集團(tuán))；無水乙醇(萊陽市康德化工有限公司)；氫氧化鈉(國藥集團(tuán))。

1.3 試驗(yàn)對照品 標(biāo)準(zhǔn)元素鎘(M2-CD659870)、汞(M2-HG659921)、鈷(K2-CO02072)、鉛(M2-PB655591)、釩(K2-V02108)、砷(K2-AS654224)、鎳(M2-NI660480)、銻(K2-SB650297)、鋁(M2-Al658405)、鋇(K2-BA02100)、鐵(K2-FE04060)、鋅(K2-FE04060)、鈰(K2-ZN650949)、鈦(K2-TI02120)、硼(M2-B660377)、硅(K2-SI03065)、銦(K2-IN01118)、鉍(K2-BI02014)、鍺(K2-GE01122AA)購于美國Inorganic Ventures公司，規(guī)格均為1 000 μg·mL-1。元素鋰(156949-34)、銅(140652-124)、金(166660-73)購于美國O2Si公司，規(guī)格均為1 000 μg·mL-1。鈧(GSB04-1750-2004)購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心，規(guī)格均為1 000 μg·mL-1。

1.4 試驗(yàn)樣品 脂肪乳注射液，批號(hào)：2007111，規(guī)格：100 mL∶30 g(大豆油)∶1.2 g(卵磷脂)生產(chǎn)企業(yè)：西安力邦制藥有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 包材遷移元素種類確定 依據(jù)ICH Q3D指導(dǎo)原則“元素分類”、“元素雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和控制的要求”及膠塞和中硼硅玻璃配方表中添加的元素等確定最終需要測定的遷移元素種類。

2.1.2 膠塞引入的元素 具體見表1。

表1 膠塞配方

由表1可知，根據(jù)膠塞配方表中添加的物質(zhì)，其可能遷移至藥液中的元素有：硫、鈦。其中硫元素一般采用高效液相色譜法測定，不再做ICP-MS方法研究。

2.1.3 中硼硅玻璃引入的元素 具體見表2。

表2 中硼硅玻璃配方

其中，鉀、鈉元素，因有其相關(guān)的大劑量注射液(如：氯化鈉注射液、氯化鉀注射液)，且未見毒性報(bào)道，不作為本報(bào)告中需要研究的元素。

2.1.4 ICH Q3D指導(dǎo)原則規(guī)定測定元素 根據(jù)“元素雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和控制”項(xiàng)下“風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估建議”考慮的元素的要求，非有意加入的元素注射用藥液必須測定的元素有：鎘、汞、鉛、砷、鈷、釩、鎳、鋰、銻、銅。

2.5.4 ICH Q3D指導(dǎo)原則規(guī)定不測元素 根據(jù)“元素分類-分類”項(xiàng)下的規(guī)定，對于注射和吸入給藥產(chǎn)品，在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估過程中應(yīng)對含有此類元素雜質(zhì)的可能性進(jìn)行評(píng)估，除非給藥途徑的特定PDE值高于 500 μg·d-1。此類元素包括：鋇、鉻、銅、鋰、鉬、銻和錫。其中元素鉬、錫、鉻、鋇的PDE值均高于500 μg·d-1；又因鋇元素為玻璃包材添加元素，必須做，其他3個(gè)元素不做測定。

2.2 測定方法的確定

2.2.1 中硼硅玻璃輸液瓶陽性破壞試驗(yàn) 在比較劇烈的條件下，對中硼硅玻璃輸液瓶進(jìn)行破壞性侵蝕試驗(yàn)研究。篩選出一種能使中硼硅玻璃輸液瓶產(chǎn)生微量脫片的破壞條件，并觀察此條件下中硼硅玻璃輸液瓶亞甲基藍(lán)染色情況、中硼硅玻璃輸液瓶內(nèi)表面的侵蝕樣貌和產(chǎn)生脫片后元素(硅、硼、鋁)遷移情況。

2.2.2 供試品制備 取未接觸過藥物的中硼硅玻璃輸液瓶，清洗干凈，晾干后灌裝0.07 mol·L-1氫氧化鈉121 ℃高壓蒸汽滅菌0.5 h，同時(shí)做空白對照。選擇此條件作為中硼硅玻璃輸液瓶破壞侵蝕條件，并觀察此條件下亞甲基藍(lán)染色情況、中硼硅玻璃輸液瓶內(nèi)表面的侵蝕樣貌和產(chǎn)生脫片后元素(硅、鋁、硼)浸出情況。

2.2.3 電鏡掃描 將染色過后的中硼硅玻璃輸液瓶，于瓶身、瓶底、瓶頸各切割制取約5 mm邊長的矩形樣品，加水超聲5 min，無水乙醇超聲5 min，重復(fù)一遍，取出，晾干，粘于導(dǎo)電膠上，氮?dú)獯祾?，離子濺射儀鍍金，氮?dú)獯祾?，放入電鏡觀察；同時(shí)以未接觸侵蝕液的中硼硅玻璃輸液瓶同法操作，作為空白對照。

2.2.4 亞甲基藍(lán)染色 取灌裝0.07 mol·L-1氫氧化鈉121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min的中硼硅玻璃輸液瓶，將0.07 mol·L-1氫氧化鈉侵蝕液倒出，把中硼硅玻璃輸液瓶清洗干凈，灌裝0.5%亞甲基藍(lán)溶液，靜置20 min后倒出，用低流速水灌入瓶內(nèi)并倒出，反復(fù)10次，觀察是否有亞甲基藍(lán)掛壁現(xiàn)象；同時(shí)以未接觸侵蝕液的中硼硅玻璃輸液瓶同法操作，作為空白對照。

2.3 元素測定

2.3.1 儀器參數(shù) 儀器參數(shù)見表3～4。

表3 ICP-MS儀器參數(shù)信息表

表4 微波消解程序

2.3.2 溶液的制備 (1)溶液的制備

溶劑：取硝酸200 mL，加入水中使成1 000 mL，搖勻，即得。

金溶液(40 μg·mL-1)：精密量取金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，置50 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

內(nèi)標(biāo)溶液(50 ng·mL-1)：依次精密量取鍺、銦、鉍單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，加溶劑制備成50 ng·mL-1溶液。

(2)混合貯備溶液：分別依次精密量取單元素標(biāo)液鋰元素0.25 mL、鋁元素0.25 mL、銅元素0.3 mL、鋇元素0.7 mL、鐵元素1.25 mL、鋅元素1.25 mL、鈰元素0.15 mL、鈦元素0.5 mL、硼元素1.75 mL、硅元素2.5 mL，鎘元素0.2 mL、汞元素0.3 mL、鈷元素0.5 mL、鉛元素0.5 mL、釩元素1 mL，砷元素0.3 mL、鎳元素0.4 mL，銻元素1 mL，置同一50 mL量瓶中，精密量取混合貯備1溶液0.5 mL、混合貯備2溶液0.5 mL、貯備3溶液1 mL、加溶劑稀釋至刻度，搖勻；

(3)線性溶液：依次精密量取混合貯備線性溶液125 μL、250 μL、500 μL、750 μL、1 mL，分別置不同50 mL量瓶中，精密加入金溶液250 μL，加溶劑稀釋至刻度，搖勻。

取上述各線性溶液，注入電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜儀，記錄檢測結(jié)果。

各元素的具體濃度見表5。

表5 各元素線性濃度表(ng·mL-1)

表5(續(xù))

其中，元素鋰、鋁、釩、硼、硅和鈦以元素鈧為內(nèi)標(biāo)元素；元素鐵、鈷、鎳、銅和砷以元素鍺為內(nèi)標(biāo)元素；元素鎘、鈰、銻、鋇以元素銦為內(nèi)標(biāo)元素；元素汞、鉛以元素鉍為內(nèi)標(biāo)元素；金元素起穩(wěn)定汞元素的作用，不做測定。

2.3.3 樣品檢測 玻璃瓶侵蝕溶液制備：取灌裝0.07 mol·L-1氫氧化鈉121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min的中硼硅玻璃輸液瓶，將0.07 mol·L-1氫氧化鈉侵蝕液倒出，精密量取0.25 mL，置50 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

膠塞提取溶液制備：稱取剪碎的膠塞5 g，置微波消解管中，加硝酸12 mL，置微波消解爐中消解，放冷，過濾，取濾液加水容至50 mL。同法處理空白樣品。

專屬性空白溶液：取微波消解罐，加入硝酸5 mL，金儲(chǔ)備溶液(40 μg·mL-1)0.15 mL，用水轉(zhuǎn)移并定容置25 mL量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。

供試品溶液制備：取同一批次放置0 h與置于37 ℃培養(yǎng)箱中放置3個(gè)月的脂肪乳注射液樣品，分別精密量取5 mL，置微波消解罐中，精密加入金溶液(40 μg·mL-1)250 μL，硝酸5 mL，放置48 h后，置微波消解儀中消解，放冷，用水轉(zhuǎn)移并定容置至25 mL；剩余供試品置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)放置，定期取樣檢測元素遷移情況。

以分析元素的響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)元素響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)，其對應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得到目標(biāo)元素的濃度，計(jì)算目標(biāo)元素的含量。參考USP41“元素雜質(zhì)-程序”進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

3 結(jié)果與討論

3.1 待測元素種類統(tǒng)計(jì)結(jié)果 依據(jù)ICH Q3D指導(dǎo)原則的要求及對中硼硅玻璃瓶和溴化丁基膠塞添加引入元素的統(tǒng)計(jì)，綜合多方面信息，最終確定需驗(yàn)證性控制的元素有：鎘、汞、鈷、鉛、釩、砷、鎳、銻、鋁、鋇、鐵、鋅、鈰、鈦、硼、硅、鋰、銅共18種元素，此18中元素對研究脂肪乳注射液及包材相容性具有較高代表性。

3.2 電鏡掃描 由圖1～4可知，中硼硅玻璃輸液瓶灌裝0.007 mol·L-1氫氧化鈉侵蝕液121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min后，從所切割的部位觀察，瓶身、瓶底、瓶頸均觀察到不同程度的侵蝕樣貌，說明該條件下，中硼硅玻璃可被破壞，可在該條件下研究侵蝕樣貌和產(chǎn)生脫片后元素(硅、硼、鋁)遷移情況。

圖1 未接觸侵蝕液的中硼硅玻璃輸液瓶電鏡掃描圖

圖2 侵蝕后的中硼硅玻璃輸液瓶瓶身電鏡掃描圖

圖3 侵蝕后的中硼硅玻璃輸液瓶瓶底電鏡掃描圖

圖4 侵蝕后的中硼硅玻璃輸液瓶瓶頸電鏡掃描圖

3.3 亞甲基藍(lán)染色 由圖5可知，中硼硅玻璃瓶經(jīng)侵蝕后，出現(xiàn)亞甲基藍(lán)掛壁現(xiàn)象，未經(jīng)侵蝕的中硼硅玻璃瓶并未出現(xiàn)亞甲基藍(lán)掛壁現(xiàn)象，進(jìn)一步驗(yàn)證中硼硅玻璃輸液瓶灌裝0.007 mol·L-1氫氧化鈉侵蝕液121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min的試驗(yàn)破壞條件對表面侵蝕破壞程度。

圖5 亞甲基藍(lán)染色結(jié)果

3.4 方法學(xué)驗(yàn)證 校正強(qiáng)度與濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999；RSD均小于相關(guān)要求，該方法的精密度及穩(wěn)定性良好；空白溶液對待測元素的測試不產(chǎn)生干擾，專屬性較好；各元素的測定回收率結(jié)果均規(guī)定范圍內(nèi)，說明該方法的準(zhǔn)確度良好。以該方法測得18種元素的定量限、檢測限結(jié)果均能夠滿足限度要求(見表6)。

表6 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

表6(續(xù))

3.5 樣品遷移試驗(yàn)結(jié)果 各待測元素的含量若小于定量限，均報(bào)告為未檢出。

對放置0 h和3個(gè)月的樣品元素檢測結(jié)果顯示，各批次樣品中待測元素的含量變化不大，各元素在樣品存放過程中均存在一定量的遷移情況，但由于放置時(shí)間較短，各元素的遷移量相對較小(見表7)。

表7 放置3個(gè)月后樣品元素變化結(jié)果

4 結(jié)論

本文研究確定了包材相容性中遷移元素的種類，明確了脂肪乳注射液及其包材中硼硅玻璃輸液瓶和溴化丁基橡膠塞樣品的前處理方法，對該條件下處理后的樣品進(jìn)行硅、鋁、硼元素遷移量檢測，為脂肪乳注射液藥物與包材相容性研究奠定基礎(chǔ)。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，優(yōu)化ICP-MS技術(shù)參數(shù)，檢測脂肪乳注射液及包材中鎘、汞、鈷、鉛、釩、砷、鎳、銻、鋁、鋇、鐵、鋅、鈰、鈦、硼、硅、鋰、銅共18種元素含量，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。該方法操作簡便、準(zhǔn)確，精密度、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、專屬性好。

本項(xiàng)研究僅僅確定了脂肪乳注射液及包材中元素含量的測定方法，未能夠?qū)χ救樽⑸湟杭鞍南嗳菪赃M(jìn)行進(jìn)一步的研究，未能就藥物儲(chǔ)存6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月、36個(gè)月時(shí)的元素遷移情況做進(jìn)一步研究，這在未來的工作中需要做進(jìn)一步探索。