劉佳音，安洋，蘇俊，杜光光，王佳，董慶海，劉繼華

(吉林大學藥學院，吉林 長春 130021)

對于大分子蛋白質及多肽的分析研究是目前生命研究中重要的課題之一，蛋白質的復雜性以及結構的多樣性對于表現不同的食品功能和藥品特性來說十分重要：其功能特性和結構的變化對食品質量影響很大，在食物的成分檢測與鑒定中也起著重要的作用；蛋白質藥物目前在生物技術藥物中發(fā)展得十分迅猛,已經成為醫(yī)藥產品中的重要組成部分，主要包括生長因子、單克隆抗體、重組抗體等，具有較高的活性和特異性，毒性很低，針對蛋白質藥物的研究對于人類的健康與社會的發(fā)展都具有著重大的意義[1]。

在大分子的各項分析中，質譜技術有著快速、超微量、高靈敏度、高特異性等許多優(yōu)點。由于實驗要求的不同，高效液相色譜儀可以和不同的質譜、檢測器聯(lián)用，高分辨質譜等在定性方面有著明顯的優(yōu)勢，可以用于組學研究初期的全譜掃描分析；高靈敏質譜在定量方面優(yōu)勢明顯，可以很好地解決精確測量蛋白質等生物大分子的分子量和掌握分子結構的信息等問題。高效液相色譜-質譜聯(lián)用(HPLC-MS)技術在醫(yī)藥、食品、生物等各個領域的應用有著重要的地位，滿足了現代各類物質分析中高通量和高精度的要求，且已經成為大多數實驗室中蛋白質組學研究的首選生物分析工具，本文綜述了高效液相色譜-質譜在蛋白組學中的應用以及在蛋白質的鑒定分析與含量測定中的應用。

1 蛋白組學研究及定性鑒別

蛋白組學本質上就是大規(guī)模水平的研究蛋白質的特征，通過蛋白組學可以獲得在蛋白質水平上的關于疾病發(fā)生，細胞代謝等過程的認知以及對生命的復雜結構和活動進行解釋，也是多種疾病機理闡述的重要途徑。蛋白組學有大概3種研究策略，其中自底向上的方法又被稱為鳥槍蛋白組學方法，將變性的蛋白質用蛋白酶酶解，在特定位點將多肽鏈降解為小肽段，由于得到的肽段具有很好的穩(wěn)定性和特異性，能夠快速鑒別復雜樣品中的組分，因此成了大規(guī)模研究蛋白質的首選技術之一。

在以前對蛋白質的鑒定中，主要采用的是從頭測序的傳統(tǒng)方法和雙向電泳來完成，隨著序列數據庫規(guī)模的增長，利用質譜將樣品分子離子化，根據分子離子間荷質比的不同來分離并生成圖譜，可以快速、高效地對目的蛋白進行鑒定分析，且使用的樣品量小。Sha等[2]用HPLC-LTQ/Orbitrap高分辨率質譜技術準確地區(qū)分牛皮明膠，豬皮明膠和驢皮明膠，僅在驢皮中檢測到血紅蛋白，并分別發(fā)現了牛明膠、豬明膠和驢明膠的49、50和55個理論獨特序列片段，在單個明膠中檢測到28、27和14個唯一峰分別代表牛的明膠，豬的明膠和驢的明膠，在混合物中，可檢測的標記肽很容易識別，而沒有強烈的峰干擾。潘曉東等[3]基于自下而上的蛋白分析策略，用Tris-HCl提取蝦中的蛋白后用胰蛋白酶水解，采用超高效液相色譜儀Vanquish LC分離后用Q-Exactive四極桿靜電場軌道離子阱質譜測定，通過蛋白數據庫和軟件搜索鑒別過敏蛋白，得到了4種典型的肽段，原肌球蛋白、精氨酸激酶、血藍蛋白和肌漿鈣結合蛋白，它們的肽段覆蓋率分別為53%、36%、12%和12%，并且氨基酸的翻譯后修飾沒有明顯的規(guī)律，主要修飾位點為天冬氨酸的甲基化、天冬酰胺和谷氨酰胺的脫酰胺化以及蛋氨酸的氧化。

房芳等[4]用Nano-HPLC-Q-TOF-MS結合鳥槍蛋白組學的方法比對蛋白酶解后的特征肽段序列，在Uniprot數據庫檢索相關蛋白數據庫并導入Protein Pilot 5.0軟件進行蛋白質的鑒定，找到了4條驢、牛和豬特征肽段和兩條馬特征肽段，采用MRM方法對3種膠原蛋白的理論特征肽進行了驗證，證實了4條理論特征肽的存在，解決了在肽段層面上鑒別阿膠中異源性物種的問題。Bargen等[5]用AB SCIEX TripleTOF 5600系統(tǒng)與Eksigent nanoLC偶聯(lián)，Orbitrap系統(tǒng)與Accela HPLC系統(tǒng)連接，分別在色譜柱上進行分離，通過使用肌纖維蛋白和肌漿蛋白質提取物的胰蛋白酶消化的鳥槍蛋白質組學方法鑒定特異性的生物標志物肽，在Orbitrap上鑒定出了約400種蛋白質中的約4 000～4 500個肽，而在TOF儀器上針對相同樣品鑒定了約500種蛋白質中的約5 500種肽；并且開發(fā)了一種MRM3方法檢測牛肉基質中最敏感的生物標記物肽的污染的LOD約為0.55%，該方法顯示出的靈敏度與最敏感的PCR和ELISA相當。李瑩瑩等[6]將樣品用胰蛋白酶消化后用液相色譜-質譜聯(lián)用高分辨系統(tǒng)對種屬特征肽進行篩選，鑒定到各個物種相對于其他物種專屬性的多肽條數，篩選出目標肽段，再使用液相色譜-質譜聯(lián)用三重串聯(lián)四極桿質譜SRM模式，進行多肽的定性及定量分析，最終選擇了羊肉多肽8 條，鴨肉多肽10條作為定性離子的母離子，得到總離子流圖，該方法體系檢出限為0.5%鴨肉定性判別，定量限為1%鴨肉摻假判別，基本實現了羊肉中摻假鴨肉的量化鑒別。

2 蛋白質結構鑒定中的應用

傳統(tǒng)的物種鑒別大多都是在蛋白水平上進行檢測的，通常包括4個步驟：蛋白質的分離、消化，所得肽段的質譜分析以及將觀察到的肽段與數據庫中的肽段進行比較。在鑒定蛋白質的大部分實驗中，質譜是一種能夠檢測分子量、碳骨架與結構信息的技術手段，與高效液相色譜法結合起來被視為是分析復雜蛋白質和肽段必不可少的工具，構成了蛋白質鑒定分析的一套高效流程。在定性鑒定中，HPLC-MS技術可以進行多種分析，蛋白質的相對分子質量，一級結構氨基酸序列和對翻譯后修飾的蛋白質進行鑒定等。

2.1 對翻譯后修飾的蛋白質進行鑒定 蛋白質的翻譯后修飾可以在蛋白質的特定氨基酸位點上引入不同的基團，比如磷酸化、糖基化、乙?；?、甲基化等，這是調控蛋白質功能的重要方式[7]，隨著生物質譜技術的發(fā)展，用高效液相色譜與質譜聯(lián)用檢測技術可以對蛋白質的翻譯后修飾進行準確的鑒定和表征。

碘乙酰胺(IAA)可以進行蛋白質的烷基化修飾，使得蛋白質的酶切高效進行，王繼峰等[8]用牛血清白蛋白(BSA)作為研究對象,比較適量和過量的IAA對酶切結果的影響，用Agilent 1100毛細管液相色譜系統(tǒng)，梯度洗脫出的組分經ESI離子源進入LTQ-FT質譜進行定性分析，一級全掃描在FT-ICR中進行，得到的最強的10個離子進入離子阱進行二級質譜分析，用Maxquant軟件進行鑒定，最終得到半胱氨酸的烷基化比例最大，其次容易發(fā)生烷基化的是肽段N端氨基酸，為46%；一共鑒定到46條多烷基化肽段，并且表明了過量的烷基化修飾對蛋白質的定性與定量分析都可能會產生較大影響。Bl?chl等[9]用HPLC-MS研究了小鼠的單克隆免疫球蛋白，確定了小鼠IgG中的SpeB切割位點，用離子對反相HPLC聯(lián)用高分辨率質譜分析得到的不同亞類特征的FC/2部分和N-糖基化變體，它們二者均可以影響IgG效應子功能。Geng等[10]將雞蛋清蛋白用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化后，用高性能液相色譜/串聯(lián)質譜法分析其糖基化結構，用MASCOT處理后從MS/MS數據獲得N-糖苷，共鑒定出了88種獨特的糖肽，這些肽含有71個N-糖苷類，屬于26個蛋白，在26個已鑒定的蛋清N-糖蛋白中，約46%攜帶一個N-糖鏈，其中卵黏蛋白N-糖基化最嚴重，其次為卵糖蛋白。Kisrieva等[11]用HPLC-MS/MS技術與無標記比較蛋白質組分析方法，研究了腦缺血(CI)患者和健康人血漿樣品中蛋白質翻譯后修飾(PTM)之間的相對差異，并在Mascot數據庫中使用了多個MS/MS搜索查找，最終在CI血漿樣品中觀察到有PTM的肽比例有所增加包括絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化，賴氨酸的乙酰化和蛋白N末端，賴氨酸的泛素化以及谷氨酰胺脫酰胺。

2.2 蛋白質氨基酸序列的測定 蛋白質的一級結構也就是蛋白質的氨基酸序列，也包括二硫鍵的位置上，是蛋白質生物功能的基礎。通過HPLC-MS技術可以得到許多的肽段信息，在數據庫中進行檢索，可以準確地鑒定多肽和蛋白質的一級結構。Shen等[12]將卵轉鐵蛋白超聲處理酶促水解后經陽離子交換色譜分離，收集到4個餾分，再進一步用Waters 600 HPLC反相色譜進一步分離前兩個活性最高的餾分，用LC-Q-TOF-MS對其中來源于卵轉鐵蛋白的14種肽進行了表征鑒定，對已鑒定的肽從頭測序并且研究了它的抗氧化性能，并得出最有效的、ORAC值最高的肽序列是WNIP。張萍等[13]在對冬蟲夏草及相關的發(fā)酵蟲草類樣品的特征肽段進行序列鑒定，聯(lián)用了EASY-nLC1000超高效液相色譜儀與四極桿-靜電場軌道阱-線性離子阱三合一組合式 Orbitrap Fusion質譜儀對真菌蛋白的酶解產物進行分析，建立了6種樣品的酶解質譜肽圖，尋找各樣品的特征肽段，一級質譜采用Orbitrap檢測器，二級質譜采用離子肼檢測器，結合數據庫對特征肽段進行序列鑒定，鑒定出了冬蟲夏草2個特征肽段及序列，發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體3個特征肽段及序列等。Cheng等[14]用ESI+電離模式的超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UPLC/Q-TOF-MS)方法鑒定胰蛋白酶消化后的五種明膠得到5種離子峰強度色譜圖，將3D LC/MS數據轉換為精確質量保留時間的2D矩陣之后進行無監(jiān)督的主成分分析，可以檢查出明膠之間的異常值和分類趨勢，識別出重要的標記肽，通過在數據庫中獲得各來源的蛋白質的序列，使用Biopharmalynx 1.2鑒定了每個明膠標記肽。

2.3 相對分子質量的測定 蛋白質的相對分子質量在蛋白質的分析中是一個很重要的參數，目前比較常用的有MALDI-TOF-MS，結合了MALDI離子化技術和TOF質譜技術，可以直接對分子量進行測定，效率很高且對極微量的樣品液可以分析；另一種是ESI-MS，結合了電噴霧電離ESI和質譜技術，可以得到多電荷峰，獲得精確的分子量數值。這兩種方法各有其優(yōu)點及適用的領域。MALDI離子化效率非常高，可以對極微量的樣品進行分析。桂萌[15]對鱘魚特定腐敗菌產生的N-?；呓z氨酸內酯類(AHLs)提取物用HPLC-Trap-Ms進行三級碎片結構分析，由于丟失高絲氨酸內酯環(huán)，可以通過特征碎片鑒定出兩種AHLs化合物;用HPLC/QqQ-Ms鑒定得出了除上面兩種之外的第三種；用HPLC-QTOF-Ms和串聯(lián)全信息數據掃描功能，可以得到母離子和碎片離子的精確質量數，所測得的各峰精確分子量和計算得到的理論值均小于5 mDa，共鑒定出4種AHLs：C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-OH-C8-HSL和C8-HSL。樂復能是一種相對分子質量為19300的基因工程類藥物，李萌等[16]用HPLC-ESI-Q-TOF-MS繪制樂復能經胰蛋白酶酶切后的液質肽圖,并定位二硫鍵；用電噴霧四級桿飛行時間質譜(ESI-Q-TOF-MS)測定其精確相對分子質量，找到了12個酶切肽段，檢測到的相對分子質量為19 311.63，將肽圖與相對分子質量結合分析,推測氨基酸序列是正確的。Wang等[17]將芝麻蛋白水解物用3種蛋白酶水解，再用固定的金屬親和色譜法從胰蛋白酶水解產物中分離出金屬螯合肽并用反相(RP)-HPLC和質譜(LC-MS/MS)鑒定出6種鋅螯合肽，分別得到了它們的分子量，與理論值相符。Mojica等[18]將13種豆類蛋白分離物用SDS-PAGE和蛋白質凝膠內消化HPLC/MS識別，主要有菜豆素、凝集素、蛋白酶和α-淀粉酶抑制劑；用HPLC-MS/MS鑒定出豐富的肽，分子質量范圍為300～1 500 Da，重要的序列為 SGAM、DSSG、LLAH、YVAT、EPTE和KPKL。α-淀粉酶抑制劑被鑒定為條帶J/K/L，分子量分別為18、16和14 kDa。凝集素(F帶和H帶)分別為33和25 kDa，胰蛋白酶抑制劑在20 kDa(I帶)，BBI在10 kDa以下(M帶)。

3 定量測定中的應用

蛋白質的定量分析是在蛋白質水平上通過比較樣品中目標蛋白的信號強度來完成的，對樣品中的蛋白質進行準確可靠的定量分析，是經常進行的一項非常重要的工作，在生物制品、食品、藥品的質量監(jiān)測中扮演著重要的角色，它可以用來確定樣品中蛋白質的總量，也可以測某種單一蛋白成分的含量，是尋找治療靶標分子和疾病標志物的有效工具。

3.1 定量蛋白組學研究 細胞蛋白的表達范圍很廣，定量所需的信息質量遠遠超出了蛋白質鑒定的質量，因此目前的質譜技術通常僅對樣品中蛋白的一部分進行采樣，在鑒定出的蛋白質中只有一小部分可以可靠地定量，通常需要在實驗之間比較每種單獨的肽。Bhat等[19]將乳清中的蛋白質分離成高豐度和低豐度用胰蛋白酶消化后在C18超高效液相色譜色譜柱上分離肽，用基于高分辨率Q-TOF質譜的定量蛋白質組學技術的來區(qū)分比較澤西和克什米爾牛的牛奶蛋白質組水平，使用搜索引擎尋找肽段光譜進行鑒定，得到克什米爾和澤西島牛之間180種蛋白質的差異表達，共有81種高豐度和99種低豐度蛋白質表達，通過通路分析進行生物學解釋，unique和razor peptides進行定量，結果得到克什米爾人的牛乳中表達最上調的為免疫相關蛋白和藥物代謝酶；澤西牛奶蛋白質組則呈現更高濃度的酶調節(jié)劑和水解酶表達。

目前常用的有兩種定量蛋白質組學方法，一種是使用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)，另一種涉及液相色譜/串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)和穩(wěn)定同位素標記。由于凝膠電泳法與常用的染色程序結合使用時，對于蛋白質檢測的動態(tài)范圍有限，而液相色譜/串聯(lián)質譜的方法有著很寬的動態(tài)范圍，能夠檢測到幾乎所有的蛋白質，因此可以運用質譜儀識別標記的和未標記形式的肽之間的質量差異，比較它們各自的信號強度來實現定量。Mori等[20]將牛血清蛋白用胰蛋白酶消化后用18O單標記方法標記肽片段的C末端羧基，使用配備了NanoFrontier LD的納米級液相色譜電噴霧電離質譜(nano LC-ESI-MS)來分析18O標記肽，用nano LC-ESI-MS/MS分析未標記肽與標記肽的任意比例混合物，結果證明單標記需要較高的PH條件，加入MEA有助于產生18O單標記,在產物離子中使用y離子的同位素比能提供豐富的豐度比，觀察到的5個肽片段的同位素比在理論值的2倍以內；還通過分析溶菌酶的豐度比將18O單標記與iTRAQ方法比較，在此實驗中，18O單標記得到的值更接近，表明了目前的方法對結合nano LC-ESI-MS/MS的定量蛋白質組學是有效的。

Yang等[21]采用體外標記相對定量技術(iTRAQ)，用不同的標記試劑標記牛、水牛、山羊和駱駝奶中的乳清蛋白質，利用強陽離子交換色譜和反相nano色譜分離后通過使用串聯(lián)質譜MS/MS測量報告離子的峰強度，結合蛋白質組學方法鑒定出211種，計算標記樣品中鑒定出的肽段的相對比例進行肽定量，并且通過基因本體論對113種蛋白進行功能表征將其分成3個功能組，根據PCA結果得出的動物物種間的差異蛋白177種，鑒定比較后可以得出乳清蛋白中的主要成分α-乳清蛋白在駱駝奶中豐度最高，牛乳、山羊乳中不存在，表征了不同物種中蛋白質組模式的差異。iTRAQ技術相對于其他的蛋白質組學定性定量技術來說，重復性好，適用于低豐度蛋白的研究。馮培民等[22]利用同位素標記的相對和絕對定量(iTRAQ-4plex)與液相色譜和質譜串聯(lián)結合的蛋白質組學定量分析技術，對慢性乙肝證候差異蛋白組學進行對比研究，鑒定出蛋白質501個，其中可以用來定量的有491種，比較了肝郁脾虛證與脾胃濕熱證、肝膽濕熱證和健康人組之間上調蛋白和下調蛋白的數量，從蛋白的功能分析來看，各組間均有差異蛋白的不同功能特點，各組間均有差別的通路。Affolter等[23]用3種策略對富含乳脂小球膜(MFGM)的兩種濃縮物的蛋白質組進行定性定量分析，將強陽離子交換色譜與反相C18分離相結合并配備了nano ESI來源的Orbitrap MS系統(tǒng)用2D-2L方法實現了鳥槍蛋白組學分析，其次將消化液用高效液相色譜分離然后重新注入Orbitrap MS系統(tǒng)進行無標記的半定量分析,最后通過穩(wěn)定的同位素稀釋MS與在三重四極桿MS系統(tǒng)上的多反應監(jiān)測相結合而實現了對所選7種蛋白的絕對的定量分析，分別揭示了WPC中的244種蛋白質和BMP中的133種蛋白質身份，對前34種蛋白進行指紋分析與相對定量，產生了有價值的蛋白質指紋圖譜，并提供了這兩個餾分中蛋白質含量的廣泛表征。

3.2 其他定量研究 除了用蛋白組學方法，也有許多對蛋白質進行絕對定量和相對定量的研究。RAD是一種基于還原胺化和二甲基化的蛋白質糖基化定量方法，即先用NaBH3CN或NaBD3CN還原樣品使產生1 Da的質量偏移并穩(wěn)定早期蛋白質糖基化，Tong等[24]將樣品用胰蛋白酶消化后用二甲基化試劑還原胺化，RAD標記后的樣品用MALDI-TOF-TOF-MS進行分析，根據糖基化肽和非糖基化肽的質量變化，識別出同位素峰，在蛋白質和肽水平上都實現了定量，得到了R(L/H)低于1的39個肽段和高于上述3個肽段的3個肽段。Casado-Vela等[25]描述了兩種樣品4-protmix和8-protmix適用于使用iTRAQ進行相對蛋白質定量，ChipLC與6530 Q-TOF聯(lián)用和1200 nano-HPLC-LTQ Orbitrap聯(lián)用對3個復制品進行分析，成功鑒定和定量了樣品中的所有蛋白質，使用4-protmix，可以測量高達24倍的相對蛋白質變化；8-protmix可以定量蛋白質混合物中相對蛋白質變化的濃度，濃度范圍為兩個數量級，相對豐度差異十倍。Alexia等[26]用胰蛋白酶消化人肝和腸道微粒體后獲得肽，并通過高效液相色譜和加熱的電噴霧電離串聯(lián)質譜使用兩個蛋白型肽對14種主要的CYP450亞型進行絕對蛋白質定量，對于所有蛋白型肽，在適當的校準范圍內是線性，LLOQ濃度為0.1 nmol·L-1，確定此方法是可行的并用于分析了市售人肝微粒體中的12種CYP450，檢測到的CYP4F2為(20±1)pmol·mg-1；CYP3A7為(2.3±1.5)pmol·mg-1；CYP2J2為(2.1±0.6)pmol·mg-1。

本篇綜述探討了HPLC-MS在大分子蛋白質檢測中的應用，主要介紹了鑒定與定量中的一些內容，由于篇幅有限，還有許多定性鑒定的方法以及多種類型藥物的定量問題并沒有詳細介紹。蛋白組學在一定程度上推動了液質聯(lián)用檢測技術的發(fā)展，這項技術也同時推動著生物大分子領域的研究。不同種類的質譜儀有著各自的特點，分析不同的物質時可以選擇不同的方法以達到最好的分析效果，但也存在著一些困難，有些對于低含量的物質的檢測的準確性要較差一些。綜上所述，液質聯(lián)用技術不僅在各種小分子化合物的檢測中發(fā)揮著重要的作用，以后將會在大分子物質的分析中發(fā)揮著更重要的作用，在摻假物質鑒別、靶蛋白表征和生物標記物的發(fā)現等中起到重要的作用[27]。隨著時代的發(fā)展，液質聯(lián)用技術將會為分析科學的發(fā)展做出更大的貢獻。