趙世娟，嚴(yán)家瑞，史婷，嚴(yán)真，尹莉芳

(中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑系，江蘇省緩釋智能制劑及關(guān)鍵功能性輔料開(kāi)發(fā)與評(píng)價(jià)工程研究中心，江蘇 南京 210009)

潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性終生性炎癥性疾病，病因不明，可能由遺傳易感性、環(huán)境等多種因素共同導(dǎo)致腸道免疫功能失調(diào)，從而導(dǎo)致腸道炎癥，臨床出現(xiàn)腹瀉、血便、直腸出血、里急后重和腹痛等癥狀，特點(diǎn)為反復(fù)發(fā)作。調(diào)查顯示，全球范圍內(nèi)，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率逐年上升[1-3]。

美沙拉嗪結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、安全性高，自20世紀(jì)40年代以來(lái)就用于治療潰瘍性結(jié)腸炎，目前用作一線治療藥物[4]，作用機(jī)理未完全明確，在結(jié)腸黏膜處通過(guò)干擾多條炎癥途徑發(fā)揮抗炎作用[5]，而普通制劑口服后被胃腸道近端迅速吸收，僅少量到達(dá)結(jié)腸，需多次給藥，患者依從性差。為克服上述不良反應(yīng)，結(jié)腸靶向美沙拉嗪制劑的研制成為研究熱點(diǎn)[6]。

目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的美沙拉嗪制劑有栓劑、灌腸液、顆粒劑和腸溶片等，其中，口服制劑每天3～4次用藥，患者順應(yīng)性差。美國(guó)上市的美沙拉嗪腸溶緩釋片(商品名：Lialda)每天一次用于輕度至中度潰瘍性結(jié)腸炎的誘導(dǎo)和維持緩解，極大提高了患者的順應(yīng)性，隨后在英國(guó)、日本等國(guó)家上市。本課題以Lialda作為參比制劑，以體外釋放為指標(biāo)，篩選最優(yōu)處方。

1 儀器與試藥

AR223CN千分之一天平(奧豪斯儀器有限公司)；MT-ME104/MT-XS105DU分析天平/MT-FE28 pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司)；熱熔擠出機(jī)[安拓思納米技術(shù)(蘇州)有限公司]；DP-30A單沖壓片機(jī)(北京新龍立科技有限公司)；YPD-300C型智能片劑硬度測(cè)定儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；CHC-38高效包衣機(jī)(創(chuàng)志機(jī)電科技發(fā)展有限公司)；RC-806D智能溶出試驗(yàn)儀(天津天大天發(fā)科技有限公司)；UV-1800紫外分光光度儀(島津有限公司)。

美沙拉嗪原料藥(批號(hào)：2-20200615，牡丹江恒遠(yuǎn)藥業(yè)股份有限公司)；美沙拉嗪腸溶緩釋片(批號(hào)：1165486，Shire Development Inc)；巴西棕櫚蠟(批號(hào)：2020030562，河南福美生物科技有限公司)；硬脂酸(批號(hào)：20200203，湖州展望藥業(yè)有限公司)；羧甲基纖維素鈉(CMC 7MF PH/CMC 7HXF PH，批號(hào)：NPF-0016/C192223，Ashland)；羧甲淀粉鈉/二氧化硅/硬脂酸鎂(批號(hào)：191140/200111/200354，安徽山河藥用輔料公司)；滑石粉(批號(hào)：201901128，廣西龍廣滑石開(kāi)發(fā)股份有限公司)；丙烯酸樹(shù)脂(批號(hào)：B191203218/B200405203，Eudragit L100/Eudragit S100，Evonik)；檸檬酸三乙酯(批號(hào)：200304，蚌埠豐原涂山制藥有限公司)；二氧化鈦/氧化鐵紅(批號(hào)：20200604/20200527，寧波一品生物技術(shù)有限公司)；聚乙二醇6000(批號(hào)：20200305，江西阿爾法高科藥業(yè)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 釋放度測(cè)定方法的建立

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng) 文獻(xiàn)報(bào)道，美沙拉嗪在0.1 mol·L-1鹽酸溶液、pH 6.4和pH 7.2磷酸鹽緩沖液中的溶解度(37 ℃)均高于2 mg·mL-1[7]。取美沙拉嗪原料藥25 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL量瓶中，分別加入上述3種介質(zhì)溶解、稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為0.5 mg·mL-1的儲(chǔ)備液。分別精密量取2 mL儲(chǔ)備液，置50 mL量瓶中，相應(yīng)介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，在190～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示美沙拉嗪在3種釋放介質(zhì)中的最大吸收波長(zhǎng)分別為303、330、331 nm，分別選擇美沙拉嗪在各介質(zhì)中的最大吸收波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 線性關(guān)系 按照“2.1.1”項(xiàng)下方法配制儲(chǔ)備液，分別精密量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 mL，置50 mL量瓶中，相應(yīng)介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，配制系列濃度溶液，分別在“2.1.1”項(xiàng)下美沙拉嗪在各介質(zhì)中的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

以美沙拉嗪濃度C(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合。結(jié)果顯示，在0.1 mol·L-1鹽酸溶液中，美沙拉嗪濃度在5～35 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為Y=0.022 7X+0.005 9(r=0.999 9)；在pH 6.4磷酸鹽緩沖液，美沙拉嗪濃度在10～40 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性良好，回歸方程為Y=0.019 4X-0.011 7(r=0.999 9)；在pH 7.2磷酸鹽緩沖液中，美沙拉嗪濃度在5～35 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性亦良好，回歸方程為Y=0.021 8X+0.000 3(r=0.999 9)。

2.1.3 釋放度測(cè)定方法 參照美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)溶出方法數(shù)據(jù)庫(kù)中參比制劑的釋放方法、《美國(guó)藥典》USP40-NF35中美沙拉嗪腸溶片標(biāo)準(zhǔn)[8]，采用溶出度與釋放度測(cè)定法(《中國(guó)藥典》2020年版通則0931第二法)測(cè)定[9]，轉(zhuǎn)速100 r·min-1，溫度(37±0.5)℃，釋放分為3個(gè)階段：①在0.1 mol·L-1鹽酸溶液750 mL中釋放2 h時(shí)取樣，0.45 μm水系微孔濾膜濾過(guò)2 mL，續(xù)濾液即為供試品溶液，配制濃度為20 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，在303 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度，計(jì)算釋放量，應(yīng)不大于標(biāo)示量的1%；②取酸中釋放2 h后的供試片，浸入預(yù)熱至37 ℃的pH 6.4磷酸鹽緩沖液950 mL中，釋放1 h時(shí)取樣，0.45 μm水系微孔濾膜濾過(guò)2 mL，續(xù)濾液即為供試品溶液，配制濃度為20 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，在330 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度，計(jì)算釋放量，應(yīng)不大于標(biāo)示量的1%；③取pH 6.4磷酸鹽緩沖液中釋放1 h后的供試片，浸入預(yù)熱至37 ℃的pH 7.2磷酸鹽緩沖液960 mL中，經(jīng)1、2、4、6、8 h分別取樣10 mL，取樣后補(bǔ)充pH 7.2磷酸鹽緩沖液10 mL，0.45 μm水系微孔濾膜濾過(guò)2 mL，取續(xù)濾液稀釋后作為供試品溶液，配制濃度為30 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，在331 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度，計(jì)算各個(gè)取樣點(diǎn)的累積釋放度。

2.2 美沙拉嗪腸溶緩釋片的制備 參考專(zhuān)利CN1217665C[10]，美沙拉嗪腸溶緩釋片的制備過(guò)程如下：將處方量美沙拉嗪與黏合劑熔融制粒，冷卻至室溫，加入羧甲基纖維素鈉和羧甲淀粉鈉混合均勻，加入硬脂酸鎂、二氧化硅和滑石粉總混后壓片，將所得片劑用丙烯酸樹(shù)脂聚合物包衣。

2.2.1 片芯處方篩選

2.2.1.1 原料藥粒徑的考察 美沙拉嗪為BCS Ⅳ類(lèi)藥物[11]，難溶性藥物粒徑大小可能會(huì)影響溶出或釋放速度。采用不同粒徑的美沙拉嗪原料藥制備片芯，考察原料藥粒徑對(duì)片芯釋放的影響，按照“2.1.3釋放度測(cè)定方法”第3階段測(cè)定，釋放曲線見(jiàn)圖1，結(jié)果表明，原料藥D90在28.58～98.81 μm范圍內(nèi)，藥物釋放速度無(wú)明顯差異，分析可能原因，雖然原料藥為難溶性藥物，但在pH 7.2磷酸鹽緩沖液中的溶解度(37 ℃)為5.6 mg·mL-1，介質(zhì)體積為960 mL，滿足漏槽條件，且為緩釋制劑，因此，原料藥D90在28.58～98.81 μm范圍制劑釋藥速度無(wú)明顯差異，選擇D90為98.81 μm的原料藥進(jìn)行研究。

圖1 原料藥粒徑對(duì)釋放的影響

2.2.1.2 熔融黏合劑用量的考察 熔融黏合劑(巴西棕櫚蠟、硬脂酸)通過(guò)與API熔融制粒，作為親脂性基質(zhì)，減慢腸液對(duì)片芯的滲透，控制藥物釋放。熔融黏合劑和API分別以1∶80、1∶16和1∶9的質(zhì)量比熔融制粒制備片芯，考察不同熔融黏合劑用量對(duì)釋放的影響，按照“2.1.3釋放度測(cè)定方法”第3階段測(cè)定，結(jié)果表明，熔融黏合劑和API以1∶80的質(zhì)量比制粒時(shí)，所得顆粒可壓性差，壓片過(guò)程中裂片；以1∶16和1∶9的質(zhì)量比制備的片芯釋放曲線見(jiàn)圖2，藥物釋放速度無(wú)明顯差異，美沙拉嗪為高載藥量藥物，為減少輔料用量，選擇熔融黏合劑與API質(zhì)量比為1∶16制備處方。

圖2 熔融黏合劑與API比例對(duì)釋放的影響

2.2.1.3 緩釋材料型號(hào)的考察 緩釋材料(羧甲基纖維素鈉)作為親水性基質(zhì)，暴露于腸液后會(huì)溶脹并形成黏性凝膠，將減慢腸液的滲入和藥物從片芯的擴(kuò)散，從而控制釋放。根據(jù)黏度分類(lèi)，羧甲基纖維素鈉具有不同的型號(hào)，可以滿足不同釋放曲線。美國(guó)Ashland 公司的Blanose羧甲基纖維素鈉具有多種型號(hào)，常用作緩釋材料，選擇常用的CMC 7HXF PH和CMC 7MF PH進(jìn)行篩選，固定總用量為50 mg，考察CMC 7HXF PH、CMC 7MF PH和二者合用對(duì)釋放的影響，按照“2.1.3釋放度測(cè)定方法”第3階段測(cè)定，釋放曲線見(jiàn)圖3，結(jié)果表明，CMC 7MF PH和CMC 7HXF PH混合比例為1∶3和單獨(dú)使用CMC 7HXF PH時(shí)，均具有較好的緩釋效果，藥物釋放速度無(wú)明顯差異，選擇CMC 7HXF PH作緩釋材料。

圖3 CMC型號(hào)對(duì)釋放的影響

2.2.1.4 緩釋材料用量的考察 采用不同用量的CMC 7HXF PH制備片芯，考察緩釋材料用量對(duì)釋放的影響，按照“2.1.3釋放度測(cè)定方法”第3階段測(cè)定，釋放曲線見(jiàn)圖4，結(jié)果表明，CMC 7HXF PH用量對(duì)藥物釋放有影響，隨CMC 7HXF用量增加，藥物釋放減慢。用量為25 mg時(shí)，1 h釋放量高于90%，無(wú)緩釋效果；用量為50 mg和75 mg時(shí)，藥物緩慢釋放，初步選擇用量為50 mg，后續(xù)進(jìn)一步優(yōu)化處方。

圖4 緩釋材料用量對(duì)釋放的影響

2.2.1.5 崩解劑用量的考察 采用不同用量的CMSNa制備片芯，考察崩解劑CMSNa用量對(duì)釋放的影響，按照“2.1.3釋放度測(cè)定方法”第3階段測(cè)定，釋放曲線見(jiàn)圖5，結(jié)果表明，用量為15和30 mg時(shí)，藥物釋放無(wú)明顯差異；用量在30～45 mg范圍內(nèi)，隨CMSNa用量增加，藥物釋放加快，初步選擇用量為30 mg，后續(xù)進(jìn)一步優(yōu)化處方。

圖5 崩解劑用量對(duì)釋放的影響

2.2.2 腸溶包衣層處方篩選

2.2.2.1 腸溶材料的考察 Eudragit L100和Eudragit S100為常用的腸溶材料，前者在pH>6時(shí)溶解，后者在pH>7時(shí)溶解。將Eudragit L100和Eudragit S100聯(lián)用，通過(guò)調(diào)節(jié)比例可控制腸溶包衣膜在不同pH環(huán)境中溶解，從而實(shí)現(xiàn)腸道靶向功能。固定包衣增重為8%，考察Eudragit L100、Eudragit S100和二者合用包衣時(shí)對(duì)釋放的影響，按照“2.1.3釋放度測(cè)定方法”測(cè)定，釋放結(jié)果見(jiàn)表1和圖6，結(jié)果表明，腸溶材料對(duì)藥物釋放有影響，隨Eudragit S100比例增加，腸溶緩釋片耐酸性增強(qiáng)，藥物釋放速度減慢。根據(jù)參比制劑說(shuō)明書(shū)[12]，腸溶包衣層同時(shí)含有Eudragit L100和Eudragit S100，二者比例為1∶1時(shí)，自制片可有效耐酸，因此，初步選擇二者比例為1∶1，后續(xù)進(jìn)一步優(yōu)化處方。

表1 Eudragit L100和Eudragit S100聯(lián)用比例對(duì)耐酸性(釋放度，%)的影響

圖6 Eudragit L100和Eudragit S100聯(lián)用比例對(duì)釋放的影響

2.2.2.2 包衣增重的考察 分別增重6%、8%和10%，考察包衣增重對(duì)腸溶緩釋片釋放的影響，按照“2.1.3釋放度測(cè)定方法”測(cè)定，釋放結(jié)果見(jiàn)表2和圖7，結(jié)果表明，包衣增重對(duì)藥物釋放有影響，包衣增重增加，腸溶緩釋片的耐酸性增強(qiáng)，藥物在pH 7.2磷酸鹽緩沖液中的釋放減慢。包衣增重為6%時(shí)，自制片即可有效耐酸，因此，初步選擇包衣增重為6%，后續(xù)進(jìn)一步優(yōu)化處方。

表2 包衣增重對(duì)耐酸性(釋放度，%)的影響

圖7 包衣增重對(duì)釋放的影響

2.3 正交優(yōu)化 從單因素考察的結(jié)果看，片芯中CMC 7HXF PH的用量和CMSNa的用量，腸溶包衣層包衣材料比例和包衣增重對(duì)腸溶緩釋片的體外釋放影響顯著，針對(duì)上述4個(gè)關(guān)鍵因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，選取正交設(shè)計(jì)表L9(34)進(jìn)行試驗(yàn)，以自制美沙拉嗪腸溶緩釋片和參比制劑的相似因子f2為指標(biāo)，得到最優(yōu)處方。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果見(jiàn)表3～7。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表

以自制片與參比制劑的相似因子f2為評(píng)價(jià)指標(biāo)，極差R反映了各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度，極差越大，表明影響越顯著，由表5可知，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度為：CMSNa用量>包衣增重>CMC 7HXF PH用量>腸溶包衣材料比例，最優(yōu)組合為A2B3C2D1，即CMC 7HXF PH的用量為45 mg，CMSNa的用量為35 mg，腸溶包衣中包衣材料Eudragit L100∶Eudragit S100=2∶3，包衣增重為4%，即處方4，但該處方在pH 6.4磷酸鹽緩沖液中的釋放量大于1%，不符合腸溶緩釋片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此對(duì)該處方進(jìn)一步優(yōu)化。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 相似因子極差分析

以自制制劑在pH 6.4磷酸鹽緩沖液中的釋放度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，由表6可知，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度為：包衣增重>CMC 7HXF PH用量、腸溶包衣材料比例>CMSNa用量，故對(duì)上述最優(yōu)處方增加包衣增重，以減少腸溶緩釋片在pH 6.4磷酸鹽緩沖液中的釋放。將上述最優(yōu)處方包衣增重增加至6%，測(cè)定自制片的體外釋放，結(jié)果見(jiàn)表7，包衣增重為6%時(shí)，自制片即可有效耐酸，且f2高于正交試驗(yàn)的各組處方，因此，最優(yōu)處方為CMC 7HXF PH用量為45 mg，CMSNa用量為35 mg，腸溶包衣材料Eudragit L100∶Eudragit S100=2∶3，包衣增重為6%。

表6 pH 6.4磷酸鹽緩沖液中的釋放度極差分析

表7 包衣增重對(duì)釋放的影響

2.4 最優(yōu)處方工藝重現(xiàn) 按照上述最優(yōu)處方制備3批美沙拉嗪腸溶緩釋片，照“2.1.3”項(xiàng)下進(jìn)行釋放度測(cè)定，以驗(yàn)證處方工藝的穩(wěn)定性，釋放結(jié)果見(jiàn)表8～9、圖8，結(jié)果表明，3批自制片均可有效耐酸，體外釋放基本一致，且均與參比制劑相似，說(shuō)明該處方工藝穩(wěn)定可靠。

表8 美沙拉嗪腸溶緩釋片的耐酸性(釋放度，%)

圖8 自制制劑、參比制劑的釋放曲線

表9 不同批次自制制劑、參比制劑的釋放曲線相似性

3 討論

本研究建立了美沙拉嗪腸溶緩釋片釋放度測(cè)定方法，該方法可用于美沙拉嗪腸溶緩釋片體外釋放度的測(cè)定。

選擇美國(guó)上市的Lialda為參比制劑，以體外釋放為考察指標(biāo)，通過(guò)對(duì)片芯和腸溶包衣層進(jìn)行單因素處方篩選，明確了影響體外釋放的關(guān)鍵因素，通過(guò)正交優(yōu)化得到了最優(yōu)處方，重現(xiàn)3批制劑，批間相似且均與參比制劑體外釋放相似，表明處方工藝穩(wěn)定，具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景，有望提高潰瘍性結(jié)腸炎患者用藥順應(yīng)性問(wèn)題。