王睿哲，施強慧，張子凡，鐘華建，王云浩，沈曉龍，曹鵬，陳華江，徐辰，袁文*

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院脊柱外科，上海 200003；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)，上海 200433)

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IDD)是腰痛和頸肩痛的主要病因之一，在全球范圍內(nèi)對患者造成巨大的經(jīng)濟負擔(dān)以及生活質(zhì)量的嚴重下降。IDD的病因十分復(fù)雜，包括基因、年齡、職業(yè)等多因素，但其具體機制仍不十分明確。近年來發(fā)現(xiàn)，炎癥和基質(zhì)代謝紊亂在IDD中發(fā)揮了重要作用。經(jīng)典促炎因子IL-1β或TNF-α常用于體外構(gòu)建髓核細胞的退變模型[1]。近年來，有研究[2-3]發(fā)現(xiàn)在退變的椎間盤髓核(nucleus pulposus，NP)組織中發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶3樣蛋白1 (chitinase 3-like protein 1， CHI3L1)的表達水平升高，推測其可能參與椎間盤退變進程，但具體作用機制尚未見明確報道。1990年40 kDa大小的CHI3L1首次被描述為由滑膜細胞分泌的高度保守的肝素結(jié)合糖蛋白。CHI3L1 基因由10 個外顯子組成，位于染色體1q31-q32 上，產(chǎn)物CHI3L1/YKL-40 由383個氨基酸組成[4]。相關(guān)文獻表明炎癥相關(guān)基因CHI3L1參與多種組織炎癥反應(yīng)以及組織損傷后的重塑過程，但其具體的作用目前尚未明確[1-2]。而在椎間盤退變進展中，炎癥的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著十分重要的作用。因此，本課題將重點圍繞炎癥相關(guān)因子CHI3L1在椎間盤髓核細胞退變中的作用進行功能研究，以明確CHI3L1對椎間盤退變疾病的影響。

1 材料和方法

1.1 髓核組織樣本的收集

本組獲得患者或親屬知情同意后在術(shù)中獲得人體椎間組織。實驗方法按照批準的指南進行，研究由海軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會授權(quán)(批準號：13071002114)。人類的髓核(NP)組織均來自在海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院進行椎間盤切除術(shù)的患者。在術(shù)中收集腰椎間盤突出癥患者手術(shù)中的椎間盤樣本作為退變組(IDD組)，同時收集腰椎外傷患者手術(shù)中的椎間盤樣本作為對照組(IVD組，根據(jù)Pfirrmann分級進行收集，0級為正常樣本，3～5級為退變樣本)用于后續(xù)免疫組化和細胞培養(yǎng)。

1.2 髓核細胞的分離培養(yǎng)

取得正常NP組織樣品后，立即用PBS洗滌NP組織樣品2次，然后切碎并在DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)中用2 U/mL蛋白酶在37 ℃下消化30 min。通過用0.25 mg/mL Ⅱ型膠原酶(美國Gibco公司，目錄號17101-015)在37 ℃處理4 h，從NP組織釋放NP細胞。將剩余的細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到40 μm細胞過濾器(美國BD Biosciences公司)中，并以800 g離心5 min。將NP細胞重懸于含有10%FBS(美國Gibco公司)，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素和1%L-谷氨酰胺的DMEM/F12中。當使用細胞計數(shù)試劑盒-8(日本Dojindo公司)評估時，懸浮細胞的存活率超過90%。將細胞在37 ℃，5%CO2中培養(yǎng)，每3天更換培養(yǎng)基。第二次傳代的細胞用于隨后的實驗程序。對于體外NP細胞退變，我們通過使用Recombinant Human IL-1β(美國PEPROTECH公司)(25 ng/ml)處理NP細胞48 h以建立體外椎間盤退變模型。通過CHI3L1過表達質(zhì)粒(和元生物技術(shù)上海股份有限公司)或者YKL-40人重組蛋白(北京義翹神州科技有限公司)過表達CHI3L1水平。通過干擾RNA敲低CHI3L1水平。

1.3 RNA抽提與實時定量PCR檢測

使用RNAiSO(日本TAKARA公司)按照產(chǎn)品說明書從干預(yù)的人NP樣品中收集總RNA。 用分光光度計(DU-800; 美國Beckman Coulter公司)在260 nm處測量總RNA的濃度。 根據(jù)產(chǎn)品說明書，使用帶有g(shù)DNA Eraser(日本TAKARA公司)的PrimeScriptTMRT試劑盒進行20 uL最終反應(yīng)混合物的逆轉(zhuǎn)錄。 通過使用TBGreen?PrepixEx TaqTM(日本TAKARA公司)和Step One Plus實時PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)進行實時PCR。 GAPDH用于標準化其他mRNA的基因表達。 根據(jù)比較Ct方法計算每種轉(zhuǎn)錄物的相對量。每個實驗獨立重復(fù)至少3次，引物序列見表1。

表1 定量RT-PCR分析中所有引物的寡核苷酸序列

1.4 干擾RNA轉(zhuǎn)染

干擾RNA(siRNA)購自上海吉瑪基因。根據(jù)Lipofectamine RNAiMAX Reagent(美國Thermo Fisher SCIENTIFIC公司)的使用說明進行實驗，將9 uL Lipofectamine RNAiMAX試劑在150 uL DMEM中稀釋，同時將3 uL(30 pmol)siRNA稀釋于另一管150 uL DMEM中并在使用前混合并溫育5 min。siRNA的序列見表2。

表2 本研究中使用的siRNA序列

1.5 免疫組織化學(xué)染色

進行免疫組織化學(xué)以定位人NP樣品中的CHI3L1表達。一般免疫組織化學(xué)方案已在別處描述[6]。簡言之，石蠟包埋組織切取5 μm厚切片，切片在二甲苯中脫蠟，在乙醇梯度中再水化。洗滌后，在室溫下用0.3%H2O2浸泡玻片，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，使用胰蛋白酶在37℃下進行抗原修復(fù)30 min，并在室溫下用1%牛血清白蛋白封閉切片15 min。接下來，將切片在4℃下與以下一抗孵育過夜：針對CHI3L1的兔多克隆抗體(1：100稀釋)。接下來，將第二抗體過氧化物酶綴合的親脂性山羊抗兔IgG(1：1 000稀釋，中國Proteintech公司)應(yīng)用于切片，并將它們用蘇木精復(fù)染色。先前已經(jīng)描述了圖像分析程序[5]，簡要地，使用ZEISS顯微鏡(ZEISS Axio Imager A2，德國Carl Zeiss microscopy GmbH公司)對樣品成像。免疫染色的載玻片由2位對患者數(shù)據(jù)和結(jié)果不知情的病理學(xué)家獨立鑒定。當評估結(jié)果不同時，復(fù)審后應(yīng)達成共識。在每個樣品中，計數(shù)200個細胞，并且免疫陽性細胞的數(shù)量表示為該樣品的比例。

1.6 Transwell分析

NP細胞被植入涂有基質(zhì)凝膠的上室(美國BD Biosciences公司)。8 h后，以25 ng/mL的濃度處理炎癥細胞因子IL-1β。培養(yǎng)48 h后，用拭子輕輕擦洗含上室表面基質(zhì)凝膠中的細胞。為了在上室中觀察遷移的細胞，用4%多聚甲醛固定細胞30 min，用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，用ddH2O洗滌，直到水澄清。自然風(fēng)干后，在顯微鏡下觀察樣品。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。使用D檢驗檢測數(shù)據(jù)的正態(tài)分布。人NP組織中免疫陽性NP細胞的數(shù)據(jù)未通過正態(tài)性檢驗; 因此，通過應(yīng)用雙側(cè)曼-惠特尼U檢驗分析。 其余數(shù)據(jù)通過正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布的計量資料用表示，并進行雙側(cè)t檢驗或方差分析(ANOVA)，然后進行圖基檢驗，分別對兩組或多組進行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 退變的人椎間盤髓核組織中CHI3L1表達增加

免疫組化結(jié)果顯示，IDD組中髓核細胞CHI3L1的表達強度較IVD組顯著升高(12.50±4.86比1.01±0.21，P<0.05)，見圖1。

注：A：IVD組核組織；B：IDD組髓核組織

2.2 CHI3L1能夠保護NP細胞退變

明確siRNA的轉(zhuǎn)染效率后(圖2)，在由炎癥因子IL-1β誘導(dǎo)的人椎間盤退變模型中，通過使用siRNA敲低或通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達來調(diào)控CHI3L1的表達，對其總RNA進行抽提并通過Real-time PCR檢測相關(guān)基因的表達量。結(jié)果顯示，在干擾CHI3L1組(siCHI3L1)組中MMP1、MMP3、MMP13、ADAMTS4和ADAMTS5等炎癥相關(guān)基因顯著上調(diào)，在過表達CHI3L1組中顯著下降，見表3。此外，ACAN和COL2是經(jīng)典的髓核細胞外基質(zhì)合成基因，CHSY可以通過調(diào)節(jié)下游硫酸軟骨素發(fā)揮促進細胞外基質(zhì)合成的作用，也是重要的細胞外基質(zhì)合成相關(guān)基因[7]，在過表達CHI3L1組中ACAN、COL2和CHSY等髓核細胞外基質(zhì)相關(guān)基因的表達顯著增加，并且在siCHI3L1組中顯著降低，見表4。

1.51.00.50.0相對mRNA表達量***siCHI3L1-mixsiCHI3L1-2siCHI3L1-1siNC

表3 退變模型中炎癥相關(guān)基因相對mRNA表達水平變化

表4 退變模型中基質(zhì)合成相關(guān)基因相對mRNA表達水平變化

2.3 CHI3L1重組蛋白能夠顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的髓核細胞退變

在IL-1β誘導(dǎo)構(gòu)建的髓核細胞退變模型中，通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的YKL-40重組蛋白，48 h后對其總RNA進行抽提并通過Real-time PCR檢測相關(guān)基因的表達量。結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中添加不同濃度的CHI3L1重組蛋白均顯著降低MMP3和MMP13等炎癥相關(guān)基因的表達并同時能夠上調(diào)ACAN和COL2等基質(zhì)合成相關(guān)基因的表達，但其在200 μg/mL后效果進入平臺期，提示存在最大效應(yīng)濃度，見表5。

2.4 CHI3L1重組蛋白能夠顯著抑制髓核細胞分泌基質(zhì)降解因子的能力

通過將髓核細胞中植入含有基質(zhì)膠的Transwell小室檢測不同處理下的髓核細胞分泌炎癥相關(guān)因子對基質(zhì)降解的侵襲實驗，反應(yīng)髓核細胞在處理后分泌基質(zhì)降解因子能力的變化。通過。結(jié)果顯示，IL-1β能夠顯著的誘導(dǎo)髓核細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)分泌基質(zhì)降解因子，促進髓核細胞穿膜，而過表達CHI3L1后能夠明顯減弱IL-1β的作用，減少基質(zhì)降解因子分泌延緩髓核細胞穿膜，而siCHI3L1則明顯相反(圖3、表6)。

表5 不同濃度CHI3L1重組蛋白處理后相關(guān)基因相對mRNA表達量變化

注：A：空白對照組，B：白介素處理組，C：白介素+重組CHI3L1處理組，D：白介素+干擾CHI3L1處理組

表6 Transwell穿膜細胞量化分析比較

3 討 論

正如許多研究報道，IDD的病因復(fù)雜，包括機械負荷超載，細胞衰老，炎癥增強，水結(jié)合細胞外基質(zhì)退化[8-11]。其中，炎癥因素在IDD的進展中起著至關(guān)重要的作用，許多促炎因子均可導(dǎo)致IDD，如IL-1β、TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶(ADAMTS)等，其中最經(jīng)典的為IL-1β[9]。然而，這些促炎因子通常作用于全身的多個組織中，它們基本都缺乏組織特異性，因此基于促炎因子的治療在應(yīng)用于臨床之前仍需要克服許多問題[10]。并且，細胞外基質(zhì)(ECM)的代謝對IDD非常重要。在IDD期間，ECM的合成代謝和分解代謝是不平衡的[11]。此外，在IDD進展中抗炎因子鮮有報道。 SIRT1可通過TLR2/SIRT1/NF-κB途徑抑制IL-1β的變性作用[12]，而TIMP3可抑制MMPs和ADAMTS的表達[13]。這兩種炎癥相關(guān)因子在退變期間顯著下降，并且是抗IDD的潛在保護因素。然而，它們作為抗炎因子的作用不是組織特異性的。在這里，我們開始尋找一種特異性內(nèi)源性分子，能夠保護由炎癥引起的IDD。一些研究表明CHI3L1在椎間盤退變中的表達顯著增加[2-3]，然而，CHI3L1在IDD中的功能尚未闡明。本實驗中，我們通過使用免疫組化，同樣發(fā)現(xiàn)在IDD中炎癥相關(guān)的自分泌因子CHI3L1的表達量明顯升高。

多種細胞能分泌CHI3L1，如軟骨細胞，平滑肌細胞和骨肉瘤細胞，可以通過碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合幾丁質(zhì)，肝素，透明質(zhì)酸和膠原[4]，其功能通常與炎癥反應(yīng)和組織重塑有關(guān)[5]。 Libreros等[14]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者中，CHI3L1可顯著促進炎癥的發(fā)生發(fā)展并促進腫瘤的生長。Yeo等[15]指出炎癥以及一些免疫疾病可誘導(dǎo)CHI3L1表達升高，并且同時，CHI3L1能夠促進癌癥的增殖、炎癥細胞因子的產(chǎn)生和小膠質(zhì)細胞的活化。Conroy等[16]表明在兒童瘧疾中CHI3L1是急性腎損傷的一種生物標記物，CHI3L1通過促進炎癥導(dǎo)致瘧疾的進展。然而，它在炎癥中的作用仍然存在較大爭議，有些學(xué)者通過研究認為CHI3L1在炎癥中主要發(fā)揮著抑制炎癥的作用。G?rgens等[17]提出在人骨骼肌細胞中，由促炎細胞因子誘導(dǎo)的新型肌細胞因子CHI3L1可通過自分泌或者旁分泌機制以抑制TNFα介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗。Jung等[18]表明CHI3L1通過PPARδ抑制炎癥反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而改善動脈粥樣硬化反應(yīng)。因此，本研究從IDD中明顯高表達的炎性相關(guān)基因CHI3L1入手，進一步深入探究CHI3L1在IDD發(fā)生發(fā)展過程中的功能及機制。

有一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在星形細胞瘤[19]、炎癥性腸病[20]、膽管癌[21]、胃癌[22]、缺血性損傷[23]、哮喘[24]及膠質(zhì)母細胞瘤[25]等疾病中，CHI3L1都可以通過激活A(yù)KT(PKB)通路調(diào)控疾病的進展。Tsiperson等[26]發(fā)現(xiàn)Akt敲除小鼠脊髓中IL-17等炎性因子的水平明顯高于WT型小鼠，提出AKT3具有抑制炎癥反應(yīng)的作用從而抑制自身免疫性腦脊髓炎。Valls等[27]提出在構(gòu)建的小鼠肺炎球菌性腦膜炎中，AKT缺陷小鼠不僅炎癥相關(guān)基因的表達明顯增高，而且生存率更差，其實質(zhì)損害和血管浸潤的組織病理學(xué)評分也顯著增加。這些學(xué)者研究的結(jié)論為我們的發(fā)現(xiàn)提供了論據(jù)支持。而在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在構(gòu)建的髓核退變模型中過表達CHI3L1或者使用CHI3L1重組蛋白后，髓核的炎癥相關(guān)基因水平明顯降低，而基質(zhì)合成相關(guān)基因水平明顯升高，提示CHI3L1在椎間盤退變進程中發(fā)揮著抑制炎癥，促進細胞外基質(zhì)合成的作用。因此我們提出自分泌蛋白CHI3L1在椎間盤退變中可能起到保護椎間盤退行性變的作用，而這一效應(yīng)可能是由于通過調(diào)控下游的AKT，這可能具有潛在的治療價值，仍有待進一步研究。

盡管本研究表明在IDD中CHI3L1發(fā)揮了重要的抑炎保護椎間盤的作用，但也有一些局限性。關(guān)于CHI3L1如何發(fā)揮抑制炎癥、促進細胞外基質(zhì)合成的確切機制遠未完全揭示，而且缺少體內(nèi)實驗進一步明確。我們希望能夠進一步進行關(guān)于CHI3L1在椎間盤退變中的分子機制研究。