尚艷杰，潘鵬亮，李香蓉，李軻，林江，郭亞?wèn)|

1.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽(yáng)464000

法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)是節(jié)肢動(dòng)物科學(xué)和法醫(yī)學(xué)在廣泛領(lǐng)域結(jié)合并相互影響的一門新型邊緣交叉性學(xué)科，在腐敗尸體死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）推斷方面體現(xiàn)出特殊優(yōu)勢(shì)[1-2]。尸體上最常發(fā)現(xiàn)的昆蟲(chóng)是雙翅目（Diptera）中的蠅類，尤其是麗蠅科（Calliphoridae）、麻蠅科（Sarcophagidae）和蠅科（Muscidae）在實(shí)踐工作及科學(xué)研究中被法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)家廣泛關(guān)注[3-4]。由于不同嗜尸性蠅類生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律差異較大，因此準(zhǔn)確、快速的種類鑒定是利用嗜尸性蠅類進(jìn)行PMI 推斷的關(guān)鍵步驟[5-6]。在法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)實(shí)踐中，嗜尸性蠅類種類鑒定主要采用形態(tài)學(xué)和DNA 分析的方法，但是由于形態(tài)學(xué)鑒定要點(diǎn)極為復(fù)雜多變，DNA 種類鑒定費(fèi)用昂貴，且一些近緣種難以利用DNA 條形碼技術(shù)區(qū)分開(kāi)等問(wèn)題阻礙了其在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的應(yīng)用[7]。近年來(lái)，除了形態(tài)學(xué)或DNA 鑒定外，基于昆蟲(chóng)形態(tài)特征的數(shù)字化分析，由于簡(jiǎn)單、低成本和快速等特點(diǎn)，已經(jīng)逐漸被應(yīng)用于昆蟲(chóng)的種類鑒定、性別二態(tài)性、物種的地理變異等研究[8-9]。昆蟲(chóng)的形態(tài)特征分析包括使用一系列的參考點(diǎn)或標(biāo)志，對(duì)任何身體結(jié)構(gòu)進(jìn)行形態(tài)特征比較，去除不相關(guān)的信息，如樣本的位置和方向，并僅考慮其形態(tài)特征變化[10]。在雙翅目昆蟲(chóng)中，翅脈的交叉點(diǎn)通常被用作這種分析方法的標(biāo)志點(diǎn)。其中，應(yīng)用翅脈的圖像數(shù)字化分析進(jìn)行種類鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性已經(jīng)在一些雙翅目昆蟲(chóng)中得到了研究和證實(shí)[11-12]。

因此，本研究用腐肉野外隨機(jī)誘捕了7 種常見(jiàn)的嗜尸性蠅類作為研究對(duì)象，利用基于翅脈的圖像數(shù)字化分析對(duì)這幾種常見(jiàn)的嗜尸性蠅類進(jìn)行種類鑒定，以評(píng)估這種方法的可靠性。同時(shí)由于雌性嗜尸性蠅類在法醫(yī)學(xué)現(xiàn)場(chǎng)更常見(jiàn)而鑒別更難，本研究還單獨(dú)利用翅脈的圖像數(shù)字化分析對(duì)這7 種嗜尸性蠅類的雌性成蟲(chóng)進(jìn)行種類鑒定評(píng)估，期望為法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)中常見(jiàn)嗜尸性蠅類快速、準(zhǔn)確的種類鑒定提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 嗜尸性蠅類樣本的收集

2019 年9 月，在長(zhǎng)沙市岳麓山附近的草地上放置豬肺等腐肉，環(huán)境溫度21 ℃～32 ℃，濕度70%～85%，用捕蠅網(wǎng)隨機(jī)抓捕7 種嗜尸性蠅類，分別為棕尾別麻蠅Sarcophaga peregrina（Robineau-Desvoidy 1830）、緋角亞麻蠅Parasarcophaga ruficornis（Fabricius，1794）、醬亞麻蠅Sarcophaga dux（Thomson，1868）、擬東方辛麻蠅Seniorwhitea reciproca（Walker，1856）、紅尾糞麻蠅Bercaea cruentata（Meigen，1826）、裸芒綜蠅Synthe?siomysia nudiseta（Wulp，1883）、巨尾阿麗蠅Aldrichi?na grahami（Aldrich，1930）（表1）。上述采集到的嗜尸性蠅類首先由我國(guó)法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)專家陳祿仕教授在野外初步觀察分類，然后在實(shí)驗(yàn)室用體視顯微鏡（Moticam pro 285，北京瑞科中儀科技有限公司）根據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類法進(jìn)行種類鑒定，再帶回法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行傳代飼養(yǎng)。在飼養(yǎng)過(guò)程中，7 種嗜尸性蠅類共收集226 只用于后續(xù)的研究，每個(gè)蠅類物種收集的雌雄樣本數(shù)見(jiàn)表1。

表1 物種信息Tab.1 The information of fly specimens

1.2 翅脈的圖像數(shù)字化處理與數(shù)據(jù)采集

根據(jù)SONTIGUN 等[13]的方法，用細(xì)鑷子小心地取下每只蒼蠅完整無(wú)損傷的右翅，用于后續(xù)翅脈的形態(tài)特征分析。利用Epson Perfection V370 Photo 掃描儀［愛(ài)普生（中國(guó)）有限公司］的內(nèi)置透掃適配器對(duì)每一個(gè)翅膀進(jìn)行掃描，分辨率設(shè)置為1 200 dpi。掃描出的翅膀圖像用tpsUtil V.1.78 軟件[14]轉(zhuǎn)換為tps 文件以減少因標(biāo)記點(diǎn)位置導(dǎo)致的誤差。選取7 種蠅類右翅上共有的17 個(gè)翅脈交叉點(diǎn)作為分析的標(biāo)志點(diǎn)，使用tpsDig2 V.2.31 軟件[14]對(duì)標(biāo)志點(diǎn)進(jìn)行數(shù)字化處理，將翅脈上的標(biāo)志點(diǎn)轉(zhuǎn)換為方便計(jì)算的數(shù)字化坐標(biāo)。每個(gè)翅膀由同一人間隔24 h 用軟件數(shù)字化處理3 次，然后取3 次數(shù)字化坐標(biāo)的平均值作為用于統(tǒng)計(jì)分析的坐標(biāo)值，以減少測(cè)量所帶來(lái)的誤差。7 種嗜尸性蠅類的右翅形狀特征和17 個(gè)標(biāo)志點(diǎn)見(jiàn)圖1。每只用于實(shí)驗(yàn)的蠅類被放入帶有75%乙醇溶液的微量離心管中單獨(dú)編號(hào)保存于本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本庫(kù)。

圖1 7種嗜尸性蠅類的右翅形狀特征和17個(gè)翅脈交叉的標(biāo)志點(diǎn)Fig.1 Morphological characteristics of the right wing of 7 sarcosaprophagous flies and the 17 intersections of wing veins as the landmarks

圖像數(shù)字化處理后的tps 文件被加載到MorphoJ V1.06 軟件[15]上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，然后使用Procrustes 擬合函數(shù)對(duì)所有樣本的原始坐標(biāo)進(jìn)行疊加處理，以消除因坐標(biāo)的比例、位置和方向不同而產(chǎn)生的誤差。經(jīng)Procrustes 分析后得到Procrustes 坐標(biāo)和質(zhì)心大小，用于對(duì)翅脈異速生長(zhǎng)效應(yīng)的評(píng)估。

1.3 異速生長(zhǎng)影響分析

由于翅膀的大小會(huì)影響其形狀變化（異速生長(zhǎng)效應(yīng)），因此，在進(jìn)行形狀變化分析之前，對(duì)異速生長(zhǎng)效應(yīng)的評(píng)估是重要的一步[13]。選擇MorphoJ V1.06 軟件中的“Permutation Test”（置換檢驗(yàn)，參數(shù)為10 000 次，以質(zhì)心大小為自變量，以Procrustes 坐標(biāo)為因變量）在種間和種內(nèi)分別進(jìn)行回歸分析，以評(píng)估異速生長(zhǎng)效應(yīng)的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。如果這種異速生長(zhǎng)的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用回歸分析的殘差去除異速生長(zhǎng)的影響，分析翅膀形狀的差異變化[8]。此外，異速生長(zhǎng)對(duì)性別二態(tài)性的影響通過(guò)對(duì)同一物種不同性別的質(zhì)心大小和Procrustes 坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析來(lái)檢驗(yàn)。

1.4 翅脈形狀的圖像數(shù)字化分析

使用MorphoJ V1.06 軟件中基于馬氏距離（Maha?lanobis distances）的典型變量分析（canonical variate analysis，CVA）對(duì)各蠅類之間的翅脈形狀差異進(jìn)行分析。同時(shí)利用該軟件中的置換檢驗(yàn)（參數(shù)設(shè)置為10 000 次）對(duì)翅脈的形狀變化在不同蠅種之間的差異進(jìn)行回歸分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。使用判別函數(shù)分析（discriminant function analysis，DFA）中的交叉驗(yàn)證評(píng)估基于馬氏距離進(jìn)行物種分類的可靠性和準(zhǔn)確性。利用CVA 方法和交叉驗(yàn)證對(duì)7 種嗜尸性蠅類雌性成蟲(chóng)的區(qū)分可靠性進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 異速生長(zhǎng)分析結(jié)果

7種嗜尸性蠅類種內(nèi)的異速生長(zhǎng)分析（表2）表明，醬亞麻蠅、紅尾糞麻蠅、巨尾阿麗蠅以及裸芒綜蠅4個(gè)蠅種異速生長(zhǎng)對(duì)種內(nèi)翅膀形狀變化的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，7 種嗜尸性蠅類種內(nèi)性別之間的異速生長(zhǎng)分析（表2）表明，在醬亞麻蠅、巨尾阿麗蠅以及裸芒綜蠅3 個(gè)蠅種中發(fā)現(xiàn)異速生長(zhǎng)對(duì)性別之間翅膀形狀變化的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表2 7種蠅類物種內(nèi)部和性別之間異速生長(zhǎng)對(duì)翅膀形狀變化的影響Tab.2 The effects of allometric on shape variation of wings in each fly species and between sexes of each species

2.2 物種間翅脈的圖像數(shù)字化分析結(jié)果

在整體物種鑒定的水平上，CVA 中7 種嗜尸性蠅類種間翅膀的形狀變化結(jié)果顯示，前兩個(gè)典型變量（canonical variate，CV）（變量1 和變量2）占據(jù)了翅脈形狀總變異的82.9%（CV1 為70.3%，CV2 為12.6%）（圖2）。CV1 和CV2 的散點(diǎn)圖顯示，除了裸芒綜蠅與其他6 個(gè)物種明顯分開(kāi)外，其他物種之間有較多的重疊區(qū)域，尤其是緋角亞麻蠅、醬亞麻蠅、擬東方辛麻蠅、紅尾糞麻蠅4 種麻蠅。變換網(wǎng)格圖（圖3）顯示，2、3、6、11、12、13、17 標(biāo)志點(diǎn)在CV1 軸可見(jiàn)明顯的形狀變化，2、3、10、11、12、13、14 標(biāo)志點(diǎn)在CV2 軸可見(jiàn)明顯的形狀變化。7 個(gè)物種兩兩之間的馬氏距離（表3）顯示，馬氏距離從7.7（紅尾糞麻蠅和醬亞麻蠅）到34.2（裸芒綜蠅和醬亞麻蠅）。置換檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，在7種嗜尸性蠅類物種間，翅脈的形狀變化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。交叉驗(yàn)證（表4）表明，利用翅脈形狀的數(shù)字化分析可以區(qū)分這7 種常見(jiàn)的嗜尸性蠅類，種類判別準(zhǔn)確率為81.2%～100.0%。

表3 7種嗜尸性蠅類之間CVA分析得出的馬氏距離Tab.3 The Mahalanobis distances among 7 sarcosaprophagous fly species based on CVA

表4 7種嗜尸性蠅類種間交叉驗(yàn)證的準(zhǔn)確率Tab.4 The accuracy of cross-validation test on 7 sarcosaprophagous fly species （%）

圖2 7種嗜尸性蠅類種間典型變量分析結(jié)果散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plot of canonical variate analysis results of 7 sarcosaprophagous fly species

圖3 7種嗜尸性蠅類17個(gè)翅脈標(biāo)志點(diǎn)變換網(wǎng)格圖Fig.3 Transformation grids diagram of 17 wing intersections landmarks on 7 sarcosaprophagous fly species

2.3 雌性物種間翅脈形狀的數(shù)字化分析結(jié)果

在雌性物種鑒定的水平上，7 種嗜尸性蠅類雌性種間翅膀的形狀變化CVA 結(jié)果顯示，前兩個(gè)CVA 占據(jù)了翅脈形狀總變異的84.1%（CV1 為70.0%，CV2 為14.1%）。CV1 和CV2 的散點(diǎn)圖顯示，除了裸芒綜蠅和巨尾阿麗蠅與其他蠅類物種明顯分開(kāi)外，5 個(gè)麻蠅物種之間有較多的重疊區(qū)域。變換網(wǎng)格圖（圖5）顯示，2、3、6、11、12、17 標(biāo)志點(diǎn)沿CV1 軸的形狀變化明顯，2、3、4、6、11、12、13、14 標(biāo)志點(diǎn)沿CV2 軸的形狀變化最明顯。由7 個(gè)蠅類物種雌性翅膀之間的成對(duì)比較中獲得的馬氏距離（表5）顯示，馬氏距離從8.1（擬東方辛麻蠅和醬亞麻蠅）到254.4（裸芒綜蠅和醬亞麻蠅）。置換檢驗(yàn)顯示，翅脈的形狀變化在7 種嗜尸性蠅類雌性種間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。交叉驗(yàn)證（表6）表明，利用翅脈形狀的數(shù)字化分析可以區(qū)分這7 種常見(jiàn)的雌性嗜尸性蠅類，種類判別準(zhǔn)確率為75.0%～100.0%。

圖4 7種嗜尸性蠅類雌性種間典型變量分析結(jié)果散點(diǎn)圖Fig.4 Scatter plot of canonical variate analysis results of 7 sarcosaprophagous female fly species

圖5 7種雌性嗜尸性蠅類17個(gè)翅膀標(biāo)志點(diǎn)變換網(wǎng)格圖Fig.5 Transformation grids diagram of 17 wing intersections landmarks on 7 sarcosaprophagous female fly species

表5 7種嗜尸性蠅類雌性之間CVA分析得出的馬氏距離Tab.5 The Mahalanobis distances among 7 sarcosaprophagous female fly species based on CVA

表6 7種嗜尸性蠅類雌性種間交叉驗(yàn)證的準(zhǔn)確率Tab.6 The accuracy of cross-validation test on 7 sarcosaprophagous female fly species （%）

3 討論

準(zhǔn)確、快速的種類鑒定是利用嗜尸性蠅類進(jìn)行PMI推斷的關(guān)鍵步驟之一。近年來(lái)，翅脈形狀特征的圖像數(shù)字化分析已成為鑒別一些雙翅目昆蟲(chóng)的一種簡(jiǎn)便、可靠的方法，通過(guò)對(duì)較為完整的昆蟲(chóng)翅膀進(jìn)行圖像訓(xùn)練和數(shù)字化特征分析，能獲得較為準(zhǔn)確的種類鑒定結(jié)果[10-11，15-16]。然而，在形態(tài)測(cè)量學(xué)研究中，對(duì)異速生長(zhǎng)效應(yīng)的估計(jì)是任何形態(tài)特征分析中必不可少的一步，有研究已證明異速生長(zhǎng)效應(yīng)可能會(huì)對(duì)物種分類的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響[13，17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，醬亞麻蠅、紅尾糞麻蠅、巨尾阿麗蠅以及裸芒綜蠅4 個(gè)蠅種異速生長(zhǎng)對(duì)種內(nèi)翅膀形狀變化的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，醬亞麻蠅、巨尾阿麗蠅以及裸芒綜蠅3 個(gè)蠅種異速生長(zhǎng)對(duì)種內(nèi)性別之間翅膀形狀變化的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在本研究中，CVA 和交叉判別實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都表明，利用翅脈的圖像數(shù)字化分析可以區(qū)分這7 種常見(jiàn)的嗜尸性蠅類，與既往應(yīng)用昆蟲(chóng)翅脈的形態(tài)特征進(jìn)行種類鑒定研究的結(jié)果[11-12]相似，7 種嗜尸性蠅類物種間的交叉驗(yàn)證得到了較高的種類鑒定準(zhǔn)確率（81.2%～100.0%）。此外，有研究結(jié)果[19]表明，在腐敗的尸體上，雌性嗜尸性蠅類比雄性的數(shù)量更多，在腐敗尸體現(xiàn)場(chǎng)，捕獲雌性嗜尸性蠅類的概率較大，因此，準(zhǔn)確鑒別雌性嗜尸性蠅類的種類對(duì)于法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)來(lái)說(shuō)是非常重要的。然而，大多數(shù)成年雌性嗜尸性蠅類在外觀上極為相似，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定一般也是基于雄性外部生殖器的形態(tài)進(jìn)行鑒定，雌性的鑒別要點(diǎn)比較少見(jiàn)，使得雌性嗜尸性蠅類的種類鑒定成了一個(gè)較為困難的問(wèn)題。在本研究中，單獨(dú)利用翅脈形狀的數(shù)字化分析對(duì)這7 種嗜尸性蠅類的雌性成蟲(chóng)進(jìn)行了種類鑒定評(píng)估，發(fā)現(xiàn)利用翅脈的形狀變化可以區(qū)分這7 種雌性嗜尸性蠅類，種類判別準(zhǔn)確率為75.0%～100.0%。因此，基于翅脈形狀的圖像數(shù)字化分析可以對(duì)這7 種常見(jiàn)嗜尸性蠅類進(jìn)行物種鑒定，具有簡(jiǎn)便、快捷、低成本等優(yōu)勢(shì)。然而，利用翅膀形狀變化分析的方法進(jìn)行昆蟲(chóng)種類鑒定時(shí)應(yīng)注意，該方法目前仍然處于理論研究中，其可靠性和準(zhǔn)確性還需要在更多物種和樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。因此，為了更準(zhǔn)確地鑒定物種，對(duì)于一些判別準(zhǔn)確率低于90%的麻蠅種類鑒定，建議將翅膀形狀變化分析方法與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定或DNA 鑒定聯(lián)合使用以提高種類鑒定的準(zhǔn)確率[13]。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)7 種常見(jiàn)嗜尸性蠅類種間以及雌性種間翅脈圖像進(jìn)行數(shù)字化處理和形狀特征分析，發(fā)現(xiàn)基于翅脈圖像的數(shù)字化分析可以用于這7 種常見(jiàn)嗜尸性蠅類種間以及雌性種間的種類鑒別?；诔崦}圖像的數(shù)字化分析可以成為一種嗜尸性蠅類種類鑒定研究的新思路，在未來(lái)的研究中，將增加樣本量，使用翅脈圖像的數(shù)字化分析方法對(duì)更多的嗜尸性蠅類物種進(jìn)行種類鑒別研究，為實(shí)現(xiàn)更為快速、簡(jiǎn)單的嗜尸性蠅類種類鑒定，提高其在實(shí)際案件中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。