藍棋浩，余軍軍，寧 軍，韋 田，陳秋月

(溫氏食品集團有限公司，廣東 云浮 527400)

0 引言

喹乙醇又名培育諾、快育靈，是一種化學合成的飼料添加劑，具有促進蛋白同化，提高飼料轉(zhuǎn)化率，加速生長，增加經(jīng)濟效益等作用；同時擁有廣譜抗菌效果，所以廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)品養(yǎng)殖。經(jīng)研究表明，喹乙醇會在體內(nèi)存積，對大多數(shù)動物有明顯的致畸作用。因此，大多數(shù)國家都禁止在畜禽與水產(chǎn)品養(yǎng)殖中使用該藥，同時在《中國獸藥典》(2005版)也有明確規(guī)定，喹乙醇被禁止用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖[1]。

喹乙醇在體內(nèi)不穩(wěn)定，能快速代謝成幾種物質(zhì)，其中3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)在體內(nèi)相對穩(wěn)定，被公認為喹乙醇代謝殘留標識物[2-3]。MQCA的檢測方法已有很多文獻報道，其中最常用的提取與檢測是采用酶解衍生，固相萃取柱凈化。該方法存在前處理操作復(fù)雜、回收率低、檢出限高，不利于大批量檢測。通過研究對比，本實驗采用2%偏磷酸甲醇(4:1)溶液酸化提取[4]，采用固相萃取柱凈化，基質(zhì)干擾很少，同時回收率在75.4%～105%，檢出限達到0.1 μg/kg，大大節(jié)省了檢測時間，提高了工作效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(ABSCIEX-QTRAP 5500)、電子天平(JJ200)、高速冷凍離心機(Eppendorf-5804R)、純水機(Rephile-RS2200QSS)、氮吹儀(LabTech-MV5)、多功能振蕩儀(IKA-KS501)、超聲機(JP-100)、OasisMAX固相萃取柱(150 mg/6 mL，Waters公司)。

3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)(Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度99.24%，批號G1012840)；3-甲基喹噁啉-2-羧酸-D4(MQCA-D4)(CATO公司，純度99.7%，批號B9360028)。

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，氨水和偏磷酸均為分析純。

1.2 試劑配置

1.2.1 標準儲備液配置

精確稱取10 mg MQCA標準品用甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 mg/mL MQCA標準儲備液。

1.2.2 內(nèi)標儲備液配置

精確稱取10 mg MQCA-D4標準品用甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 mg/mL MQCA-D4標準儲備液，于-20℃下避光保存。

1.2.3 2%偏磷酸甲醇溶液

準確稱取20 g偏磷酸到容量瓶中，用超純水定容至1 000 mL，搖勻后2% 偏磷酸與甲醇體積比4:1混勻至燒杯中，即得2%偏磷酸甲醇溶液。

1.2.4 1 mmol/L氨水-甲醇(體積比4:1)溶液

在200 mL水中加入15 μL的濃氨水，混合均勻即得1 mmol/L氨水溶液，再加入50 mL甲醇混勻，即得1 mmol/L氨水-甲醇混合液。

1.2.5 2%甲酸乙酸乙酯溶液

150 mL乙酸乙酯中加入4 mL甲酸，再加乙酸乙酯稀釋到200 mL。

1.3 試驗方法與結(jié)果

1.3.1 樣品前處理

稱取5 g(精確至0.01 g)均質(zhì)樣品置于50 mL離心管中，加入8 mL 2%偏磷酸-甲醇提取液，渦旋振蕩1 min，超聲10 min，水平振蕩10 min，9 000 r/min離心5 min，將上清液移入50 mL離心管中，殘渣加入8 mL 2%偏磷酸-甲醇提取液重復(fù)提取，合并2次提取液，10 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液置50 mL離心管，上清液備用。

固相萃取柱依次用5 mL甲醇和5 mL水活化，上清液全部過萃取柱。依次用5 mL水、5 mL 1 mmol/L氨水-甲醇(4:1)溶液、5 mL甲醇淋洗，抽干1 min，用5 mL 2%甲酸乙酸乙酯洗脫，氮氣45℃吹干，加入1 mL 0.1%甲酸水：甲醇(9：1，v/v)溶解，漩渦混勻后，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，上機測定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters公司XBridge C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)，流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為甲醇，流速為0.3 mL/min；梯度洗脫程序見表1；柱溫40℃，進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

1.3.3 質(zhì)譜條件

通過MRM模式，在電噴霧離子源正離子檢測模式下進行掃描，分別對MQCA和MQCA-D4進行優(yōu)化，參照藥物的信噪比優(yōu)化最佳去簇電壓和碰撞能量，獲得最佳優(yōu)化條件。源溫：550℃，電噴霧電壓：5 500 V，碰撞氣：Low，氣簾氣：35 psi，輔助氣1：50 psi，輔助氣2：50 psi。質(zhì)譜條件見表2，MQCA色譜圖見圖1、圖2。

表2 其他質(zhì)譜參數(shù)匯總表

圖1空白雞肉色譜圖

圖2空白雞肉中MQCA添加濃度為1ng/kg的色譜圖

1.3.4 線性方程與檢出限

分別配置標準溶液，質(zhì)量濃度分別為：0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL，內(nèi)標濃度為5 ng/mL進行分析，標準溶液在0.1～20 ng/mL范圍內(nèi)線性范圍良好，標準曲線線性方程為Y=0.247 10X-0.010 49(r=0.999 3)。

以加標樣本中待測化合物色譜峰的信噪比(S/N)大于或等于3對應(yīng)的濃度確定方法檢出限，當濃度為0.5 ng/mL時，信噪比S/N=97.7，滿足要求，故本方法的檢出低限為0.1 μg/kg，比國家標準方法中的0.5 μg/kg提高5倍，證明了本方法靈敏度高。

1.3.5 回收率試驗及精密度

取空白樣品，通過加入不同濃度的標準溶液，使其空白添加濃度為0.5 μg/kg、1 μg/kg、2 μg/kg，分別測度其回收率，實驗表明，在0.5～2 μg/kg范圍內(nèi)，動物源性食品中MQCA的回收率在75%～105%，批間與批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%?；厥章始熬芏纫姳?。

2 分析與討論

2.1 提取方式的優(yōu)化

由于喹乙醇代謝物在體內(nèi)是與蛋白質(zhì)通過結(jié)合狀態(tài)存在的，首先要將喹乙醇代謝物從組織中游離出來。目前文獻報道常用的方法有酸解法、堿解法和酶解法[1-7]，并且MQCA有弱酸性，因此偏磷酸溶液能將其游離出來。本實驗通過偏磷酸+甲醇[3]混合溶液能使樣品中MQCA充分提取出來，再結(jié)合超聲、振蕩，能將其提取效率最大化。

2.2 凈化方式的優(yōu)化

通常凈化方式有2種，一種是通過有機溶劑提取和氮氣吹干濃縮；另一種是采用固相萃取柱凈化濃縮。筆者曾嘗試在提取液中加入乙酸乙酯進行萃取[4]，再將有機層氮氣吹干，但是基質(zhì)干擾嚴重，特別是在豬肝中會出現(xiàn)一個干擾雜鋒與目標峰重疊，而且目標峰響應(yīng)低，無法達到要求，故采用固相萃取法進行凈化。

表3 動物源性食品中三種加標濃度回收率及精密度

2.3 固相萃取柱的選擇

目前國家標準中均采用混合型陰離子交換固相萃取柱(MAX柱)凈化，該萃取小柱能從復(fù)雜的樣品中提取出酸性化合物保留在柱內(nèi)，通過酸性有機相溶液洗脫出來，同時該柱pH最佳應(yīng)用范圍在2～8。筆者曾對比過提取液分別為：0.3 mol/L鹽酸溶液和2%偏磷酸甲醇混合液提取樣品，測試其pH值分別為0.2和2.6，經(jīng)過MAX小柱凈化，濃縮復(fù)溶上機測定對比，當提取液為0.3 mol/L鹽酸溶液時，回收率為40%～60%；當提取液為2%偏磷酸甲醇混合液時，回收率為75%～98%。因此提取液使用2%偏磷酸甲醇混合液最佳，同時提取液有16 mL，故MAX柱采用高通量的規(guī)格(150 mg/6 mL)，避免出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象。

3 結(jié)論

本方法建立了畜禽產(chǎn)品中喹乙醇代謝物(MQCA)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。樣品經(jīng)過酸化提取、凈化，有效地消除了基質(zhì)干擾，方法具有較高的靈敏度，以MQCA-D4作為內(nèi)標，提高了定量準確性。經(jīng)過驗證，一系列濃度的基質(zhì)標準溶液(0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL)的標準曲線相關(guān)系數(shù)r≥0.999；方法檢測低限為0.1 μg/kg；在0.5～2 μg/kg添加水平回收率75%～105%，批內(nèi)與批間變異系數(shù)均小于10%。通過回收率和多種食品樣品檢測表明，該方法前處理簡單、便捷，靈敏度高，相比國標GB/T 20746-2006和SNT0197-2014具有靈敏度、回收率高、耗時短等特點，適用于畜禽產(chǎn)品中喹乙醇代謝物3-甲基喹噁啉-2-羧酸殘留的檢測。