李寧潔，郭佳敏，趙云蛟，劉 銳,*，張 民，吳 濤，隋文杰

（1.天津科技大學(xué)，省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；3.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384）

秋葵（Abelmoschus esculentusL.Moench）也稱為黃秋葵、咖啡黃葵，屬于錦葵科草本植物，富含蛋白質(zhì)、油脂、生物堿、多酚類化合物及微量元素，素有“蔬菜之王”的美譽(yù)[1]，具有降血糖、降血脂、抗氧化、減輕抑郁、抗菌、抗癌等多種生理功能[2-6]。

秋葵主要以嫩果莢入菜，對(duì)其種子的食用價(jià)值尚未開展深入的研究。秋葵籽富含脂肪、蛋白質(zhì)、多糖、多酚和黃酮等營養(yǎng)素，其主要成分的開發(fā)與利用逐漸引起重視[7]。田科魏[8]優(yōu)化確定了超臨界二氧化碳法是提取黃秋葵籽中油脂的最佳工藝，也是高品質(zhì)秋葵籽油生產(chǎn)的首選工藝；李加興等[9]采用堿提酸沉法提取秋葵籽中蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在最優(yōu)工藝條件下提取率可達(dá)72.3%。然而，目前秋葵籽的加工利用還集中在其油脂的提取、精煉及蛋白質(zhì)的提取工藝等方面，對(duì)秋葵籽多糖的提取及研究的報(bào)道較少。

多糖的提取方法有熱水提取、超聲波輔助提取[10]、微波輔助提取[11]和酶輔助提取[12]等。雖然微波輔助提取的多糖比熱水浸提的多糖表現(xiàn)出更高的抗氧化活性，但在提取的過程中可能導(dǎo)致多糖降解[13]；酶或超聲波處理同樣可能引起多糖降解，影響多糖的生物活性[14]。熱水浸提法是提取多糖的常用方法，具有經(jīng)濟(jì)、設(shè)備簡單、易于操作等優(yōu)點(diǎn)。綜合考慮，本文以秋葵籽為原料，通過單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了秋葵籽多糖的熱水浸提工藝參數(shù)，以期得到一種高效、經(jīng)濟(jì)的提取方法，為秋葵籽資源的實(shí)際開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秋葵籽，購自于安徽省毫州市中藥材國強(qiáng)藥業(yè)。葡萄糖、濃硫酸、苯酚、石油醚、三氯甲烷、正丁醇、酒石酸鉀鈉、無水亞硫酸鈉、氫氧化鈉等，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

K9840 全自動(dòng)凱氏定氮儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司；SQP 分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠；水浴磁力攪拌器，XMTD-204，天津市歐諾儀器儀表有限公司；高效液相色譜儀，LC-20AT，日本島津公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，DH-101，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)室電爐有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，TU-1810PC，北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 秋葵籽多糖提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)

秋葵籽經(jīng)清洗、干燥后，使用粉碎機(jī)粉碎至60 目。通過索式抽提器對(duì)其進(jìn)行脫脂處理6 h，自然干燥得脫脂秋葵籽粉。通過單因素實(shí)驗(yàn)分別考察提取溫度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)秋葵籽多糖提取得率的影響。

（1）提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響

提取溫度分別設(shè)置為40、50、60、70、80 ℃，按料液比1∶8（g/mL）加入蒸餾水，提取時(shí)間為2 h，反復(fù)提取3次，3 500 r/min 離心5 min，合并上清液，50 ℃旋蒸濃縮至原體積的四分之一，測(cè)定樣品中的總糖含量，研究提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響。

（2）料液比對(duì)多糖提取得率的影響

提取溫度設(shè)定為60 ℃，料液比分別選擇1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g/mL），其他同（1）。

（3）提取時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響

提取溫度設(shè)定為60 ℃，料液比1∶6（g/mL），提取時(shí)間分別選擇為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，其他同（1）。

（4）提取次數(shù)對(duì)多糖提取得率的影響

提取溫度設(shè)定為60 ℃，料液比1∶6（g/mL），提取次數(shù)分別選擇1、2、3、4、5 次，其他同（1）。

1.3.2 Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken 中心組合設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法，研究提取時(shí)間、提取溫度、料液比對(duì)多糖提取得率的影響，優(yōu)化秋葵籽多糖的最佳提取工藝。Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1 所示。

表1 Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)因素和水平表Table 1 The factors and levels of Box-Benhnken experiment design

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

水分含量參照GB 5009.3—2016 國標(biāo)法測(cè)定[15]；蛋白質(zhì)含量參照GB 5009.5—2016 國標(biāo)法測(cè)定[16]；脂肪含量參照GB5009.6—2016 國標(biāo)法測(cè)定[17]；灰分含量參照GB5009.4—2016 國標(biāo)法測(cè)定[18]；淀粉含量參照GB 5009.9—2016 國標(biāo)法測(cè)定[19]；膳食纖維含量參照GB 5009.88—2014 國標(biāo)法[20]和megazyme assay kit K-RINTDF 10/15 方法測(cè)定。所有數(shù)據(jù)均做3 次平行。

采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量[21]。配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10、20、40、60、80、100 mg/L，分別吸取1 mL 于20 mL 具塞試管中，再加入6%苯酚溶液1.0 mL，再迅速加入5.0 mL 濃硫酸，室溫下放置10 min，漩渦振蕩充分混勻，再置于30 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min，于490 nm 處測(cè)其吸光度。秋葵籽多糖提取得率計(jì)算公式如式（1）所示。

式中，y為秋葵籽多糖提取得率，%；C為溶液中秋葵籽多糖的濃度，mg/mL；V為秋葵籽多糖溶液體積，mL；N為多糖溶液稀釋倍數(shù)；m為秋葵籽質(zhì)量，g。

1.5 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert 10 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋葵籽基本成分

秋葵籽的基本成分如表2 所示。秋葵籽中膳食纖維、蛋白質(zhì)和脂肪含量占主要部分，蛋白質(zhì)含量為38.00%，脂肪含量為14.14%，膳食纖維含量為37.67%，其中可溶性膳食纖維含量為5.10%，不溶性膳食纖維含量為32.56%，這與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[22]。

表2 秋葵籽基本成分Table 2 Proximal composition of okra seed flour

2.2 秋葵籽多糖最佳提取工藝的確定

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

（1）提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響

溫度對(duì)秋葵籽多糖提取得率的影響見圖1。由圖可知，隨著溫度的升高，多糖提取得率先升高后下降。溫度低于60 ℃時(shí)，有利于秋葵籽多糖充分溶解，多糖提取得率逐漸增大；溫度60 ℃時(shí)，多糖提取得率最大，為6.11%。當(dāng)提取溫度高于60 ℃時(shí)，多糖提取得率開始下降，可能是由于較高的溫度破壞了多糖結(jié)構(gòu)[23]。因此，綜合考慮盡可能保留多糖的結(jié)構(gòu)與活性，選用40、50、60 ℃進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖1 提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響Fig.1 Effects of extraction temperature on the extraction yield of okra seed polysaccharides

（2）料液比對(duì)多糖提取得率的影響

料液比對(duì)秋葵籽多糖提取得率的影響見圖2。由圖可知，多糖提取得率隨著料液比的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶4 時(shí)，多糖無法充分溶于水中，導(dǎo)致提取得率低；當(dāng)料液比為1∶6 和1∶8 時(shí)，多糖得率顯著提高，分別為5.04%和5.00%，兩者差異不顯著；當(dāng)料液比為1∶10 和1∶12 時(shí)，提取得率下降趨勢(shì)明顯，且造成資源的浪費(fèi)，所以料液比為1∶8 較合適。綜合考慮，選用1∶6、1∶8、1∶10 三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖2 料液比對(duì)多糖提取得率的影響Fig.2 Effects of solid/liquid ratio on the extraction yield of okra seed polysaccharides

（3）提取時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響

提取時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響見圖3。由圖可知，多糖提取得率隨著提取時(shí)間的增加而逐漸增加，當(dāng)提取時(shí)間為1.5～2.5 h 時(shí)，多糖基本全部溶出，曲線趨于平緩。故提取2.0 h 較適宜。綜合考慮，選用1.0、2.0、3.0 h 三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響Fig.3 Effects of extraction time on the extraction yield of okra seed polysaccharides

（4）提取次數(shù)對(duì)多糖提取得率的影響

提取次數(shù)對(duì)多糖提取得率的影響見圖4。由圖可知，多糖得率隨提取次數(shù)的增加而逐漸增加。提取3 次后多糖基本完全溶出，繼續(xù)增加提取次數(shù)，多糖提取得率無顯著性增加。因此，提取次數(shù)選為3 次。

圖4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取得率的影響Fig.4 Effects of extraction number on the extraction yield of okra seed polysaccharides

2.2.2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)

由表3 和表4（見下頁）可知，模型顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P≥0.05），說明模型建立成功，可用該模型對(duì)真實(shí)情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。響應(yīng)值的變異系數(shù)CV為2.99%，說明該實(shí)驗(yàn)操作可信度高。提取時(shí)間對(duì)多糖提取得率影響不顯著（P≥0.05），提取溫度對(duì)多糖提取得率影響顯著（P＜0.05），料液比對(duì)多糖提取得率影響極顯著（P＜0.01）；得到回歸方程如下所示：

表4 多糖提取響應(yīng)面優(yōu)化的方差分析Table 4 Variance analysis of response surface optimization for extraction of okra seed polysaccharides

表3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取秋葵籽多糖的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface methodology for optimizing extraction of okra seed polysaccharides

各個(gè)因素之間對(duì)多糖提取得率的曲線圖和等高線圖如圖5、6、7（見下頁）所示。

圖5 提取溫度和時(shí)間對(duì)多糖提取得率影響的曲面圖和3D 圖Fig.5 Response surface plots and 3D charts of the effects of temperature and time on polysaccharide extraction

圖6 提取時(shí)間和料液比對(duì)多糖提取得率影響的曲面圖和3D 圖Fig.6 Response surface plots and 3D charts of the effecs of extraction time and material-liquid ratio on polysaccharide extraction

圖7 提取溫度和料液比對(duì)多糖提取得率影響的曲面圖和3D 圖Fig.7 Response surface plots and 3D charts of the effecs of extraction temperature and material-liquid ratio on polysaccharide extraction

通過回歸分析，得到秋葵籽多糖理論最佳提取工藝條件為提取時(shí)間為2.32 h，提取溫度51.63 ℃，料液比為1∶10（g/mL），多糖提取得率最高為6.30%。考慮實(shí)際操作的便利，修正秋葵籽多糖的最佳提取條件為提取時(shí)間2.3 h，提取溫度52 ℃，料液比1∶10（g/mL），進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出多糖提取得率為6.25%，與模型預(yù)測(cè)值接近。

3 結(jié)論

本研究根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)以及料液比分析，應(yīng)用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定秋葵籽多糖的最佳提取工藝為提取時(shí)間2.3 h，提取溫度52 ℃，料液比1∶10（g/mL）。在此條件下，秋葵籽多糖得率為6.25%，與模型預(yù)測(cè)值接近。該研究可為秋葵籽精深加工提供參考依據(jù)。