張凡，曹方，陳亞茹，蔣蘇，王博雅，陳高風(fēng)，楊艷，喻崢嶸

艾美探索者生命科學(xué)研發(fā)有限公司，上海 201109

肺炎鏈球菌性疾病（pneumococcal disease，PD）是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。肺炎鏈球菌是引起獲得性肺炎（community-acquiredpneumonia，CAP）的重要病原菌之一，也是引起兒童肺炎、腦膜炎、菌血癥、急性中耳炎和鼻竇炎等嚴(yán)重疾病的主要病原菌。隨著抗生素的廣泛使用，抗生素耐藥菌株不斷增加，廣泛使用肺炎鏈球菌多糖結(jié)合疫苗可通過影響抗生素耐藥肺炎鏈球菌的產(chǎn)生機(jī)制，從而減少出現(xiàn)耐藥菌株。肺炎鏈球菌疫苗是預(yù)防肺炎鏈球菌感染的最有效手段，目前應(yīng)用最為廣泛的是23價(jià)肺炎鏈球菌多糖疫苗和7、10、13價(jià)肺炎鏈球菌多糖結(jié)合疫苗［1］。多糖結(jié)合疫苗是在多糖抗原上結(jié)合了載體蛋白，從而提高了多糖抗原的免疫原性，解決了多糖疫苗不能有效應(yīng)用于幼兒或兒童的問題［2］。

肺炎鏈球菌多糖疫苗和多糖蛋白結(jié)合疫苗的質(zhì)量有賴于莢膜多糖的純度、抗原活性和穩(wěn)定性等因素，一維核磁共振氫譜（one dimensional nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum，1H-NMR）能夠直觀分析肺炎鏈球菌多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)、取代基類型及其位置和數(shù)目，目前已應(yīng)用于肺炎鏈球菌多糖疫苗的檢定［3-4］，而多糖結(jié)合疫苗的在降解、活化、衍生及結(jié)合過程中的多糖結(jié)構(gòu)變化尚無有效的檢測方法［5］，因此，本研究將1H-NMR應(yīng)用于肺炎鏈球菌多糖結(jié)合疫苗的檢定，以期對上述指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 菌株及載體蛋白9V、14、6A、11A型肺炎鏈球菌及破傷風(fēng)類毒素（tetanus toxoid，TT）載體蛋白均由艾美探索者生命科學(xué)研發(fā)有限公司提供。

1.2 主要試劑及儀器 肺炎鏈球菌多糖標(biāo)準(zhǔn)品購自美國ATCC；氯化鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯（1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate，CDAP）、溴化氰（cyanogenbromide，CNBr）、己二酰肼（adipicdihydrazide，ADH）及1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽［1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDAC］均購自美國Sigma-Aldrich（Shanghai）Trading Co.，Ltd.公司；重水（D2O）購自美國Cambridge Isotope Laboratories，Inc公司；Sepharose 4FF層析介質(zhì)購自格萊賽生命科學(xué)（上海）有限公司；VnmrS DD2 700MHz核磁共振儀購自美國Agilent公司。

1.3 多糖結(jié)合原液的制備 分別將9V、14、6A、11A型肺炎鏈球菌復(fù)蘇后，在肺炎鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，殺菌，去除培養(yǎng)基成分，純化，經(jīng)無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌后，真空抽干獲得精糖［6］。各型肺炎鏈球菌精糖經(jīng)0.2 mol／L氯化鈉溶液溶解后，經(jīng)超聲降解，獲得降解多糖；加入活化劑CDAP或CNBr得到活化多糖；再加入ADH進(jìn)行衍生，經(jīng)超濾得到多糖衍生物；多糖衍生物與TT載體蛋白按1∶（0.8±0.5）比例在EDAC的作用下結(jié)合，反應(yīng)液通過Sepharose 4FF層析柱經(jīng)0.85%的NaCl溶液洗脫，收集V0附近的吸收峰，純化，除菌過濾獲得各型肺炎鏈球菌多糖結(jié)合原液［2-8］。

1.41H-NMR樣品的制備 取1.3項(xiàng)制備的肺炎鏈球菌精糖，用純化水溶解至5 mg／mL，取450 μL，加入50 μL D2O，混勻，即為肺炎鏈球菌多糖1H-NMR樣品；分別取1.3項(xiàng)制備的降解多糖溶液、活化多糖溶液、多糖衍生物溶液及多糖結(jié)合原液450 μL，加入50 μL D2O，混勻，即為肺炎鏈球菌降解多糖、活化多糖、多糖衍生物及多糖結(jié)合原液1H-NMR樣品。

1.51H-NMR檢測數(shù)據(jù)采集及處理 采用VnmrS DD2 700MHz核磁共振儀進(jìn)行檢測。探頭類型：5 mm xyz PFG HCN probe，樣品處理溫度：300 K（約27℃），中心頻率：699.812 MHz，圖譜寬度：14 ppm，采樣時(shí)間：3 s，累加次數(shù)：32，弛豫時(shí)間（d1）：10 s，處理軟件：vnmrJ&Mnova。用10% D2O鎖場，以半重水（HDO）峰對樣品化學(xué)位移進(jìn)行校正。

1.6 樣品1H-NMR結(jié)構(gòu)鑒定 將獲得的1H-NMR圖譜用MestRenova軟件進(jìn)行分析歸屬，將肺炎鏈球菌多糖與標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜進(jìn)行比較，確定結(jié)構(gòu)是否一致。將肺炎鏈球菌多糖、降解多糖、活化多糖、多糖衍生物和多糖結(jié)合原液的圖譜進(jìn)行比較，確定肺炎鏈球菌多糖在降解、活化、衍生及結(jié)合過程中的結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié)果

2.1 9V型肺炎鏈球菌的1H-NMR結(jié)構(gòu)9V型肺炎鏈球菌降解多糖、活化多糖、多糖衍生物與肺炎球鏈菌多糖標(biāo)準(zhǔn)品指紋區(qū)結(jié)構(gòu)一致，多糖結(jié)合原液多糖指紋區(qū)信號不清晰。HDO化學(xué)位移為4.6 ppm，5.38、5.30、5.06、4.82 ppm分別為α-Glc H1、α-Gal H1、α-GlcA H1、β-ManNAc H1的信號；2.12、2.05 ppm分別為OAc、NAc的信號；3.13 ppm為雜質(zhì)C多糖的磷脂酰膽堿甲基信號?；罨嗵?.96 ppm為殘留溶劑乙腈（CH3CN）的甲基信號。9V型肺炎鏈球菌多糖在衍生過程中引入了ADH，2.20、1.51 ppm為ADH亞甲基信號。見圖1。

圖1 9V型肺炎球菌多糖結(jié)合原液（A）、多糖衍生物（B）、活化多糖（C）、降解多糖（D）、精制多糖（E）、標(biāo)準(zhǔn)品（F）的1H-NMR圖譜Fig.1 1H-NMR spectra of bulk of polysaccharide conjugate（A），polysaccharide derivative（B），activated polysaccharide（C），degraded polysaccharide（D），purified polysaccharide（E）and standard polysaccharide（F）of type 9V pneumococcus

2.2 14型肺炎鏈球菌的1H-NMR結(jié)構(gòu)14型肺炎球菌降解多糖、活化多糖、多糖衍生物與肺炎鏈球鏈菌多糖標(biāo)準(zhǔn)品指紋區(qū)結(jié)構(gòu)一致，多糖結(jié)合原液多糖指紋區(qū)信號不清晰。HDO化學(xué)位移為4.6 ppm，4.45、4.34 ppm分別為β-Gal H1和側(cè)鏈β-Gal H1信號；1.93 ppm為NAc信號；3.13 ppm為雜質(zhì)C多糖的磷脂酰膽堿甲基信號。活化多糖1.96 ppm為殘留溶劑CH3CN的甲基信號。14型肺炎鏈球菌多糖在衍生過程中引入了ADH，2.14、1.51 ppm為ADH亞甲基信號。見圖2。

圖2 14型肺炎球菌多糖結(jié)合原液（A）、多糖衍生物（B）、活化多糖（C）、降解多糖（D）、精制多糖（E）、標(biāo)準(zhǔn)品（F）的1H-NMR圖譜Fig.2 1H-NMR spectra of bulk of polysaccharide conjugate（A），polysaccharide derivative（B），activated polysaccharide（C），degraded polysaccharide（D），purified polysaccharide（E）and standard polysaccharide（F）of type 14 pneumococcus

2.3 6A型肺炎鏈球菌的1H-NMR結(jié)構(gòu)6A型肺炎鏈球菌降解多糖、活化多糖、多糖衍生物及多糖結(jié)合原液指紋區(qū)結(jié)構(gòu)與6A型肺炎鏈球菌多糖標(biāo)準(zhǔn)品指紋區(qū)結(jié)構(gòu)一致。HDO化學(xué)位移為4.6 ppm，5.51、5.02、4.93 ppm分別為α-Gal H1、α-Glc H1、α-Rha H1信號。活化多糖7.91、6.78 ppm為4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）吡啶環(huán)質(zhì)子信號，證明CDAP的降解產(chǎn)物DMAP引入了6A型肺炎鏈球菌多糖；1.97 ppm為活化多糖中殘留溶劑CH3CN的甲基信號。多糖衍生物引入了ADH，2.10、1.50 ppm為ADH亞甲基信號。見圖3。

圖3 6A型肺炎球菌多糖結(jié)合原液（A）、多糖衍生物（B）、活化多糖（C）、降解多糖（D）、精制多糖（E）、標(biāo)準(zhǔn)品（F）的1H-NMR圖譜Fig.3 1H-NMR spectra of bulk of polysaccharide conjugate（A），polysaccharide derivative（B），activated polysaccharide（C），degraded polysaccharide（D），purified polysaccharide（E）and standard polysaccharide（F）of type 6A pneumococcus

2.4 11A型肺炎鏈球菌的1H-NMR結(jié)構(gòu)11A型肺炎鏈球菌降解多糖、活化多糖、多糖衍生物指紋區(qū)結(jié)構(gòu)與11A型肺炎球菌多糖標(biāo)準(zhǔn)品指紋區(qū)結(jié)構(gòu)一致，多糖結(jié)合原液多糖指紋區(qū)信號不清晰。HDO化學(xué)位移為4.6 ppm，5.15、5.04ppm分別為α-GalH1、α-GlcH1信號，2.15ppm為OAc信號?；罨嗵?.91、6.78 ppm為DMAP吡啶環(huán)質(zhì)子信號，證明CDAP的降解產(chǎn)物DMAP引入了11A型肺炎鏈球菌多糖；1.97 ppm為活化多糖中殘留溶劑CH3CN的甲基信號。多糖衍生物引入了ADH，2.10、1.50 ppm為ADH亞甲基信號。見圖4。

圖4 11A型肺炎球菌多糖結(jié)合原液（A）、多糖衍生物（B）、活化多糖（C）、降解多糖（D）、精制多糖（E）、標(biāo)準(zhǔn)品（F）的1H-NMR圖譜Fig.4 1H-NMR spectra of bulk of polysaccharide conjugate（A），polysaccharide derivative（B），activated polysaccharide（C），degraded polysaccharide（D），purified polysaccharide（E）and standard polysaccharide（F）of type 11A pneumococcus

3 討論

端基質(zhì)子區(qū)（5.80～4.40 ppm）信號含豐富的多糖結(jié)構(gòu)信息（如重復(fù)單位單糖的個數(shù)、糖苷鍵的構(gòu)型和糖苷鍵的位置等），與其他信號區(qū)比較，端基質(zhì)子區(qū)信號的分辨率最高，因此一般選擇端基質(zhì)子區(qū)作為肺炎球菌莢膜多糖血清型別鑒定的“指紋”鑒定區(qū)［3］。

多糖超聲降解是一個非隨機(jī)性過程，該過程中最大分子中心附近優(yōu)先發(fā)生鏈的剪切作用，超聲降解不改變重復(fù)單元的化學(xué)結(jié)構(gòu)，不會引起多糖空間構(gòu)像的變化，能夠有效保持多糖的生物學(xué)活性［9］，因此降解多糖和多糖的指紋區(qū)結(jié)構(gòu)保持一致。活化多糖樣品中殘留溶劑使活化多糖峰受雜質(zhì)干擾，另外由于活化多糖不穩(wěn)定也會影響檢測。目前多糖活化一般用CNBr或CDAP作為活化劑［10-12］，其中CNBr活化多糖上的羥基后會生成氰酸酯，氰酸酯不穩(wěn)定會水解為氨基甲酸酯，若多糖鄰位存在順式羥基，氰酸酯會發(fā)生重排，生成更穩(wěn)定的亞胺碳酸酯，氰酸酯和亞胺碳酸酯為活化多糖的活性基團(tuán)［13］。9V型活化多糖7.12 ppm可能為亞胺碳酸酯信號，而14型活化多糖在該區(qū)域無信號，可能是由于亞胺碳酸酯與D2O迅速發(fā)生了氫原子交換。另外，氰酸酯不含氫原子，可結(jié)合13C-NMR和15N-NMR圖譜對CNBr活化的多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。CDAP在堿性條件下會水解成DMAP，使活化多糖中引入DMAP環(huán)質(zhì)子峰，證明CDAP活化的多糖結(jié)構(gòu)可能為吡啶異脲結(jié)構(gòu)［14-15］。6A和11A型肺炎鏈球菌多糖衍生物中仍有較小DMAP環(huán)質(zhì)子信號，表明活化多糖在衍生過程中會釋放出DMAP，而6A型多糖結(jié)合原液中未檢測出DMAP環(huán)質(zhì)子信號，與文獻(xiàn)中提到的吡啶異脲結(jié)構(gòu)中的DMAP在結(jié)合過程中才會完全釋放出來的結(jié)論一致［14-15］。

多糖結(jié)合物中TT載體蛋白無重復(fù)結(jié)構(gòu)，無法進(jìn)行對其進(jìn)行表征，TT蛋白質(zhì)子峰混雜在3.5～4.5 ppm區(qū)域，結(jié)合物分子結(jié)構(gòu)翻滾較慢，蛋白質(zhì)較高較寬的峰可能會掩蔽多糖信號峰，使多糖信號峰減弱［16-17］，但6A型肺炎鏈球菌多糖結(jié)合原液多糖指紋區(qū)結(jié)構(gòu)仍有較好的分辨率，且與各型肺炎鏈球菌多糖標(biāo)準(zhǔn)品一致，表明6A型肺炎鏈球菌多糖結(jié)合原液在結(jié)合過程中多糖結(jié)構(gòu)完整性未受到顯著影響，采用1H-NMR對其他型別肺炎球菌多糖結(jié)合原液的結(jié)構(gòu)鑒定有待進(jìn)一步研究［18-19］。

9V、14、6A和11A型肺炎鏈球菌精制多糖、降解多糖、活化多糖、多糖衍生物1H-NMR對比結(jié)果表明，肺炎鏈球菌多糖在降解、活化、衍生過程中結(jié)構(gòu)完整性未受到顯著影響［20-23］，因此，1H-NMR作為一種靈敏度高且快速的檢測方法，可用于肺炎鏈球菌多糖、降解多糖、活化多糖及多糖衍生物的結(jié)構(gòu)完整性及基團(tuán)分析，以便更有效地對疫苗進(jìn)行質(zhì)量控制，且能指導(dǎo)活化、衍生及結(jié)合工藝的優(yōu)化［5，24-25］。另外，還可結(jié)合13C-NMR和15N-NMR圖譜對活化多糖活性基團(tuán)進(jìn)行分析，但對肺炎球菌多糖結(jié)合原液的結(jié)構(gòu)鑒定需進(jìn)一步研究。