汪濤，孫新，蔣佩佳，肖錦仁，李玲，2

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南省中藥現(xiàn)代化實驗室，湖南 長沙 410208

烏頭酸脫羧酶1（aconitate decarboxylase 1，ACOD1，又稱IRG1）是炎癥和感染中免疫代謝的調(diào)節(jié)因，子能夠催化衣康酸的合成。免疫細胞（如巨噬細胞和單核細胞）在病原體感染（如細菌和病毒）、病原體相關(guān)分子模式分子（如LPS）、細胞因子（如腫瘤壞死因子和干擾素）等刺激下被激活，會高表達ACOD1［1］。

研究發(fā)現(xiàn)，ACOD1參與腫瘤、病原菌感染等多種免疫性疾病，激活A(yù)COD1信號可抑制病原菌感染及炎癥反應(yīng)［2-4］。從細胞層面上，在LPS等病原體相關(guān)分子模式分子的刺激下，高表達ACOD1能誘導(dǎo)免疫細胞發(fā)生免疫耐受［2］；此外，高表達ACOD1也能抑制病原菌對免疫細胞的侵染［3］。通過高表達ACOD1，為進一步研究抗菌抗炎等免疫作用提供了思路，但目前對ACOD1的研究較少，從轉(zhuǎn)錄水平上如何激活A(yù)COD1基因的表達，以及ACOD1蛋白的調(diào)控作用、分子功能等均有待進一步探討。因此，ACOD1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因素及ACOD1蛋白的分子功能對于進一步研究免疫細胞的耐受機制、ACOD1的抗炎抗菌活性具有重要意義。

基因的啟動子區(qū)域一般位于基因轉(zhuǎn)錄起始點（transcriptional start site，TSS）上游2 000 bp至下游100 bp［5］。研究基因啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合情況、甲基化位點、單核苷酸多態(tài)性（single nueleotide polymorphism，SNP）位點等，是進一步從轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達的重要手段［6］。因此，本研究通過預(yù)測人ACOD1基因啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、甲基化CpG位點、SNP位點，探討了人ACOD1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因素。此外，通過對人ACOD1基因編碼的蛋白進行GO（Gene onotology）蛋白功能注釋分析及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，進一步探討了人ACOD1蛋白的分子功能，以期為進一步研究人ACOD1基因和蛋白的表達調(diào)控機制及生物功能，及其在炎癥反應(yīng)、病原體感染等復(fù)雜疾病中的調(diào)控機制提供參考。

1 方法

從NCBI數(shù)據(jù)庫（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov；UniProt：https：／／www.uniprot.org／）中獲取人ACOD1基因的基本信息（人ACOD1基因、mRNA及蛋白的GenBank登錄號分別為NC_000013、NM_001258406.2、NP_001245335，UniProtKB登 錄 號 為A6NK06），以TSS上游2 000 bp至下游100 bp為樣本序列，對人ACOD1基因中可能的啟動子序列進行預(yù)測；運用啟動子分析軟件Neural Network Promoter Prediction（NNPP）（http：／／www.fruitfly.org／seq_tools／promoter.html）對人ACOD1基因啟動子序列進行分析［7］；運用PROMO網(wǎng)站（http：／／alggen.lsi.upc.es／cgi-bin／promo_v3／promo／promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3）和Gene-Regulatiion網(wǎng)站中AliBaba 2程序（http：／／generegulation.com／pub／programs／alibaba2／index.html）對人ACOD1基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點進行預(yù)測［8］；運用EMBOSS（https：／／www.ebi.ac.uk／Tools／seqstats／emboss_cpgplot／）、MethPrimer（http：／／www.urogene.org／cgi-bin／methprimer／methprimer.cgi／）和CpG finder（http：／／www.softberry.com／berry.phtml?topic=cpgfinder&group=programs&subgroup=promoter）對人ACOD1基因2 100 bp啟動子區(qū)域甲基化CpG島進行預(yù)測［5］；運用SNP Function Prediction（https：／／manticore.niehs.nih.gov／snpinfo／snpfunc.html）對人ACOD1基因啟動子SNP位點進行預(yù)測［5］；運用Gene Ontology Consortium數(shù)據(jù)集庫（http：／／geneontology.org／）對人ACOD1蛋白進行GO基因本體注釋功能分析［9］；運用STRING數(shù)據(jù)庫（https：／／string-db.org／）對人ACOD1蛋白相互作用關(guān)系進行分析［9］。

2 結(jié)果

2.1 人ACOD1基因基本信息 人ACOD1基因位于13號染色體（13q22.3），全長10 128 bp，含有5個外顯子，mRNA全長2 147 bp。

2.2 人ACOD1基因的啟動子預(yù)測NNPP預(yù)測結(jié)果顯示，人ACOD1基因上游可能存在3個不同的啟動子序列，分別位于212～262、283～333和1 958～2 008 bp處。11 958～2 008 bp區(qū)域預(yù)測得分最高，見表1。

表1 Neural Network Promoter Prediction預(yù)測人ACOD1基因的啟動子Tab.1 Prediction of human ACOD1 gene promoter region by Neural Network Promoter Prediction

2.3 人ACOD1基因轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點分析PROMO數(shù)據(jù)庫對人ACOD1基因5'調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預(yù)測結(jié)果顯示，共獲得78個轉(zhuǎn)錄因子，見圖1。AliBaba2.1聯(lián)合TRANSFAC數(shù)據(jù)庫對人ACOD1基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行預(yù)測，參數(shù)認定為默認值，結(jié)果顯示，獲得65個轉(zhuǎn)錄因子，共201個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，見圖2。共有17個相同的轉(zhuǎn)錄因子，包括YY1、C／EBPalpha、PU.1、AP-1、NF-1、GATA-1、c-Jun、Oct-2.1、GR、TBP、C／EBPbeta、c-Ets-1、ATF、IRF-1、HNF-1C、CTF和NF-kappaB。

圖1 PROMO對人ACOD1基因啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子分析的結(jié)果Fig.1 Analysis of transcription factor of promoter region of human ACOD1 gene by PROMO

圖2 AliBaba2.1程序預(yù)測人ACOD1基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點部分結(jié)果Fig.2 Analysis of partial results of transcription factor binding sites of human ACOD1 gene predicted by AliBaba2.1

2.4 人ACOD1基因啟動子區(qū)域甲基化CpG島及SNP位點預(yù)測EMBOSS、CpG Finder和MethePrimer 3種預(yù)測結(jié)果顯示，人ACOD1基因啟動子區(qū)域均無甲基化CpG島。

SNP Function Prediction對人ACOD1基因啟動子SNP位點的預(yù)測結(jié)果顯示，共預(yù)測得到12個SNP位點，包括rs11618255、rs11620479、rs11620506、rs1-162511、rs12431246、rs12861343、rs485905、rs488689、rs9544516、rs9574069、rs9574070和rs9574071，保守性均很低。其中，rs9574070在3種人群中存在人種差異，并在3個地區(qū)中存在地區(qū)差異，見表2。各SNP位點所在的染色體位置、等位基因信息見表3。用于預(yù)測的基因序列為ACOD1的啟動子區(qū)，為ACOD1基因非編碼區(qū)，不存在非同義SNP（nonsynonymous singlenucleotide polymorphism，nsSNP）位點，與預(yù)測結(jié)果相同。此外，MYCBP2和SCEL為ACOD1基因的相鄰基因，表明其可能與ACOD1具有相似的表達模式。

表2 人ACOD1基因啟動子區(qū)SNP功能信息和種族特異等位基因頻率預(yù)測Tab.2 Prediction of functional information and race specific allele frequency of SNP in promoter region of human ACOD1 gene

表3 人ACOD1基因啟動子區(qū)SNP預(yù)測Tab.3 SNP prediction of promoter region of human ACOD1 gene

2.5 人ACOD1蛋白功能GO注釋分析Gene Ontology Consortium數(shù)據(jù)庫從細胞組成、分子功能和生物學(xué)過程對人ACOD1蛋白的分析結(jié)果顯示，人ACOD1蛋白主要定位在線粒體基質(zhì)和核質(zhì)。人ACOD1蛋白參與負調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生、NF-κB轉(zhuǎn)錄活性、Toll樣受體4信號通路、炎癥反應(yīng)等，參與谷氨酰胺代謝、氨基酸代謝等過程，參與防御反應(yīng)、胚胎著床、對LPS誘導(dǎo)的免疫耐受等生物學(xué)過程。人ACOD1蛋白具有水解酶活性、天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶活性、水解酶活性、裂解酶活性、烏頭酸脫羧酶活性等分子功能。

2.6 人ACOD1蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用STRING數(shù)據(jù)庫搜索與人ACOD1蛋白相互作用信息，設(shè)置置信度為0.4，結(jié)果顯示，10個蛋白可能與ACOD1具有相互作用關(guān)系，結(jié)合分數(shù)越高，表明結(jié)合能力越強。白細胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）相互作用分數(shù)最高，表明其可能與ACOD1具有較好的互作關(guān)系。人ACOD1蛋白相互作用關(guān)系見圖3，各分子與人ACOD1蛋白結(jié)合能力見表4。

表4 各分子與人ACOD1蛋白結(jié)合能力Tab.4 Binding ability of various molecules to human ACOD1 protein

圖3 人ACOD1蛋白相互作用預(yù)測Fig.3 Prediction of interaction of human ACOD1 protein

3 討論

炎癥反應(yīng)、抗菌過程、腫瘤、神經(jīng)退行性改變等病理狀態(tài)下，均發(fā)現(xiàn)ACOD1表達下調(diào)，且ACOD1的高表達可抑制病原菌感染、抑制炎癥反應(yīng)等。表明適當(dāng)激活A(yù)COD1信號，可能對炎癥、病原體感染、癌癥等多種疾病起到治療作用。人ACOD1基因定位于13號染色體（13q22.3）上，全長10 128 bp，ACOD1基因在黑猩猩、狗、牛、老鼠、雞、斑馬魚、爪蟾和曲霉屬等其他物種中高度保守［10-12］。ACOD1蛋白主要存在于免疫細胞線粒體中，催化衣康酸合成，并在氧化應(yīng)激和抗原呈遞上發(fā)揮重要作用［13-15］。

本文利用生物信息學(xué)方法對人ACOD1基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子、甲基化CpG位點、SNP位點進行預(yù)測，并對ACOD1基因編碼的蛋白進行GO功能注釋及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，對于研究人ACOD1基因及其編碼蛋白的表達和調(diào)控，明確其生物學(xué)功能具有一定的意義。

TSS上游2 000 bp至下游100 bp區(qū)域內(nèi)可能存在3個啟動子區(qū)，特別是1 958～2 008 bp區(qū)域，預(yù)測分值最高，推測其可能是核心啟動子區(qū)，為轉(zhuǎn)錄機制提供了高特異性和親合力的結(jié)合位點。此外，預(yù)測到17種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，包括YY1、C／EB-Palpha、PU.1、AP-1、NF-1、GATA-1、c-Jun、Oct-2.1、GR、TBP、C／EBPbeta、c-Ets-1、ATF、IRF1、HNF-1C、CTF和NF-kappaB。TALLAM等［16］通過沉默轉(zhuǎn)錄因子IRF1表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子IRF1可調(diào)控ACOD1基因的轉(zhuǎn)錄水平。

通常情況下，DNA高甲基化會導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄抑制，低甲基化則會導(dǎo)致基因表達增加［17-18］。為研究甲基化修飾對調(diào)節(jié)人ACOD1基因的轉(zhuǎn)錄起始的作用，本研究利用EMBOSS、CpG Finder和Methe-Primer 3種預(yù)測軟件對人ACOD1基因啟動子區(qū)CpG島進行分析，未發(fā)現(xiàn)人ACOD1基因啟動子區(qū)域存在CpG位點，表明人ACOD1基因的表達可能不受啟動子區(qū)域甲基化的影響。人基因組DNA包含一定水平的多態(tài)性，遺傳背景可能是決定個體基因表達差異的重要因素。在基因的啟動子區(qū)域，本研究證實ACOD1存在SNP，且可能以等位基因特異方式影響基因表達水平。表明人ACOD1基因啟動子區(qū)域SNP存在人種差異和地區(qū)差異。

人ACOD1蛋白是以α-螺旋為主，含有481個氨基酸的親水性蛋白，為同源二聚體結(jié)構(gòu)［10］。8個活性位點殘基（Asp93、Thr97、His103、His159、Lys207、Lys272、His277和Tyr318）被發(fā)現(xiàn)對人類ACOD1功能至關(guān)重要，而這些殘基的突變可能導(dǎo)致ACOD1功能喪失［10］。經(jīng)GO注釋分析，進一步從細胞組成、分子功能和生物學(xué)過程方面明確了ACOD1蛋白的生物功能。人ACOD1蛋白主要參與負調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生、NF-κB轉(zhuǎn)錄活性、Toll樣受體4信號通路、炎癥反應(yīng)等，參與對LPS誘導(dǎo)的免疫耐受等生物學(xué)過程。相關(guān)研究證明了部分生物功能。JAMAL等［3］研究發(fā)現(xiàn)，ACOD1蛋白可通過活性氧（reactive oxygen，ROS）增加巨噬細胞中A20的表達，從而促進內(nèi)毒素耐受。經(jīng)蛋白互作分析，ACOD1蛋白可能與IL-1β、CCL-4、IRF1、CXCL10等蛋白相互作用，且與IL-1β作用關(guān)系最強。

綜上所述，本文利用生物信息學(xué)方法對人ACOD1基因及其編碼的蛋白進行分析，有助于進一步研究人ACOD1基因和蛋白的生物功能，并有助于研究其在炎癥反應(yīng)、病原體感染、腫瘤等復(fù)雜疾病中的調(diào)控機制。但預(yù)測結(jié)果尚需在臨床研究中得到更多的實驗驗證。本研究為進一步探索ACOD1基因及其編碼蛋白的潛在功能提供了重要的參考依據(jù)。