韓業(yè)芹，崔麗榮，邢剛，何長(zhǎng)生，孫裴，劉雪蘭，魏建忠，李郁

1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.馬鞍山史記動(dòng)物健康管理有限公司，安徽 馬鞍山 238251；3.安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，安徽合肥 230091

豬丹毒（swine erysipelas）和豬鏈球菌病（swine streptococcosis）分別是由豬丹毒絲菌（E.rhusiopathiae，ER）和多種致病性豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）引起的急性、熱性人畜共患傳染病，不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失，也對(duì)公共衛(wèi)生安全造成了威脅［1］。血清型1a型ER和2型豬鏈球菌（SS2）是我國(guó)豬群中分離率最高、致病力最強(qiáng)的菌株，且在獸醫(yī)臨床中常見ER、SS與其他細(xì)菌或病毒發(fā)生混合感染或繼發(fā)感染，使豬群的發(fā)病率和死亡率增高［2］，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

抗生素可用于豬丹毒和豬鏈球菌病的防治，但長(zhǎng)期大量不合理地使用易導(dǎo)致ER和SS耐藥性的產(chǎn)生，疫苗接種是預(yù)防豬丹毒和豬鏈球菌病、降低死亡發(fā)生的有效措施［3］。目前，ER和SS2商品化疫苗包括弱毒疫苗和滅活疫苗。弱毒疫苗雖能產(chǎn)生較好的免疫效果，但易受母源抗體和抗生素的干擾，并存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)；滅活疫苗的使用安全性優(yōu)于弱毒疫苗，易于制備多聯(lián)苗，從而達(dá)到“一針多防”的目的，且可節(jié)省接種成本，降低對(duì)動(dòng)物的免疫應(yīng)激反應(yīng)［4］。目前國(guó)內(nèi)外尚無商品化ER和SS2二聯(lián)滅活疫苗上市。本研究將前期通過致病性、抗原性和穩(wěn)定性試驗(yàn)篩選出的1株1a型ER（編號(hào)AEr31）和1株SS2（編號(hào)HF2）作為制苗菌株［5-6］，經(jīng)甲醛滅活A(yù)Er31和HF2，以ISA 201VG礦物油為佐劑制備ER-SS2二聯(lián)油乳劑滅活疫苗，并進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià)，以期為該疫苗的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株ER及SS2的制苗菌株（AEr31和HF2）、ER及SS2攻毒菌株（AEr21和BZ1）、ER-SS2聯(lián)合攻毒菌株（由AEr21與BZ1等比混合菌液制成）均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定及保存。菌株信息見表1。

表1 制苗菌株及攻毒菌株的背景信息Tab.1 Background information of strains for vaccine preparation and challenge

1.2 主要試劑 酵母浸膏胰酪胨大豆瓊脂（TSAYE）、酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）及腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI）均購自紹興天恒生物科技有限公司；豬丹毒（疫苗）培養(yǎng)基購自青海高科園海博生物技術(shù)公司；ISA 201VG礦物油佐劑購自法國(guó)賽比克公司；甲醛溶液購自上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；小鼠脾臟組織淋巴細(xì)胞分離試劑盒購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購自美國(guó)博士德生物工程有限公司；細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)試劑盒（IL-4、IL-10、IFNγ、TFN-β、MCP-1）購自美國(guó)RB公司；流式細(xì)胞抗體試劑盒購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；DMSO購自北京四季青生物科技有責(zé)任限公司；健康豚鼠血清由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明小鼠，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量為18～22 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)為：SCXK（皖）2017-001。本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠的所有處理均以科研為目的進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行操作。

1.4 ER-SS2二聯(lián)油乳劑滅活疫苗的制備 將菌株AEr31及HF2用終濃度為0.3%的甲醛，于37℃分別滅活8和15 h。將滅活完全的菌液V-AEr31和V-HF2等體積混合，再與ISA 201VG礦物油佐劑等體積混合，制備為ER-SS2二聯(lián)油乳劑滅活疫苗，即（V-AEr31+V-HF2）+ISA 201VG。另將滅活完全的菌液V-AEr31和V-HF2分別與ISA 201VG礦物油佐劑等體積混合，再進(jìn)行等比例混合，即（V-AEr31+ISA 201VG）+（V-HF2+ISA 201VG）。上述兩種滅活疫苗按文獻(xiàn)［7］方法進(jìn)行性狀、無菌和安全檢驗(yàn)。

1.5 免疫效果評(píng)價(jià)

1.5.1 動(dòng)物分組及給藥 將小鼠隨機(jī)分為5組（編號(hào)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ），Ⅰ～Ⅲ組每組105只，Ⅳ、Ⅴ組每組30只。Ⅰ、Ⅱ組分別接種（V-AEr31+V-HF2）+ISA 201VG和（V-AEr31+ISA 201VG）+（V-HF2+ISA 201VG），Ⅲ組接種等體積的滅菌0.9%氯化鈉溶液，均經(jīng)皮下多點(diǎn)注射，接種劑量均為0.2 mL／只，共接種2次，間隔14 d。Ⅳ組不接種不攻毒，Ⅴ組不接種僅攻毒。

1.5.2 小鼠血清中IgG抗體水平的檢測(cè) 于每次接種后7及14 d，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組各取3只小鼠，經(jīng)小鼠眼眶靜脈竇采血，分離血清，ELISA法檢測(cè)血清中IgG抗體效價(jià)［8］，并計(jì)算P／N值。

1.5.3 小鼠血清功能性抗體水平的檢測(cè) 采用血清殺菌試驗(yàn)。于每次接種后7及14 d，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組各取3只小鼠，經(jīng)小鼠眼眶靜脈竇采血，分離血清，經(jīng)過濾器除菌。每組均設(shè)免疫組、補(bǔ)體對(duì)照組及體系對(duì)照組，免疫組為：PBS稀釋液+待檢小鼠血清＋健康豚鼠血清（補(bǔ)體）＋菌懸液（分別為AEr21、BZ1、AEr21-BZ1，濃度均為1.0×106CFU／mL）；補(bǔ)體對(duì)照組為：PBS稀釋液＋健康豚鼠血清（補(bǔ)體）＋菌懸液（分別為AEr21、BZ1、AEr21-BZ1，濃度均為1.0×106CFU／mL）；體系對(duì)照組為：PBS稀釋液＋健康豚鼠血清（滅活補(bǔ)體）＋菌懸液（分別為AEr21、BZ1、AEr21-BZ1，濃度均為1.0×106CFU／mL）。均置37℃孵育1 h；涂布于TSAYE培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算殺菌率。若免疫組孔內(nèi)菌落數(shù)為補(bǔ)體對(duì)照孔的50%以下即為“殺菌”，否則為“不殺菌”。

1.5.4 小鼠血清中相關(guān)細(xì)胞因子水平的檢測(cè) 于每次接種后7及14 d，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組各取3只小鼠，經(jīng)小鼠眼眶靜脈竇采血，分離血清，采用細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞因子（IL-4、IL-10、IFNγ、TFN-β、MCP-1）水平。

1.5.5 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平的檢測(cè) 于每次接種后7及14 d，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組各取3只小鼠，經(jīng)小鼠眼眶靜脈竇采集外周血，制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至5×106個(gè)／mL，加入96孔板，100 μL／孔，試驗(yàn)孔中加入10 μL的植物血凝素，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)對(duì)照孔（僅加入培養(yǎng)液），置37℃，5%CO2條件下孵育70 h；加入MTT，20 μL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄培養(yǎng)液，加入DMSO，150 μL／孔，混勻，用酶標(biāo)儀檢測(cè)A570［9］，并按下式計(jì)算增殖指數(shù)（SI）。SI越高，脾淋巴細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)，反之越弱。

1.5.6 小鼠外周血中CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群百分比的測(cè)定 于每次接種后7及14 d，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組各取3只小鼠，經(jīng)小鼠眼眶靜脈竇采集外周血，按文獻(xiàn)［10］的方法，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.7 小鼠免疫保護(hù)率的測(cè)定 第2次免疫后14 d，將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ組小鼠均用AEr21、BZ1和AEr21-BZ1菌液經(jīng)腹腔進(jìn)行攻毒，每組均設(shè)3種攻毒菌感染劑量，分別為100 LD50、5 LD100和30 LD100，即Ⅰ1～Ⅰ3組、Ⅱ1～Ⅱ3組、Ⅲ1～Ⅲ3組和Ⅴ1～Ⅴ3組，Ⅳ組注射無菌生理鹽水（Ⅳ1～Ⅳ3組），均0.3 mL／只。攻毒7 d后，觀察各組小鼠的精神狀態(tài)及死亡情況，并按下式計(jì)算各組小鼠免疫保護(hù)率。

1.5.8 小鼠臟器組織荷菌數(shù)的檢測(cè) 攻毒3 d后，取各組小鼠的肺、肝、脾、腎臟，稱重并記錄，計(jì)算組織重量。研磨后，用PBS緩沖液進(jìn)行10倍稀釋，分別取100、10-1、10-23個(gè)稀釋度的組織懸液各1 mL，均勻涂布于TSA-YE固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h，平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)細(xì)菌菌落數(shù)（以CFU／mL為單位）。

1.5.9 小鼠臟器病理組織的檢測(cè) 攻毒14 d后，取各組小鼠的肺、肝、脾、腎臟，置10%福爾馬林中浸泡24 h；更換福爾馬林，進(jìn)行固定及保存，送安徽醫(yī)科大學(xué)制作病理組織切片，進(jìn)行鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過Graphpad.7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖，數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ER-SS2二聯(lián)油乳劑滅活疫苗的檢定

2.1.1 性狀（V-AEr31+V-HF2）+ISA 201VG及（V-AEr31+ISA 201VG）+（V-HF2+ISA 201VG）兩種疫苗外觀檢查均呈乳白色，為顆粒均勻的混懸液，無沉淀、凝塊、分層及其他異物；黏度均為3 s；均未出現(xiàn)破乳現(xiàn)象；均為水包油包水型乳劑。符合油乳劑滅活疫苗性狀檢驗(yàn)要求。

2.1.2 無菌檢驗(yàn)（V-AEr31+V-HF2）+ISA 201VG及（V-AEr31+ISA 201VG）+（V-HF2+ISA 201VG）兩種疫苗于TSB-YE液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3 d仍清澈透明；于TSA-YE固體培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h均無細(xì)菌生長(zhǎng)。符合油乳劑滅活疫苗無菌檢驗(yàn)要求。

2.1.3 安全檢驗(yàn) 免疫（V-AEr31+V-HF2）+ISA 201VG及（V-AEr31+ISA 201VG）+（V-HF2+ISA 201VG）14 d后，20只小鼠均健康存活、吸收良好，無明顯全身及局部不良反應(yīng)。符合油乳劑滅活疫苗安全檢驗(yàn)要求。

2.2 免疫效果評(píng)價(jià)

2.2.1 小鼠血清中IgG抗體水平 Ⅰ、Ⅱ組小鼠各時(shí)間點(diǎn)的血清IgG抗體水平相同，且均顯著高于Ⅲ組（F=2.00，P＜0.05），見表2。

表2 ER-SS2二聯(lián)油乳劑滅活疫苗免疫小鼠血清中的IgG抗體水平Tab.2 IgG antibody titer in sera of mice immunized with oil emulsion-inactivated ER-SS2 combined vaccine

2.2.2 小鼠血清的功能性抗體水平 菌懸液分別為AEr21、BZ1、AEr21-BZ1時(shí)，Ⅰ、Ⅱ組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌數(shù)均低于補(bǔ)體對(duì)照的50%，均有殺菌作用，且均顯著低于Ⅲ組（F=123.63，P＜0.05）；Ⅰ、Ⅱ組細(xì)菌數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 648，P＞0.05）。見圖1。表明Ⅰ、Ⅱ組小鼠血清對(duì)ER和SS2均有殺菌作用。

圖1 小鼠血清殺菌試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Serum germicidal test in mice

2.2.3 小鼠血清中相關(guān)細(xì)胞因子的水平 各時(shí)間點(diǎn)的Ⅰ、Ⅱ組小鼠血清中IL-4、IL-10、IFNγ、TNF-β、MCP-1水平均明顯高于Ⅲ組（F=2.36，P＜0.05），且相同時(shí)間點(diǎn)Ⅰ、Ⅱ組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=132.00，P＞0.05），見圖2。表明兩種方式制備的ER-SS2二聯(lián)油乳劑滅活疫苗均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞因子。

圖2 小鼠血清中IL-4（A）、IL-10（B）、IFNγ（C）、TNF-β（D）及MCP-1（E）的水平Fig.2 Results of detection of IL-4（A），IL-10（B），IFNγ（C），TNF-β（D）and MCP-1（E）in sera of mice

2.2.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖水平 在整個(gè)免疫周期中，Ⅰ、Ⅱ組小鼠的SI呈上升趨勢(shì)，Ⅲ組變化較?。桓鲿r(shí)間點(diǎn)Ⅰ、Ⅱ組小鼠的SI顯著高于Ⅲ組（F=2.806，P＜0.05），Ⅰ與Ⅱ組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.905，P＞0.05）。見表3。表明兩種方式制備的ER-SS2二聯(lián)油乳劑滅活疫苗均能有效地刺激脾細(xì)胞增殖，使其淋巴細(xì)胞不斷活化、增殖和分化，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

表3 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Splenic lymphocyte proliferation test in mice

2.2.5 小鼠外周血中CD4+及CD8+T細(xì)胞亞群的百分比 各時(shí)間點(diǎn)Ⅰ、Ⅱ組小鼠外周血中CD4+／CD3+、CD8+／CD3+均顯著高于Ⅲ組（F=14.00，P＜0.05），Ⅰ、Ⅱ組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.80，P＞0.05），見圖3。表明兩種方式制備的ER-SS2二聯(lián)油乳劑滅活疫苗均可誘導(dǎo)小鼠T細(xì)胞亞群比率持續(xù)升高。

圖3 小鼠外周血中CD4+（A）及CD8+（B）T細(xì)胞亞群的百分比Fig.3 Percentage of CD4+（A）and CD8+（B）T cell subsets in peripheral blood of mice

續(xù)圖2小鼠血清中IL-4（A）、IL-10（B）、IFNγ（C）、TNF-β（D）及MCP-1（E）的水平Fig.2（Continued）Results of detection of IL-4（A），IL-10（B），IFNγ（C），TNF-β（D）and MCP-1（E）in sera of mice

2.2.6 免疫保護(hù)率測(cè)定結(jié)果 第2次免疫14d后，Ⅴ1、Ⅴ2、Ⅴ3組所有小鼠均死亡，Ⅳ1、Ⅳ2、Ⅳ3組所有小鼠均存活，試驗(yàn)成立。Ⅰ、Ⅱ組小鼠均存活，免疫保護(hù)率為100%，Ⅲ組小鼠均死亡，免疫保護(hù)率為0%。表明兩種方式制備的ER-SS2二聯(lián)油乳劑滅活疫苗均能使小鼠產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)力，可100%抵御ER和SS2強(qiáng)毒株攻擊。

2.2.7 小鼠臟器的組織荷菌數(shù) Ⅰ、Ⅱ組小鼠的肺、肝、脾、腎臟組織的細(xì)菌定植量均顯著低于Ⅲ組（F=26.00，P＜0.05），且Ⅰ、Ⅱ組小鼠間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.157，P＞0.05），見圖4。表明兩種方式制備的ER-SS2二聯(lián)油乳劑滅活疫苗均能有效清除ER和SS在體內(nèi)的定植。

圖4 攻毒后小鼠各臟器組織中的荷菌量Fig.4 Loads of bacteria in various organs of mice after virus challenge

2.2.8 小鼠臟器病理組織學(xué)觀察

2.2.8.1 肺臟 Ⅳ1、Ⅳ2和Ⅳ3組整體結(jié)構(gòu)正常；Ⅴ1組有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，Ⅴ2組部分肺泡萎縮，組織有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，Ⅴ3組肺泡壁明顯增厚，肺間質(zhì)可見淤血；Ⅰ1、Ⅱ1組肺間質(zhì)輕微充血，組織未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，Ⅰ2、Ⅱ2組整體結(jié)構(gòu)正常，未見明顯炎癥，Ⅰ3、Ⅱ3組肺間質(zhì)輕微充血；Ⅲ1組肺泡壁增厚，組織可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，Ⅲ2組肺間質(zhì)可見明顯充血，Ⅲ3組肺泡壁增厚，明顯實(shí)質(zhì)化，組織可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖5。

圖5 各組小鼠肺臟病理組織切片鏡下觀察（HE染色，×20）Fig.5 Histopathological changes of lung of mice in various groups（HE staining，×20）

2.2.8.2 肝臟 Ⅳ1、Ⅳ2和Ⅳ3組整體結(jié)構(gòu)正常；Ⅴ1、Ⅴ2組肝竇間隙增大、輕微充血，肝竇間隙巨噬細(xì)胞明顯增多，Ⅴ3組肝組織中央靜脈輪廓不清晰，肝竇間隙增大，輕微充血，組織有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Ⅰ1、Ⅱ1組肝竇間隙輕微增大，組織未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，Ⅰ2、Ⅱ2組部分肝細(xì)胞輕微水腫，組織未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，Ⅰ3、Ⅱ3組結(jié)構(gòu)基本正常；Ⅲ1組肝細(xì)胞排列紊亂，可見肝細(xì)胞固縮壞死，部分水腫至空泡變性，Ⅲ2組肝竇間隙明顯增大，肝細(xì)胞溶解壞死，Ⅲ3組肝組織中央靜脈輪廓不清晰，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖6。

圖6 各組小鼠肝臟病理組織切片鏡下觀察（HE染色，×20）Fig.6 Histopathological changes of liver of mice in various groups（HE staining，×20）

2.2.8.3 腎臟 Ⅳ1、Ⅳ2和Ⅳ3組整體結(jié)構(gòu)基本正常；Ⅴ1組腎小管上皮疏松水腫脫落，Ⅴ2組部分腎小管上皮疏松水腫脫落，Ⅴ3組腎間質(zhì)大量充血，組織可見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Ⅰ1、Ⅱ1組血管輕微充血擴(kuò)張，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，Ⅰ2、Ⅱ2組組織結(jié)構(gòu)基本正常，Ⅰ3、Ⅱ3組腎小管上皮細(xì)胞輕微脫落水腫，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Ⅲ1組腎小管上皮細(xì)胞輕微脫落水腫，腎間質(zhì)明顯充血，Ⅲ2組腎小管上皮細(xì)胞明顯脫落水腫，組織有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，Ⅲ3組腎小管上皮細(xì)胞大量壞死，壞死區(qū)上皮細(xì)胞核固縮，溶解消失，組織少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖7。

圖7 各組小鼠腎臟病理組織切片鏡下觀察（HE染色，×20）Fig.7 Histopathological changes of kidney of mice in various groups（HE staining，×20）

2.2.8.4 脾臟 Ⅳ1、Ⅳ2和Ⅳ3組整體結(jié)構(gòu)正常；Ⅴ1組整體結(jié)構(gòu)異常，紅髓白髓界限不分明，脾正常結(jié)構(gòu)消失，呈均質(zhì)伊紅色一片，組織有明顯粒細(xì)胞浸潤(rùn)，Ⅴ2組脾小結(jié)結(jié)構(gòu)不清，紅髓白髓界限不分明，脾正常結(jié)構(gòu)消失，Ⅴ3組脾小結(jié)結(jié)構(gòu)不清，紅髓白髓界限不分明，呈均質(zhì)伊紅色一片，組織可見明顯粒細(xì)胞浸潤(rùn)；Ⅰ1和Ⅱ1兩組脾組織可見少量粒細(xì)胞浸潤(rùn)，Ⅰ2、Ⅱ2組和Ⅰ3、Ⅱ3組脾組織整體結(jié)構(gòu)基本正常；Ⅲ1組脾間質(zhì)可見明顯充血，組織可見大量粒細(xì)胞浸潤(rùn)，Ⅲ2、Ⅲ3組脾小結(jié)結(jié)構(gòu)不清，紅髓白髓界限不清，組織淋巴細(xì)胞稀疏，組織可見少量粒細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖8。

圖8 各組小鼠脾臟病理組織切片鏡下觀察（HE染色，×20）Fig.8 Histopathological changes of spleen of mice in various groups（HE staining，×20）

3 討論

近年，豬丹毒在國(guó)內(nèi)外多個(gè)地區(qū)呈散發(fā)流行態(tài)勢(shì)，檢出率逐漸增多，病死率也隨之上升，國(guó)內(nèi)豬鏈球菌病的流行也較嚴(yán)重，不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來了較大損失，也嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全［11-12］。細(xì)菌耐藥現(xiàn)象使豬丹毒與豬鏈球菌病的防控成本和風(fēng)險(xiǎn)日趨增加，疫苗免疫仍是目前防控這兩種病的有效措施。

多聯(lián)滅活疫苗的免疫效果與其制苗菌株所引起機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答水平密切相關(guān)［13］，不同血清型ER和SS菌株的生物學(xué)特性和毒力存在差異，相同血清型菌株間的毒力和抗原性也不盡相同，因此接種后免疫效果可能出現(xiàn)不確切的現(xiàn)象［10］。體液免疫應(yīng)答是評(píng)價(jià)疫苗免疫效果的重要指標(biāo)，IgG抗體是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體，在機(jī)體抗感染過程中發(fā)揮主要作用［14］。細(xì)菌性滅活疫苗清除體內(nèi)的病原菌主要是通過特異性抗體、補(bǔ)體與吞噬細(xì)胞表面受體結(jié)合，介導(dǎo)吞噬細(xì)胞發(fā)揮對(duì)病原菌的調(diào)理吞噬作用［15］。通過血清殺菌試驗(yàn)檢測(cè)免疫血清中特異性抗體的調(diào)理吞噬活性，可直接反映功能性抗體水平，從而準(zhǔn)確評(píng)估疫苗的保護(hù)效力［16］。本研究采用兩種不同混合方式制備了ER-SS2二聯(lián)油乳劑滅活疫苗，免疫小鼠后產(chǎn)生的IgG抗體效價(jià)均為1∶25 600，表明這兩種滅活疫苗通過誘導(dǎo)IgG抗體來介導(dǎo)體液免疫，小鼠血清中IgG抗體水平越高，補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌效應(yīng)越強(qiáng)，血清殺菌效果越好。綜上所述，由兩種方式制備的ER-SS2二聯(lián)油乳劑滅活疫苗均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生大量特異性抗體與功能性抗體，可與機(jī)體免疫系統(tǒng)結(jié)合殺傷病原菌，具有良好的免疫效果。

脾淋巴細(xì)胞增殖能力與免疫系統(tǒng)應(yīng)對(duì)細(xì)菌性疾病所引起的細(xì)胞免疫水平較為一致。Th細(xì)胞（CD4抗原）基于分泌性質(zhì)及功能的差異又分為Th1和Th2亞型，Th1細(xì)胞可分泌IFNγ、TNF-β等細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；Th2細(xì)胞可分泌IL-4和IL-10等，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答［17］。Tc細(xì)胞（CD8抗原）可分泌IFNγ、TNF-β等細(xì)胞因子。MCP-1作為炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因子，可同時(shí)作用于Th1和Th2的細(xì)胞分化［6］。本研究結(jié)果顯示，兩種方式制備的ER-SS2二聯(lián)油乳劑滅活疫苗均能有效刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，使其淋巴細(xì)胞不斷活化、增殖和分化，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，同時(shí)刺激CD4+／CD3+T和CD8+／CD3+T細(xì)胞比例持續(xù)升高，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，促進(jìn)體液免疫的同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平細(xì)胞因子，以達(dá)到機(jī)體產(chǎn)生持久的免疫保護(hù)效果。

SS多定植于扁桃體，當(dāng)定植與免疫之間平衡破壞時(shí)，SS可從扁桃體向周圍淋巴組織擴(kuò)散［19］，ER也可通過消化道或損傷的皮膚黏膜侵入機(jī)體，兩種病原菌與機(jī)體相互對(duì)抗，發(fā)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)入血液，隨后侵襲相應(yīng)組織器官，使機(jī)體對(duì)應(yīng)部位形成病灶，造成損傷或死亡［18］。本研究于第2次加強(qiáng)免疫小鼠后14 d，經(jīng)小鼠腹腔注射ER、SS2和ER-SS2菌液進(jìn)行攻毒，通過免疫保護(hù)率、組織荷菌數(shù)及病理組織變化等指標(biāo)對(duì)兩種方式制備的ER-SS2二聯(lián)油乳劑滅活疫苗的免疫效力進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明，兩種方式制備的滅活疫苗不僅對(duì)ER、SS2和ER-SS2混合感染具有100%的保護(hù)力，同時(shí)免疫后小鼠各器官組織荷菌數(shù)顯著降低（P<0.05），且病變輕微。表明小鼠接種疫苗后獲得特異性免疫的能力，受到外來抗原刺激時(shí)機(jī)體迅速啟動(dòng)免疫應(yīng)答反應(yīng)，效應(yīng)細(xì)胞與效應(yīng)分子共同作用清除抗原物質(zhì)，使機(jī)體免受外來抗原侵襲，從而對(duì)ER和SS2產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)力及較強(qiáng)的清除細(xì)菌定植能力。

綜上所述，兩種方式制備的ER-SS2二聯(lián)油乳劑滅活疫苗免疫小鼠后均能產(chǎn)生良好的體液免疫和細(xì)胞免疫，可100%抵抗ER、SS2和ER-SS2強(qiáng)毒株的攻擊，本研究為該疫苗進(jìn)一步應(yīng)用于豬的臨床實(shí)踐奠定了基礎(chǔ)，也為有效防控豬丹毒和豬鏈球菌病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。