李泓漪，翁泳佳，郭定和，王少杰，成曉龍

1.山西醫(yī)科大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，山西 太原 030001

食管癌（esophageal carcinoma，ESCA）是全球第八大常見癌癥類型［1］，根據(jù)最新發(fā)表的2018年中國癌癥報告，ESCA的發(fā)病率位居第6位，死亡率位居第4位［2］。根據(jù)病理學類型，將ESCA分為食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，ECA），腺癌為歐美國家的主要類型，占整個ESCA病例的70%～80%［3］，而鱗癌為亞洲、非洲國家的主要發(fā)病類型［4］。我國90%左右的ESCA為鱗癌［5］。盡管隨著診療技術(shù)的進步，ESCC的5年生存率有了一定提升，但全球仍維持在10%～30%的較低水平。我國癌癥中心最新數(shù)據(jù)顯示，ESCC 5年生存率約30%［6-7］。ESCC的發(fā)生嚴重威脅人類健康，且常見癌生物標志物在ESCC中的敏感性低、特異性差［8］。因此，深入研究ESCC的發(fā)生發(fā)展機理，探討其早期診斷標志物顯得尤為重要。

CDCA7基因為本課題組從31對ESCC的癌和癌旁配對樣本中，通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)的拷貝數(shù)擴增的基因之一［9］。已有文獻報道，CDCA7基因在多種腫瘤中高表達，提示其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能起關鍵作用［10］。同時，有文獻報道，CDCA7基因可作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，促進三陰性乳腺癌的轉(zhuǎn)移、侵襲［11］，在肺腺癌中具有促進肺腺癌細胞增殖的作用［12］。本課題組前期在對CDCA7基因的研究中發(fā)現(xiàn)［9］，敲除CDCA7基因可顯著抑制ESCC的增殖及克隆形成能力，但具體的作用機制尚不明確。本實驗探討了CDCA7基因敲除和過表達后對ESCC細胞增殖表型及細胞周期的影響，并尋找CDCA7調(diào)控的下游靶基因CCNB1IP1，通過研究CDCA7基因表達水平變化后的一系列細胞周期蛋白和周期蛋白依賴性蛋白激酶表達水平的變化，分析其相關性以及相互作用機制，從而揭示CDCA7基因引起ESCC發(fā)生發(fā)展的機理。

1 材料與方法

1.1 細胞系、質(zhì)粒及DNA人ESCC細胞系KYSE-450、KYSE150、KYSE180購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；質(zhì)粒pcDNA3.1-V5-HIS購自美國Addgene公司；質(zhì)粒pGL3-Basic、pRL-TK購自美國Promega公司；KYSE150 cDNA和gDNA由山西醫(yī)科大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清、胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗混合液購自美國Gibco公司；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR Mix試劑盒、DNA聚合酶、DNA marker購自日本TaKaRa公司；內(nèi)切酶、微量紫外分光光度計購自美國ThermoFisher公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；小干擾siRNA、對照NC、siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；雙熒光素試劑盒購自美國Promega公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自美國MCE公司；BCA蛋白分析試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；CDCA7抗體（SAB4503307）購自美國Sigma公司；GAPDH抗體（60004-1-Ig）購自美國Proteintech公司；CCNB1IP1抗體（ab71977）、V5抗體（ab15828）、IRDye 800CW熒光二抗購自美國Abcam公司；PVDF膜、染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒（17-295）購自美國Millipore公司；實時熒光定量PCR儀、普通PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；核酸電泳儀、蛋白電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、核酸凝膠成像儀購自美國伯樂公司；冷凍非接觸式超聲細胞破碎儀購自美國Covaris公司；多功能酶標儀購自美國BIO Tek公司；雙熒光素酶檢測儀機購自德國BERTHOLD公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 用RPMI1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%雙抗），在37℃，5% CO295%飽和濕度條件下培養(yǎng)細胞，隔天換液，待細胞生長密度為80%～90%時進行傳代。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建 以KYSE150 cDNA和gDNA為模板，分別利用引物對CDCA7的CDS區(qū)（1 116 bp）、CCNB1IP1的CDS區(qū)（834 bp）及CDCA7與CCNB1IP1的DNA結(jié)合區(qū)域進行PCR擴增。引物序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應條件：98℃10 min；98℃10 s，60℃15 s，72℃2 min，共30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并進行切膠純化回收后，37℃，DNA內(nèi)切酶酶切2 h，與經(jīng)同樣酶酶切的質(zhì)粒pcDNA3.1-V5-HIS、pGL3-Basic，經(jīng)T4 DNA連接酶4℃連接過夜；連接產(chǎn)物涂布LB板，16 h后挑取單克隆，菌落PCR及質(zhì)粒測序（北京諾禾致源科技股份有限公司）鑒定過表達載體pcDNA3.1-V5-HIS-CDCA7、pcDNA3.1-V5-HIS-CCNB1IP1及雙熒光素報告載體pGL3-Basic-CCNB1IP1。

表1 PCR擴增所用引物Tab.1 Primers for PCR amplification

1.5 siRNA和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將KYSE150和KYSE450細胞按2×106個／孔接種10 cm培養(yǎng)皿，加入完全培養(yǎng)基至終體積為10 mL，當細胞密度達40%～50%時轉(zhuǎn)染CDCA7siRNA，將1×ribo FEC-TTMCP Buffer 240 μL、20 μmol／L siRNA儲存液10 μL、ribo FECTTM CP Reagent轉(zhuǎn)染試劑20 μL混勻，室溫靜置15 min，加入10 cm培養(yǎng)皿，48～72 h后收集細胞。敲低細胞系分別命名為CDCA7-sh1／2組，對照細胞系分別命名為KYSE150／KYSE450-NC組。siRNA序列為：CDCA7-siRNA1：5'-GCCCTCAGAGAATTCTGTGACTGAT-3'，CDCA7-siRNA2：5'-CATCCGTGACCCTTCCGCATATAAT-3'；CCNB1IP1-siRNA1：5'-CGAAAGTGTCGCATCAAAC-3'，CCNB1IP1-siRNA 2：5'-GGAGCGCAATCGTCAGTA-3'。

將KYSE180細胞按2×106個／孔接種10 cm培養(yǎng)皿，加入培養(yǎng)液至終體積為10 mL，當細胞密度達40%～50%時轉(zhuǎn)染CDCA7過表達質(zhì)粒，將1 mL Opti-MEM、24 μg pcDNA3.1-V5-HisB-CDCA7、pcDNA3.1-V5-HisB-CCNB1IP1以及50 μL轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫靜置15 min，加至10 cm培養(yǎng)皿，48～72 h后收集細胞。過表達的細胞系為CDCA7-EXP組，陰性對照為KYSE180-NC組，分別用qRTPCR和Western blot法檢測基因的敲除和過表達效率。

將CDCA7-sh組及對照組KYSE150細胞按0.8×105個／孔接種24孔板，當轉(zhuǎn)染密度達40%～50%時，將800 ng pGL3-Basic-CCNB1IP1和2.4 ng內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染至細胞中。

1.6 qRT-PCR用TRIzol試劑提取細胞總mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA（反轉(zhuǎn)錄體系：20 μL。反應條件：37℃15 min；85℃5 s），以其為模板，利用SYBR Premix EX Taq試劑盒進行qRT-PCR擴增。qRT-PCR所用引物見表2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應條件：95℃10 min；95℃15 s；60℃50 s；共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算產(chǎn)物相對表達量。

表2 qRT-PCR所用引物Tab.2 Primers for qRT-PCR

1.7 Western blot用含PMSF和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞總蛋白，冰上超聲裂解，4℃，10 000×g離心30 min，收集上清，BCA蛋白分析試劑盒進行蛋白濃度定量。經(jīng)10% SDS-PAGE分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法（100 V，2 h）轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入CDCA7（1∶1 000稀釋）、CCNB1IP1（1∶1 000稀釋）、GAPDH（1∶2 000稀釋）抗體，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入IRDye 800CW熒光二抗（1∶10 000稀釋），室溫孵育2～3 h；TBST洗膜3次，顯影。

1.8 CCK8試驗 將對數(shù)生長期細胞按5×103個／孔接種96孔板，每組設5個復孔，分別于24、48、72、96、120 h時加入10% CCK8試劑，37℃孵育0.5 h；采用多功能酶標儀測定各孔在450 nm波長處的吸光度值，計算平均值和標準差。

1.9 硬克隆試驗 將對數(shù)生長期細胞按1×103個／孔接種6孔板，用2 mL含10% FBS的RMPI1640培養(yǎng)基于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～14 d；鏡下觀察到克隆形成后，棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定20 min；三蒸水清洗，結(jié)晶紫染色30 min；三蒸水清洗，觀察形成的克隆并計數(shù)。

1.10 染色質(zhì)免疫共沉淀測序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-sequence） 按照染 色 質(zhì)免疫共沉淀試劑盒說明書進行操作。將轉(zhuǎn)染過表達載體pcDNA3.1-V5-HisB-CDCA748 h的KYSE150細胞，加入終濃度1%的甲醛交聯(lián)，37℃孵育10 min；收集細胞，加入裂解液超聲破碎（rc*750，功率25%，4.5沖擊，9 s間隙，共14次），4℃，13 800×g離心10 min；收集上清，取100 μL，加入4 μL 5 mol／L NaCl至終濃度0.2 mol／L，65℃金屬浴處理3 h，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定解交聯(lián)產(chǎn)物。取100 μL超聲裂解液2管，分別加入900 μL ChIP Dilution Buffer和20 μL 50×PIC，再各加入60 μL ProteinA Agarose／Salmon Sperm DNA，4℃翻轉(zhuǎn)混勻1 h；4℃，900×g離心1 min；取上清，1管加入1 μL V5抗體，1管不加，4℃翻轉(zhuǎn)過夜；加入60 μL ProteinA Agarose／Salmon Sperm DNA，4℃翻轉(zhuǎn)2 h；4℃，900×g離心心1 min；棄上清，緩沖液洗滌沉淀復合物，洗脫解交聯(lián)，回收獲得DNA片段，送北京諾禾致源科技股份有限公司測序。

1.11 雙熒光素酶報告試驗 將ChIP-sequence中分析得到的CDCA7與CCNB1IP1結(jié)合峰序列，構(gòu)建至pGL3-Basic報告基因質(zhì)粒中。將帶有海腎熒光素報告酶基因（Rinilla luciferase）的pRL-TK質(zhì)粒作為內(nèi)參質(zhì)粒，與重組質(zhì)粒pGL3-Basic共轉(zhuǎn)染至CDCA7-sh1和KYSE150-NC組細胞中，48 h后裂解細胞，取裂解液，分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，計算螢火蟲熒光素／海腎熒光素值，以此來表示雙熒光素報告酶重組質(zhì)粒的相對活性。

1.12 數(shù)據(jù)分析 通過美國TCGA數(shù)據(jù)庫查閱CDCA7在各種腫瘤中的表達情況，并下載ESCC患者RNASeq數(shù)據(jù)，包括96例ESCC樣本。同時獲得CDCA7和CCNB1IP1在ESCC中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，用GraphPad Prism 8.0軟件進行相關性分析。用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析CDCA7在ESCA中的表達情況。

用LOGpc數(shù)據(jù)庫對TCGA和GEO數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)整合［13］，將CDCA7按不同表達水平分組后，用Kaplan-Meier生存分析法分析患者的生存預后情況。

1.13 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組計量資料的比較采用單因素方差分析（One way ANOVA），計量資料兩組比較采用Student-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1CDCA7在ESCA中的表達及臨床預后情況GEPIA數(shù)據(jù)庫中ESCA樣本的表達數(shù)據(jù)顯示，CDCA7在ESCA組織中相對于正常組織表達量升高，見圖1。表明CDCA7可能作為一個癌基因在癌癥中發(fā)揮作用。LOGpc數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)生存分析顯示，CDCA7高表達的患者預后差，見圖2。

圖1 CDCA7在ESCA組織及正常組織中的表達情況Fig.1 Expression of CDCA7 in ESCA and normal tissues

圖2 CDCA7表達水平的不同分組下ESCC患者的生存分析Fig.2 Kaplan-Meier survival analysis of patients with ESCC with various CDCA7 expression levels

2.2 ESCC細胞系中CDCA7敲低和過表達效率qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA序列的KYSE150和KYSE450細胞，即CDCA7sh1／2組，與KYSE150／KYSE450-NC組相比，CDCA7的mRNA和蛋白表達水平均明顯降低（F分別為971 173、541.5、8 979、873.2，P均<0.001），見圖3和圖4；而轉(zhuǎn)染過表達載體的KYSE180細胞，即CDCA7-EXP組，與KYSE180-NC組相比，CDCA7mRNA和蛋白表達水平均明顯升高（t分別為9.503、38.61，P均<0.001），見圖5和圖6。

圖3 KYSE150和KYSE450細胞中CDCA7敲低效率Fig.3 Knockdown efficiencies of CDCA7 in KYSE150 and KYSE450 cell lines

圖4 KYSE150和KYSE450敲低細胞系中CDCA7蛋白表達水平的Western blot分析Fig.4 Western blotting of expression levels of CDCA7 protein in KYSE150 and KYSE450 knockdown cell lines

圖5 KYSE180細胞系中CDCA7過表達效率Fig.5 Overexpression efficiency of CDCA7 in KYSE180 cell line

圖6 KYSE180過表達細胞系中CDCA7蛋白表達水平的Western blot分析Fig.6 Western blotting of expression level of CDCA7 protein in KYSE180 overexpression cell line

2.3CDCA7對ESCC細胞增殖和細胞周期的影響CCK8和硬克隆試驗結(jié)果顯示，低表達CDCA7的KYSE150、KYSE450細胞，即CDCA7-sh1／2組，與KYSE150／KYSE450-NC組相比，增殖能力和克隆形成能力均明顯減弱（F分別為9.386、219.7、55.89、707.4，P均<0.05），見圖7和圖8；高表達CDCA7的KYSE180細胞，即CDCA7-EXP組，與KYSE180-NC組相比，增殖能力和克隆形成能力均明顯增強（t分別為10.53、93.34，P均<0.05），見圖9。

圖7 CCK8（A）、硬克隆試驗（B）檢測CDCA7對KYSE150細胞系增殖能力的影響Fig.7 Determination of effect of CDCA7 on proliferation of KYSE150 cell line by CCK8（A）and hard clone（B）assays

圖8 CCK8（A）、硬克隆試驗（B）檢測CDCA7對KYSE-450細胞系增殖能力的影響Fig.8 Determination of effect of CDCA7 on proliferation of KYSE450 cell line by CCK8（A）and hard clone（B）assays

圖9 CCK8（A）、硬克隆試驗（B）檢測CDCA7對KYSE180細胞系增殖能力的影響Fig.9 Determination of effect of CDCA7 on proliferation of KYSE180 cell line by CCK8（A）and hard clone（B）assays

2.4 不同水平CDCA7對CCNB1IP1的轉(zhuǎn)錄表達的影響ChIP-sequence結(jié)果顯示，CCNB1IP1是能夠與CDCA7結(jié) 合 的 下 游 靶 基 因，CDCA7與CCNB1IP1的-9 777～-10 182 bp區(qū)域結(jié)合，見圖10。

圖10 CDCA7與CCNB1IP1結(jié)合區(qū)域示意圖Fig.10 Diagram of binding region of CDCA7 and CCNB1IP1

qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，CDCA7敲低的CDCA7-sh1／2組，與KYSE150／KYSE450-NC相比，CCNB1IP1的mRNA和蛋白表達水平均下調(diào)（F分別為808.1、14.99、396.1、5636，P均<0.05），見圖11和圖12；相反，CDCA7過表達的CDCA7-EXP組細胞，與KYSE180-NC組相比，CCNB1IP1的mRNA和蛋白表達水平均上調(diào)（t分別為5.556、43.79，P<0.01），見圖13和圖14。

圖11 CDCA7敲低細胞系中CCNB1IP1表達水平Fig.11 Expression level of CCNB1IP1 in CDCA7 knockdown cell lines

圖12 KYSE150和KYSE450敲低細胞系中CCNB1IP1蛋白表達水平的Western blot分析Fig.12 Western blotting of expression levels of CCNB1IP1 protein in KYSE150 and KYSE450 knockdown cell lines

圖13 CDCA7過表達細胞系中CCNB1IP1表達水平Fig.13 Expression level of CCNB1IP1 in CDCA7 overexpression cell line

圖14 KYSE180過表達細胞系中CCNB1IP1蛋白表達水平的Western blot分析Fig.14 Western blotting of expression level of CCNB1IP1 protein in KYSE180 overexpression cell line

皮爾森相關性分析結(jié)果顯示，CDCA7與CCNB1IP1mRNA表達水平呈正相關（r=0.221 4，P<0.05），見圖15。

圖15 ESCC樣本中CDCA7與CCNB1IP1 mRNA表達水平的相關性Fig.15 Correlation between mRNA expression levels of CDCA7 and CCNB1IP1 in ESCC samples

雙熒光素酶報告試驗結(jié)果顯示，與KYSE150-NC組（82.42）相比，CDCA7-sh1組（4.0）細胞熒光素酶活性明顯降低（t=9.656，P<0.001）。

3 討論

本課題組前期ESCC組織及配對正常組織的組學測序發(fā)現(xiàn)，CDCA7基因所在區(qū)域存在顯著且重復的拷貝數(shù)擴增；免疫組化和功能試驗結(jié)果顯示，ESCC組織中CDCA7表達量普遍高于其配對的正常組織，敲低CDCA7能夠顯著抑制ESCC細胞的增長速度。以上結(jié)果提示，CDCA7可能與ESCC的發(fā)生發(fā)展密切相關［9］。CDCA7又名JOP1，為細胞周期分裂相關蛋白家族成員之一，定位于2q31染色體。2005年就有文獻報道，在人類多種腫瘤組織中，發(fā)現(xiàn)CDCA7高表達［10］。有研究顯示，CDCA7可能通過影響細胞周期從而影響肺腺癌細胞的增殖生長［12］；CDCA7可通過發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用，正向調(diào)控EZH2基因的表達以促進三陰性乳腺癌細胞的侵襲和遷移能力［11］。但目前尚無ESCC中有關CDCA7的具體致病分子機制的研究報道。

細胞周期反應了細胞的增殖速度。哺乳動物的細胞周期分為G0／G1期、S期、G2期和M期，受不同細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）及其細胞周期蛋白（cyclin）控制［14］，是一個有序而復雜的調(diào)控過程。cyclin具有調(diào)節(jié)CDK的功能，cyclin和CDK相互配合可精準調(diào)控細胞周期全過程。G1／S期和G2／M期恰好是細胞周期中2個重要檢查點（check-point）。cyclin是調(diào)控細胞周期過程中最核心的分子，cyclin的表達調(diào)控，不僅保證了細胞周期的精準性，同時也介導了check-point功能。cyclin B在G1晚期開始合成，S期表達升高，于G2晚期和M期表達達到峰值并入核與CDK1結(jié)合形成復合物，該復合物稱為成熟促進因子（maturation promoting factor，MPF），在G2末期引導細胞進入有絲分裂的M期［15-18］。在M末期，cyclin B經(jīng)泛素途徑分解，進入下一輪細胞周期或G0期。CCNB1IP1為E3泛素連接酶家族的成員之一，已有文獻報道，CCNB1-IP1的缺失會抑制細胞增殖［19］，其可通過與cyclin B相互作用并促進其降解來調(diào)節(jié)細胞周期進程。

腫瘤細胞中的細胞周期進程是高度紊亂的過程［20-23］。由于抑制基因的失活或突變以及癌基因的過度表達或擴增，可導致下游靶基因表達紊亂，影響cyclin的表達，從而引起不受控制的細胞周期進程和有絲分裂［24-25］。CDCA7在ESCC中存在高拷貝數(shù)和高表達現(xiàn)象。由于已有文獻報道支撐CDCA7可發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用［12］，本研究通過ChIPsequence篩選出CDCA7轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游靶基因CCNB1IP1。當CDCA7高表達后，其可在轉(zhuǎn)錄水平上促進CCNB1IP1基因表達水平升高，而CDCA7敲低后則相反。雙熒光素酶報告試驗進一步明確了CDCA7與CCNB1IP1存在正向調(diào)控關系。當CCNB1IP1表達水平敲低后，ESCC細胞的增殖和克隆能力明顯受到抑制；而當CCNB1IP1過表達后，則明顯促進了ESCC細胞的增殖和克隆形成能力，從而促進細胞增殖速度，進一步加速ESCC的發(fā)生發(fā)展。但本研究有關ESCC中CDCA7下游靶基因CCNB1IP1對CCNB1產(chǎn)生的具體影響，以及是否通過影響CCNB1從而影響細胞周期，均仍需進一步深入研究。

綜上所述，CDCA7基因為本課題組組學測序研究中發(fā)現(xiàn)的ESCC樣本中拷貝數(shù)擴增的基因之一，其在ESCC腫瘤細胞中表達水平明顯增高。CDCA7可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控CCNB1IP1基因的表達加速ESCC細胞的增殖及克隆形成能力，從而影響ESCC的發(fā)生發(fā)展。