萬(wàn)瑩铚，李秋霞，張宏岐，鄒坤，肖萌，伍業(yè)旭，張松，鄧銳

1.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院 三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；3.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003；4.湖北宏裕新型包材股份有限公司，湖北 宜昌 443000

酵母抽提物（yeast extract，YE）是以酵母為主要原料，通過(guò)酵母自身酶解自溶（可再經(jīng)分離提?。?，再經(jīng)干燥后獲得的粉末狀產(chǎn)品，為一類蛋白水解物，富含氨基酸、肽、多肽等酵母細(xì)胞中可溶性成分［1-2］。近年，隨著采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的抗體、重組蛋白藥物及疫苗等生物制品市場(chǎng)的擴(kuò)大，YE作為可支持細(xì)胞生長(zhǎng)及其產(chǎn)物表達(dá)的有效添加劑，在生產(chǎn)抗體類藥物工藝中具有重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景［3-4］。YE作為血清的代替或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)充物添加至無(wú)血清培養(yǎng)中，可規(guī)避血清和動(dòng)物源蛋白水解物存在的免疫原性及病毒、支原體等微生物的污染風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)能夠提高重組蛋白的表達(dá)水平，且具有同批次間組分差異小、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)［5-6］。近年研究發(fā)現(xiàn)，YE對(duì)細(xì)胞傳代擴(kuò)增和批式培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)及抗體表達(dá)均具有正向影響［7-8］，但目前YE在CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的作用及應(yīng)用策略的系統(tǒng)性研究較少。

YE FM888可明顯促進(jìn)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)，具有高溶解性、營(yíng)養(yǎng)源高度富集、低內(nèi)毒素等特點(diǎn)。本研究以CHO懸浮細(xì)胞為研究對(duì)象，探討FM888對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)代謝和周期凋亡的影響，以期為FM888在動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用及高效無(wú)血清培養(yǎng)基的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 細(xì)胞株CHOK1-1122sp20購(gòu)自常州艾米能斯生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器EmCD CHO?Medium培養(yǎng)基購(gòu)自常州艾米能斯生物科技有限公司；FM888購(gòu)自安琪酵母股份有限公司；細(xì)胞周期試劑盒和細(xì)胞凋亡試劑盒均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；臺(tái)盼藍(lán)溶液購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；乳酸脫氨酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatinekinase，CK）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；M-900型生物過(guò)程生化分析儀購(gòu)自深圳市西爾曼科技有限公司；7020型全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本HITACHI公司；FACS Verse型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞株CHOK1-1122sp20復(fù)蘇后，用EmCD CHO?Medium培養(yǎng)基重懸，取30 mL，接種至125 mL搖瓶中，于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為165 r／min。每48 h進(jìn)行種子細(xì)胞傳代擴(kuò)增，傳代后活細(xì)胞密度控制在（4～6）×105個(gè)／mL。

1.4 FM888對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)影響的檢測(cè) 取第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞，183×g離心5 min，棄上清，用EmCD CHO?Medium培養(yǎng)基重懸。按約1.0×106個(gè)／mL的活細(xì)胞密度接種于12孔板中，1 mL／孔，分別添加FM888至終濃度為1、2、3、5 g／L，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（不加FM888），繼續(xù)培養(yǎng)7 d。取培養(yǎng)0～7 d的細(xì)胞懸液100 μL，與臺(tái)盼藍(lán)按1∶1的比例混勻，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，并計(jì)算定活細(xì)胞密度及細(xì)胞活率。

1.5 FM888對(duì)CHO細(xì)胞生化代謝影響的檢測(cè) 取第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞，183×g離心5 min，棄上清，用EmCD CHO?Medium培養(yǎng)基重懸。按約1.0×106個(gè)／mL的活細(xì)胞密度接種于125 mL搖瓶中，接種體積為60 mL，分別添加FM888至終濃度為1、2 g／L，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（不加FM888），繼續(xù)培養(yǎng)。取培養(yǎng)0～7 d的細(xì)胞懸液，采用M-900型生物過(guò)程生化分析儀檢測(cè)葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸和銨根離子含量。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，各生化指標(biāo)含量為縱坐標(biāo)，繪制CHO細(xì)胞生化代謝趨勢(shì)圖。

1.6 FM888對(duì)CHO細(xì)胞中多種酶活力影響的檢測(cè)取1.5項(xiàng)中0～7 d細(xì)胞懸液，采用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)LDH、CK、ALT、AST的活力。

1.7 FM888對(duì)CHO細(xì)胞周期影響的檢測(cè) 取1.5項(xiàng)培養(yǎng)5 d的CHO細(xì)胞5 mL細(xì)胞液，733×g離心5 min，收集細(xì)胞，PBS洗滌1次，重復(fù)離心1次，收集細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106個(gè)／mL。取1 mL細(xì)胞懸液，733×g離心5 min，棄上清，加入70%冷乙醇500 μL，4℃固定過(guò)夜；PBS洗滌1次，183×g離心3 min，棄上清，加入PI／RNaseA染色液500 μL，室溫避光放置30～60 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.8 FM888對(duì)CHO細(xì)胞凋亡影響的檢測(cè) 取培養(yǎng)5 d的CHO細(xì)胞液1 mL，733×g離心5 min，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，重復(fù)離心1次，收集細(xì)胞，調(diào)整濃度為（1～5）×105個(gè)／mL，加入500 μL的Binding Buffer及5 μL的Annexin V-FITC，混勻，再加入5 μL的Propidiumlodide，混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較釆用單因素方差分析，兩組間均數(shù)的比較釆用最小顯著差數(shù)（LSD）法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FM888對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 不同F(xiàn)M888濃度條件下，CHO活細(xì)胞密度及活率均于培養(yǎng)5 d時(shí)達(dá)到峰值，隨后迅速下降。培養(yǎng)1～5 d，與空白對(duì)照組比較，1及2 g／L FM888濃度組的活細(xì)胞密度均明顯高于空白對(duì)照組，3及5 g／L FM888濃度組均明顯低于空白對(duì)照組（F=16.307～279.804，P＜0.05）；培養(yǎng)6及7 d，各濃度FM888組活細(xì)胞密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為2.879和4.808，P＞0.05）。1及2 g／L FM888濃度組前5 d內(nèi)的細(xì)胞活率均保持在80%以上，3 g／L FM888濃度組前4 d內(nèi)細(xì)胞活率在80%以上，5 g／L FM888濃度組僅在前2 d內(nèi)細(xì)胞活率在80%以上；與空白對(duì)照組比較，各濃度FM888組除1及7 d（F分別為3.008和3.207，P均＞0.05）外，其他培養(yǎng)天數(shù)的細(xì)胞活率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.288～52.152，P均＜0.05）。見(jiàn)圖1。表明1、2 g／L的FM888可促進(jìn)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)，確保培養(yǎng)過(guò)程中維持較高活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率。因此，采用1、2 g／L的FM888進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 各組CHO細(xì)胞活細(xì)胞密度（A）及細(xì)胞活率（B）Fig.1 Viable density（A）and viability（B）of CHO cells in various groups

2.2 FM888對(duì)CHO細(xì)胞生化代謝的影響

2.2.1 葡萄糖1、2 g／L FM888組細(xì)胞的葡萄糖濃度在培養(yǎng)0、1 d時(shí)均明顯高于空白對(duì)照組（F分別為7.010和7.139，P均＜0.05），2～5 d時(shí)明顯低于空白對(duì)照組（F=6.970～18.105，P均＜0.05），6、7 d時(shí)各組細(xì)胞的葡萄糖濃度趨近于0。見(jiàn)圖2。表明加入FM888可增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗量。

圖2 各組CHO細(xì)胞葡萄糖的代謝情況Fig.2 Metabolism of glucose of CHO cells in various groups

2.2.2 谷氨酰胺1、2 g／L FM888組細(xì)胞的谷氨酰胺濃度在培養(yǎng)0～3 d時(shí)均顯著低于空白對(duì)照組（F=6.518～26.621，P均＜0.05），4 d時(shí)低于空白對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.333，P＞0.05），5～7 d時(shí)谷氨酰胺濃度為0。見(jiàn)圖3。表明加入FM888可增加細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的消耗量。

圖3 各組CHO細(xì)胞谷氨酰胺的代謝情況Fig.3 Metabolism of glutamine of CHO cells in various groups

2.2.3 谷氨酸1、2 g／L FM888組細(xì)胞的谷氨酸濃度在培養(yǎng)0～7 d時(shí)均顯著高于空白對(duì)照組（F=5.558～145.333，P均＜0.05）。見(jiàn)圖4。表明加入FM888可增加細(xì)胞谷氨酸的生成量。

圖4 各組CHO細(xì)胞谷氨酸的代謝情況Fig.4 Metabolism of glutamate of CHO cells in various groups

2.2.4 乳酸 各組CHO細(xì)胞的乳酸濃度于培養(yǎng)0～4 d時(shí)呈上升趨勢(shì)，培養(yǎng)前2 d，1、2 g／L FM888組乳酸濃度高于空白對(duì)照組（F分別為4.019和16.000，P均＜0.05）；培養(yǎng)3 d時(shí)趨近于空白對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.010，P＞0.05）；4 d時(shí)顯著低于空白對(duì)照組（F=31.902，P<0.05），5～7 d時(shí)呈下降趨勢(shì)，且6 d時(shí)，1、2 g／L FM888組顯著低于空白對(duì)照組（F=14.362，P<0.05）。見(jiàn)圖5。表明加入FM888可降低細(xì)胞乳酸的生成量。

圖5 各組CHO細(xì)胞乳酸的代謝情況Fig.5 Metabolism of lactate of CHO cells in various groups

2.2.5 銨根離子 培養(yǎng)1～4、6、7 d，1 g／L FM888組胞的銨根離子濃度顯著高于空白對(duì)照組，2 g／L FM888組于培養(yǎng)1 d時(shí)顯著低于空白對(duì)照組，2～4、6、7 d時(shí)顯著高于空白對(duì)照組（F=5.558～145.333，P均<0.05）；1和2 g／L FM888組于培養(yǎng)5 d時(shí)與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.473，P＞0.05），見(jiàn)圖6。表明加入FM888可增加細(xì)胞均銨根離子的生成量。

圖6 各組CHO細(xì)胞銨根離子的代謝情況Fig.6 Metabolism of ammonium ions of CHO cells in various groups

上述結(jié)果表明，培養(yǎng)基中加入FM888，整個(gè)培養(yǎng)周期中，谷氨酰胺濃度均低于空白對(duì)照組；培養(yǎng)前期，葡萄糖、乳酸和銨根離子在培養(yǎng)體系中的濃度均高于空白對(duì)照組，表明FM888的添加一定程度上能夠促進(jìn)細(xì)胞代謝活動(dòng)。培養(yǎng)后期，含有FM888培養(yǎng)組中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗及代謝產(chǎn)物的積累均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。

2.3 FM888對(duì)CHO細(xì)胞中多種酶活力的影響 培養(yǎng)前5 d，F(xiàn)M888組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH、CK、ALT、AST活力趨近于空白對(duì)照組。培養(yǎng)6和7 d時(shí)4種酶的活力急劇上升，于培養(yǎng)6 d時(shí)，1和2 g／L FM888組的LDH、CK、ALT、AST活力顯著低于空白對(duì)照組（F分別為66.521、11.713、9.045、69.129，P均<0.05）；于培養(yǎng)7 d時(shí)，1和2 g／L FM888組的LDH、ALT、AST活力顯著低于空白對(duì)照組（F分別為13.699、25.134、146.690，P均<0.05），CK活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.230，P＞0.05）。見(jiàn)圖7。表明加入1和2 g／L的FM888可減少細(xì)胞損傷及CHO細(xì)胞酶的釋放。

圖7 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH（A）、CK（B）、ALT（C）、AST（D）的酶活Fig.7 Enzyme activity of LDH（A），CK（B），ALT（C）and AST（D）in cell culture medium

2.4 FM888對(duì)CHO細(xì)胞周期的影響 與空白對(duì)照組比較，1、2 g／L FM888組細(xì)胞G1期的比例減少11.40%和3.70%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.43，P<0.01）；S期細(xì)胞比例增加17.18%和5.75%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.42，P<0.01）；G2／M期細(xì)胞比例降低44.99%和15.95%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=33.42，P<0.01）。見(jiàn)圖8和表1。表明添加1和2 g／L的FM888能促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖8 不同濃度FM888對(duì)CHO細(xì)胞周期分布的影響Fig.8 Effects of various concentrations of FM888 on CHO cell cycle distribution

2.5 FM888對(duì)CHO細(xì)胞凋亡的影響 與空白對(duì)照組比較，1、2 g／L FM888組細(xì)胞凋亡率分別減少15.24%和13.92%（F=163.3，P<0.01），見(jiàn)圖9和表1。表明隨著FM888濃度的增加，活細(xì)胞的比例隨之升高，凋亡細(xì)胞比例降低，F(xiàn)M888能抑制細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。

表1 各組CHO細(xì)胞的細(xì)胞周期比例及凋亡率（%,±s，n=3）Tab.1 Cell cycle proportions and apoptosis rates of CHO cells in various groups（%，±s，n=3）

表1 各組CHO細(xì)胞的細(xì)胞周期比例及凋亡率（%,±s，n=3）Tab.1 Cell cycle proportions and apoptosis rates of CHO cells in various groups（%，±s，n=3）

注：與空白對(duì)照組比較，a表示P<0.05，aa表示P<0.01。

組別 細(xì)胞凋亡率細(xì)胞周期比例G1 S G2／M空白對(duì)照組 43.893±1.799 43.253±2.104 12.853±0.381 30.833±1.406 1 g／L FM888組 32.493±1.865aa 60.437±0.838aa 07.070±1.154aa 15.588±1.069aa 2 g／L FM888組 40.197±1.635a 49.000±2.189a 10.803±0.915a 16.918±0.900aa

圖9 不同濃度FM888對(duì)CHO細(xì)胞凋亡的影響Fig.9 Effects of various concentrations of FM888 on apoptosis of CHO cells

3 討論

YE是酵母由自身水解酶完成自溶后產(chǎn)生的水溶性成分，不同于植物水解物，其不受植物種類、來(lái)源、地理位置及外源水解酶等各方面因素的影響，YE在一定程度上還能夠控制自溶，有更好的穩(wěn)定性。同時(shí)，已有多種快速、低成本的方法用于YE的鑒定與篩選［9］。因此將YE用于生產(chǎn)抗體、疫苗等生物制劑工藝中具有一定優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于完全培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)及生物反應(yīng)器的細(xì)胞流加培養(yǎng)中，如已開發(fā)出添加YE的無(wú)血清培養(yǎng)基用于培養(yǎng)昆蟲Tn5B1-4細(xì)胞和CHO細(xì)胞［5，10］；YE對(duì)于重組CHO細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中人血小板生成素（human thrombopoietin，hTPO）、IgG和Fc融合蛋白等目標(biāo)蛋白的表達(dá)也具有明顯的促進(jìn)作用［7-11］。

課題組前期研究表明，YE FP103可替代部分血清，為CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)提供所需營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)，對(duì)大量YE進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)考察，從中篩選出能支持的CHO懸浮細(xì)胞高密度生長(zhǎng)的抽提物FM888［12］。FM888以純化培養(yǎng)的高品質(zhì)酵母為原料，采用先進(jìn)的生物定向降解和膜處理等方法制備而成，產(chǎn)品有望替代國(guó)際同類產(chǎn)品應(yīng)用于基因工程重組蛋白、透明質(zhì)酸、疫苗等高端發(fā)酵領(lǐng)域，但缺乏其在CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中作用及使用策略的系統(tǒng)性研究。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，較系統(tǒng)地探討了FM888對(duì)CHO懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。細(xì)胞生長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果顯示，1和2 g／L的FM888能夠促進(jìn)CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)，3和5 g／L的FM888可抑制CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)。有研究證實(shí)，葡萄糖是CHO細(xì)胞的主要能源物質(zhì)之一［13］；葡萄糖在無(wú)氧或缺氧條件下，生成丙酮酸，丙酮酸在一系列酶的作用下生成乳酸［14］，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖消耗，乳酸濃度過(guò)高時(shí)，細(xì)胞會(huì)改變代謝模式，消耗乳酸［15］。CHO細(xì)胞生化代謝檢測(cè)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)前期，含有FM888培養(yǎng)條件下，葡萄糖、乳酸、谷氨酸和銨根離子在培養(yǎng)體系中的濃度高于空白對(duì)照組，谷氨酰胺含量低于空白對(duì)照組；培養(yǎng)后期，含有FM888培養(yǎng)組中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗及代謝產(chǎn)物的積累均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，表明FM888的添加一定程度上能夠促進(jìn)細(xì)胞的代謝活動(dòng)。本研究結(jié)果還顯示，添加FM888可降低在營(yíng)養(yǎng)缺乏下CHO細(xì)胞養(yǎng)液中LDH等酶的釋放，增強(qiáng)CHO細(xì)胞的耐受性。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，1、2 g／L FM888組G1期細(xì)胞比例減小，S期細(xì)胞比例明顯增大，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，且能影響CHO細(xì)胞的周期分布，有利于CHO細(xì)胞的增殖，同時(shí)可減少CHO細(xì)胞凋亡率，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)CHO細(xì)胞增殖。

綜上所述，1及2 g／L的FM888能通過(guò)調(diào)節(jié)CHO細(xì)胞生化代謝、細(xì)胞周期分布，抑制凋亡促進(jìn)CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，其作用機(jī)制還有待于深入研究。本研究為FM888作為無(wú)血清培養(yǎng)基添加劑在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。