石磊泰，曹守春，吳小紅，李加，王云鵬，李玉華

中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

狂犬病是一種古老的人畜共患病，除南極洲外，所有大陸均有發(fā)生，其導(dǎo)致的95%以上的人類死亡發(fā)生在亞洲和非洲區(qū)域。狂犬病雖然是一種可用疫苗預(yù)防的疾病，但一旦暴露，除了接種狂犬病疫苗外，及時的暴露后預(yù)防（post-exposure prophylaxis，PEP）對防止狂犬病病毒感染也非常必要。PEP可阻止狂犬病病毒進入宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而避免宿主感染狂犬病病毒。常見的PEP包括傷口清創(chuàng)和狂犬病免疫球蛋白（rabies immunoglobulin，RIG）的浸潤注射［1］。RIG系用人用狂犬病疫苗免疫供血漿者，采集含高效價狂犬病抗體的血漿，經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法分離純化，并經(jīng)低pH孵育滅活病毒制備的被動免疫制劑［2］。RIG在被動免疫中的作用是患者接種疫苗后開始產(chǎn)生自己的抗體之前，在暴露部位提供狂犬病中和性抗體，盡可能中和狂犬病病毒，阻止狂犬病病毒進入細胞，避免發(fā)生狂犬病，因此，WHO建議所有Ⅲ級暴露均應(yīng)使用RIG，并給出了推薦使用劑量，人免疫球蛋白最大給藥劑量應(yīng)為20 IU／kg體質(zhì)量，馬免疫球蛋白最大給藥劑量應(yīng)為40 IU／kg體質(zhì)量［3］。

狂犬病是一種致死性疾病，一旦出現(xiàn)臨床癥狀，幾乎100%致命。有證據(jù)表明，暴露于狂犬病病毒后，即使在嚴重暴露的情況下，及時使用狂犬病疫苗并進行正確的傷口沖洗和傷口處理，同時使用RIG，幾乎可100%防止狂犬病發(fā)生［3］。

第五批狂犬病免疫球蛋白國家標(biāo)準品自2002年建立以來，經(jīng)多年發(fā)放使用，已達庫存底線，為了對RIG和免疫血清繼續(xù)進行有效的質(zhì)量控制，中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）著手第六批狂犬病免疫球蛋白的研制。通過對目前國內(nèi)RIG質(zhì)量、生產(chǎn)企業(yè)現(xiàn)狀、分裝、凍干設(shè)備以及企業(yè)質(zhì)量控制體系等整體情況的考察，委托國藥中生武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，遵循國家食品藥品監(jiān)督管理局批準的生產(chǎn)工藝和《生物制品國家標(biāo)準物質(zhì)制備和標(biāo)定規(guī)程》的相關(guān)要求進行新狂犬病免疫球蛋白標(biāo)準品所需候選原液的制備、半成品配制，遵循《生物制品分裝和凍干規(guī)程》進行分裝和凍干，規(guī)格為1.0 mL／瓶。后組織國內(nèi)有資質(zhì)的實驗室，采用小鼠中和試驗（mouse neutralization test，MNT）和快速熒光灶抑制試驗（rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT）兩種方法參加協(xié)作標(biāo)定，完成了第六批狂犬病免疫球蛋白標(biāo)準品（批號：250011-201306）的賦值，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 協(xié)作標(biāo)定樣品 樣品信息見表1。

表1 協(xié)作標(biāo)定樣品信息Tab.1 Data on samples for collaborative calibration

1.2 協(xié)作標(biāo)定方案 由中檢院設(shè)計協(xié)作標(biāo)定方案，并發(fā)放協(xié)作標(biāo)定作業(yè)指導(dǎo)書，各實驗室使用統(tǒng)一的標(biāo)準操作規(guī)范和統(tǒng)一的實驗記錄。采用MNT和RFFIT兩種方法分別進行標(biāo)定，每種方法提供不少于5個數(shù)據(jù)，共邀請10家有資質(zhì)的實驗室參與。匯總結(jié)果后經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析進行賦值。根據(jù)95%可信限公式分別求出兩種方法測得值的95%可信限。

1.3 均勻性檢驗 根據(jù)全國標(biāo)準物質(zhì)管理委員會編著的《標(biāo)準物質(zhì)定值原則和統(tǒng)計學(xué)原理》中對標(biāo)準物質(zhì)均勻性檢驗的要求：就均勻性好的樣品而言，當(dāng)總體樣本數(shù)大于500時，隨機抽樣數(shù)不小于15個［4-5］。第六批狂犬病免疫球蛋白國家標(biāo)準品物理檢查合格數(shù)為6 022支，均勻性檢驗抽樣16支，用pH值考察。使用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件，采用方差分析檢驗均勻性，比較組間方差和組內(nèi)方差來判斷各組測量值之間有無系統(tǒng)性差異，如兩者比小于方差分析的臨界值，則認為標(biāo)準品是均勻的。

1.4 穩(wěn)定性檢驗 根據(jù)全國標(biāo)準物質(zhì)管理委員會編著的《標(biāo)準物質(zhì)定值原則和統(tǒng)計學(xué)原理》中對標(biāo)準物質(zhì)穩(wěn)定性檢驗的要求：標(biāo)準物質(zhì)應(yīng)在規(guī)定的保存和使用條件下，開展待定特性量值的穩(wěn)定性檢測，可通過不同溫度的加速和實時穩(wěn)定性試驗進行［5-6］。將第六批狂犬病免疫球蛋白國家標(biāo)準品分別在不同溫度條件（4、25和37℃）放置不同時間（1、2、3和4周），于不同時間點分別取3支樣品，于-20℃保存，待所有樣本采集完成后進行統(tǒng)一檢測，考察候選標(biāo)準品的穩(wěn)定性。

采用RFFIT法，將標(biāo)準品用1.0 mL滅菌注射用水復(fù)溶后，進行抗體效價檢測。統(tǒng)計學(xué)方法同1.3項，用時間變量代替瓶間變量。

2 結(jié)果

2.1 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果匯總 在截止日期，10家實驗室中有8家返回有效實驗數(shù)據(jù)，各實驗室采用MNT方法標(biāo)定的幾何變異系數(shù)（geometric coefficients of variations，GCV）在5.7%～21.9%之間，采用RFFIT方法標(biāo)定的GCV在3.3%～9.5%之間，變異范圍均可接受。見表2。

表2 第六批狂犬病人免疫球蛋白國家標(biāo)準品協(xié)作標(biāo)定結(jié)果匯總Tab.2 Results of collaborative calibration of the 6th national standard for rabies human immunoglobulin

2.2 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果分析與賦值 將有效數(shù)據(jù)進行匯總分析，兩種方法的有效數(shù)據(jù)均為35個，MNT法協(xié)作標(biāo)定的幾何均值為35.4 IU／mL，95%可信限為32.6～38.2 IU／mL；RFFIT法協(xié)作標(biāo)定的幾何均值為38.7 IU／mL，95%可信限為36.8～40.6 IU／mL；兩種方法95%可信限的重疊區(qū)間為36.8～38.2 IU／mL。兩種方法的幾何均值為37.0 IU／mL，即第六批狂犬病人免疫球蛋白國家標(biāo)準品（批號：250011-2013-06）的最終賦值為37.0 IU／mL（適用于MNT法和RFFIT法）。

2.3 均勻性檢驗結(jié)果 均勻性檢驗結(jié)果見表3。數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析，根據(jù)給定的顯著性水平α=0.05及自由度（15，32），查F表得臨界值F0.05=2.02，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析得均勻性檢驗的統(tǒng)計量F=1.06，可得F

表3 第六批狂犬病人免疫球蛋白國家標(biāo)準品均勻性考察Tab.3 Uniformity of the 6th national standard for rabies human immunoglobulin

2.4 穩(wěn)定性檢驗結(jié)果 穩(wěn)定性檢驗結(jié)果見表4。數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析，根據(jù)給定的顯著性水平α=0.05及自由度（3，8），查F表得臨界值F0.05=4.07，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析可得4℃穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F1=0.74，25℃穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F2=0.77，37℃穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F3=0.69，比較得出F1

表4 第六批狂犬病人免疫球蛋白國家標(biāo)準品穩(wěn)定性考察Tab.4 Stability of the 6th national standard for rabies human immunoglobulin

3 討論

狂犬病病毒暴露后，除了要及時進行傷口清洗處理和接種人用狂犬病疫苗外，Ⅲ級暴露者還需使用RIG。在全球數(shù)十年的大規(guī)模應(yīng)用后，RIG已被證實對PEP安全有效［7］。

RIG類制品的最早使用歷史可追溯至1889年，Babes和Lepp首次記錄了狂犬病免疫血清的制備。經(jīng)近60年的摸索和驗證，RIG的有效性在1945年最終被Habel所證實。聯(lián)合使用疫苗和RIG的方式成為1966年WHO狂犬病專家咨詢委員會推薦的狂犬病暴露后處置程序［8］。

人體注射狂犬病疫苗約7 d后產(chǎn)生抗體，約14 d后抗體能達到0.5 IU／mL的保護性水平，對于風(fēng)險最高的Ⅲ級暴露者，在疫苗產(chǎn)生有效保護抗體之前使用RIG中和傷口內(nèi)的病毒、阻止病毒進入神經(jīng)組織是PEP關(guān)鍵的一步。因此，作為一種被動免疫制劑，RIG的質(zhì)量控制尤其是其抗體效價的評價就顯得尤為重要。

WHO推薦的中和抗體檢測方法為MNT和RFFIT［9］，這兩種方法從2015年開始同時被我國藥典收錄，各實驗室可根據(jù)自身實驗條件選擇適合自己的檢測方法。MNT法是最早應(yīng)用的中和抗體檢測方法，其基本原理是將待測樣品進行系列稀釋，以固定量的狂犬病病毒CVS株中和樣品中的中和抗體，小鼠腦內(nèi)接種檢測半數(shù)保護指數(shù)（ED50），從而計算出抗體效價，該方法檢驗周期較長，需14 d。RFFIT是基于細胞培養(yǎng)的微量中和試驗，基本原理是將待測樣品進行系列稀釋后，以固定量的狂犬病病毒CVS-11株中和樣品中的中和抗體，再以培養(yǎng)細胞測定未被中和的CVS-11毒株，通過直接熒光抗體試驗結(jié)果計算抗體效價，該方法可在48 h內(nèi)完成檢測，方便快捷［10］。鑒于此，本研究采用兩種方法對新標(biāo)準品進行協(xié)作標(biāo)定。

協(xié)作標(biāo)定的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析［11］，MNT法的賦值為35.4 IU／mL，95%可信限為32.6～38.2 IU／mL；RFFIT法的賦值為38.7 IU／mL，95%可信限為36.8～40.6 IU／mL。參照WHO對標(biāo)準品賦值的指導(dǎo)原則［12］和第二批狂犬病免疫球蛋白國際標(biāo)準品的賦值方法［13］以及NIBSC的工作建議［14］，對兩種方法協(xié)作標(biāo)定的結(jié)果取幾何均值即為本次標(biāo)準品的賦值。兩種方法測得的幾何均值為37.0 IU／mL，即第六批狂犬病人免疫球蛋白國家標(biāo)準品（批號：250011-201306）的最終賦值為37.0 IU／mL（適用于MNT法和RFFIT法），兩種方法的95%可信限的重疊區(qū)間為36.8～38.2 IU／mL。

均勻性是標(biāo)準物質(zhì)的一個重要特性，標(biāo)準物質(zhì)是否均勻，通常隨機抽取一定比例的最終包裝單元，采用精密度高的檢驗方法，將抽取的樣品在相同的實驗條件下進行測定，使各樣品間的差異大小由樣品的不均勻程度反映出來［4］。方差分析檢驗是均勻性最常用的統(tǒng)計學(xué)方法，此方法是通過比較組間方差和組內(nèi)方差的大小來判斷各組測量值之間有無系統(tǒng)性差異，如兩者比值小于方差分析的臨界值，則認為樣品是均勻的，反之樣品是不均勻的。本研究采用復(fù)溶后能體現(xiàn)離子濃度的pH值來考察新標(biāo)準品的均勻性，結(jié)合自由度（15，32）和給定的檢驗水平0.05查方差表臨界值F0.05=2.02，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)計算均勻性檢驗的方差值F=1.06，可得F

標(biāo)準物質(zhì)的穩(wěn)定性考察包括短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性，本標(biāo)準品的長期穩(wěn)定性我們會開展長期監(jiān)測工作積累數(shù)據(jù)。本研究只對短期穩(wěn)定性指標(biāo)進行考察，短期穩(wěn)定性是指標(biāo)準物質(zhì)在運輸過程中的穩(wěn)定性，通常采取放置不同時間（1、2、3和4周）和不同溫度（一般放置4、25、37℃）后進行抗體效價測定來評估［6］。結(jié)合自由度（3，8）和給定的檢驗水平0.05查得方差臨界值F0.05=4.07，經(jīng)方差分析可知，4℃放置不同時間的穩(wěn)定性檢驗統(tǒng)計量F1=0.74，25℃放置不同時間的穩(wěn)定性檢驗統(tǒng)計量F2=0.77，37℃放置不同時間穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F3=0.69，比較得出F1

綜上所述，本研究建立了第六批狂犬病人免疫球蛋白國家標(biāo)準品（批號：250011-201306），完成賦值及均勻性和穩(wěn)定性考察，可用于RIG類制品的質(zhì)量控制。