劉丹，張永慧，何秀貞，熊書，馬羚，馮彬彬，馮曉靈

重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校三峽庫區(qū)道地藥材開發(fā)利用重慶市重點實驗室，重慶 404020

原發(fā)性肝癌分為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和HCC-ICC混合型。HCC占原發(fā)性肝癌的85%～90%［1］。肝癌的治療方式包括手術(shù)、局部消融、介入療法、放療及系統(tǒng)治療［2］。由于HCC發(fā)病隱匿，易轉(zhuǎn)移，大部分患者就診時已失去手術(shù)時機，因此，探索治療HCC的新藥物成為基礎(chǔ)和臨床研究熱點之一。

木香（Aucklandiae radix）為菊科植物，具有行氣、止痛、健脾、消食的功效［3］。木香烴內(nèi)酯（costunolide，Cos）是從木香植物中提取的一種倍半萜類內(nèi)酯化合物，具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗微生物等作用［4-6］。有研究顯示，Cos通過激活凋亡和自噬途徑，產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9，來抑制人卵巢癌細胞的生長［7］；體內(nèi)和體外試驗證明，Cos通過線粒體途徑誘導(dǎo)人胃腺癌BGC-823細胞的凋亡［8］，還可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介導(dǎo)IRE1α-JNK的激活，誘導(dǎo)肺癌A549細胞發(fā)生線粒體途徑凋亡［9］。另有研究表明，ERS與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10］，Cos在誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡中的作用尚未明確。因此，本研究通過流式細胞術(shù)及Western blot法檢測Cos對人肝癌SMMC-7721細胞凋亡的影響，探討其作用機制與ERS通路的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細胞 肝癌SMMC-7721細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.2 主要試劑Cos購自上海源葉生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、RIPA裂解液（強）及PMSF（100 nmol／L）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMSO購自美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清均購自美國Gibco公司；細胞凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；小鼠抗Bcl-2、Bax、Caspase-3、GRP78、CHOP、ATF4及β-actin單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及分組 參考文獻［11-12］方法，將SMMC-7721細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d進行1次傳代。取第2代對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞，隨機分為對照組及10、20、30 μmol／L Cos劑量組，于37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4 Cos對人肝癌SMMC-7721細胞凋亡影響的檢測采用流式細胞術(shù)。取各組SMMC-7721細胞，按每孔106個接種至6孔板，于37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；收集細胞，用預(yù)冷PBS洗滌3次，Binding Buffer重懸，加入Annexin V-FITC，混勻，于室溫避光孵育10 min；100×g離心5 min，取沉淀，用190 μL Binding Buffer重懸細胞，加入10 μL PI，4℃避光孵育15 min，立即用流式細胞儀進行檢測，試驗重復(fù)3次。應(yīng)用FlowJo V10軟件進行分析，以處于早期和晚期凋亡細胞所占總細胞數(shù)的比例為細胞凋亡率（apoptosis rate，AR）。

1.5 Cos對人肝癌SMMC-7721細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達水平影響的檢測 采用Western blot法。取各組SMMC-7721細胞，RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)12.5% SDS-PAGE分離蛋白后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用封閉液（含Tween 20的Tris-HCl，pH 8.0）于室溫封閉10 min；加入小鼠抗Bcl-2、Bax、Caspase-3及β-actin單克隆抗體（均1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜；用TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶3 000稀釋），37℃搖床孵育1 h；用TBST洗滌3次，ECL法顯色。試驗重復(fù)3次。

1.6 Cos對人肝癌SMMC-7721細胞中ERS通路相關(guān)蛋白表達水平影響的檢測 取對照組、10及20 μmol／L Cos劑量組SMMC-7721細胞，采用Western blot法檢測細胞中GRP78、CHOP、ATF4的表達水平，其中一抗為小鼠抗GRP78、CHOP、ATF4（均1∶1 000稀釋）及β-actin（1∶3 000稀釋）單克隆抗體，其他檢測步驟同1.5項。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cos對SMMC-7721細胞凋亡的影響10、20和30 μmol／L Cos劑量組及對照組SMMC-7721細胞AR分別為（6.73±1.26）%、（33.09±4.17）%、（80.75±1.23）%和（4.31±0.23）%。10、20和30 μmol／L Cos劑量組SMMC-7721細胞AR均明顯高于對照組（t分別為2.682、9.744、86.78，P均＜0.05）；各Cos劑量組SMMC-7721細胞AR隨劑量的增加而上升，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為8.556和59.61，P均＜0.01）。見圖1。表明Cos可誘導(dǎo)SMMC-7721細胞凋亡，且呈劑量依賴性。

圖1 流式細胞術(shù)檢測Cos對SMMC-7721細胞凋亡的影響Fig.1 Flow cytometry of effect of Cos on apoptosis of SMMC-7721 cells

2.2 Cos對SMMC-7721細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響 與對照組比較，20和30 μmol／L Cos劑量組SMMC-7721細胞中Bcl-2蛋白表達水平明顯降低（t分別為3.060和3.935，P均＜0.05），Bax蛋白表達水平均明顯增加（t分別為3.578和3.666，P均＜0.05），10 μmol／L Cos劑量組的Bcl-2及Bax蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為1.121和1.158，P均＞0.05）；各Cos劑量組SMMC-7721細胞中Caspase-3蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為0.785、1.786、2.345，P均＞0.05）。見圖2和圖3。表明Cos可上調(diào)人肝癌SMMC-7721細胞Bax的表達，下調(diào)Bcl-2表達，誘導(dǎo)SMMC-7721細胞凋亡。

圖2 Western blot法檢測Cos對SMMC-7721細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響Fig.2 Western blotting of effect of Cos on expressions of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 proteins in SMMC-7721 cells

圖3 各組SMMC-7721細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表達水平Fig.3 Expression levels of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 proteins in SMMC-7721 cells of various groups

2.3 Cos對人肝癌SMMC-7721細胞中ERS通路相關(guān)蛋白表達水平的影響 與對照組比較，10、20 μmol／L Cos劑量組SMMC-7721細胞中GRP78、CHOP、ATF4蛋白的表達水平均明顯升高（t分別為2.837～6.054，P均＜0.05），見圖4和圖5。

圖4 Westernblot法檢測Cos對SMMC-7721細胞中GRP78、CHOP、ATF4蛋白表達的影響Fig.4 Western blotting of effect of Cos on expressions of GRP78，CHOP and ATF4 proteins in SMMC-7721 cells

圖5 各組SMMC-7721細胞中GRP78、CHOP、ATF4蛋白的表達水平Fig.5 Expression levels of GRP78，CHOP and ATF4 proteins in SMMC-7721 cells of various groups

3 討論

木香是抗癌復(fù)方中常使用的一味中藥，其抗腫瘤作用的有效成分為Cos及去氫木香內(nèi)酯（dehydrocostus Lactone，DL）。Cos對多種腫瘤細胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用，如Cos通過激活絲裂原活化蛋白激酶和產(chǎn)生ROS，增強阿霉素誘導(dǎo)的前列腺癌細胞凋亡［13］。有研究表明，Cos和DL聯(lián)合用藥可通過c-Myc／p53和AKT／14-3-3信號通路誘導(dǎo)乳腺癌細胞周期阻滯和凋亡［14］。

目前，關(guān)于Cos抑制人肝癌SMMC-7721細胞的研究較少，且分子機制尚未明確，因此本研究探討了Cos對肝癌SMMC-7721細胞的影響及潛在的分子作用機制。本研究將SMMC-7721細胞分為對照組及10、20、30 μmol／L Cos劑量組，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，10、20和30 μmol／L Cos作用SMMC-7721細胞48 h可顯著提高細胞凋亡率（P＜0.05），且呈劑量依賴性；Western blot檢測結(jié)果表明，與對照組比較，20和30 μmol／L Cos組SMMC-7721細胞中Bcl-2表達水平明顯降低（P＜0.05），Bax蛋白水平均明顯升高（P＜0.05），Caspase-3差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示Cos可誘導(dǎo)SMMC-7721細胞凋亡。有研究已證實，槲皮素通過激活p-STAT3／Bcl-2通路誘導(dǎo)ERS進而觸發(fā)卵巢癌細胞凋亡和自噬［15］；Cos還可通過活性氧介導(dǎo)的ERS和JNK途徑誘導(dǎo)人U2OS細胞凋亡［16］。提示Cos誘導(dǎo)的ERS參與了細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，Cos作用SMMC-7721細胞48 h后，GRP78、CHOP、ATF4表達明顯上調(diào)（P＜0.05），Cos促進SMMC-7721細胞凋亡可能是通過ERS途徑誘導(dǎo)實現(xiàn)的。

綜上所述，Cos可通過激活ERS通路促進肝癌細胞SMMC-7721凋亡，這可能是一種新的抗肝癌細胞的作用機制，但Cos對肝腫瘤動物模型的作用還需進一步研究。本研究為Cos用于肝癌的臨床治療提供了實驗依據(jù)。