梁夢迪 尹楠楠 李藤藤 王 月 張 震 王煥南

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，日照 276826)

海洋微生物作為生物活性代謝物最豐富的來源之一，是先導(dǎo)化合物的重要源泉[1-3]。海洋真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物分子質(zhì)量相對較小，但活性優(yōu)良，多數(shù)化合物具有抗腫瘤、抗病毒、抗AD、免疫抑制和酶抑制等作用[4-6]。微生物變異是生物進(jìn)化的基礎(chǔ)推動(dòng)力[7]，然而在人工培養(yǎng)的單一穩(wěn)定環(huán)境下，微生物大部分基因簇通常處于沉默狀態(tài)[8]，很多基因未能完全表達(dá)，而自然選育耗時(shí)長，工作量大且效率低。人工誘變育種可采用加入誘變劑、紫外照射、微波等加速微生物突變，從而在相對較短的時(shí)間內(nèi)獲得有實(shí)用價(jià)值的突變體，改善菌株特性[9-11]。本研究基于前期從牡蠣中分離得到的真菌Alternariaalternata，通過化學(xué)、物理以及復(fù)合誘導(dǎo)調(diào)控等方法，以期激活真菌的沉默基因簇，充分發(fā)掘微生物次級代謝的潛力，為獲得大量新型結(jié)構(gòu)活性天然產(chǎn)物提供信息支持。

1 材料和試劑

1.1 主要試劑和儀器

葡萄糖、麥芽糖、乙酸乙酯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；UN1Q-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工公司)；瓊脂粉(青島海博生物公司)；乙酰膽堿酯酶(蒼蠅頭部)、碘代硫代乙酰膽堿、DTNB、胰蛋白胨、DPPH、磷酸二氫鈉、硫酸二乙酯(DES)、抗壞血酸等購自上海源葉生物科技有限公司。

恒溫振蕩培養(yǎng)箱(天津市萊玻特瑞公司)；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海精宏公司)；電泳儀(北京六一公司)；離心機(jī)(賽默飛公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰公司)；立式蒸汽滅菌器(上海博訊公司)；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗公司)；高效液相色譜儀(島津公司)；PCR擴(kuò)增儀(美國伯樂公司)；全功能酶標(biāo)儀(美國伯騰公司)。

1.2 方法

1.2.1菌種來源 本實(shí)驗(yàn)室前期從日照海域野生牡蠣中分離得到的真菌，經(jīng)菌種鑒定為鏈格孢菌Alternariaalternata，命名為YS-4。金黃色葡萄球菌(S.aureus)和大腸桿菌(E.coli)-80℃保存于藥學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

1.2.2菌株誘變 1)DES誘變。適量YS-4菌體接種至PDB培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7d，得到菌懸液。取適量菌懸液至5mL離心管中，充分研磨，測定其吸光度，用PDB培養(yǎng)基稀釋，進(jìn)行菌液濃度的預(yù)篩選。取700μL菌懸液置1.5mL離心管中，分別加入0、1、2、4、6、8、10μL DES，DMSO補(bǔ)至1000μL，混勻，放置4℃，按表1進(jìn)行誘變劑濃度的預(yù)篩選，12h和24h后分別于取菌懸液涂布、培養(yǎng)，連續(xù)觀察15d，及時(shí)分離出新的菌株[12]。

表1 化學(xué)誘變劑(DES)濃度

2)紫外誘變。菌懸液制備過程同1)，取菌懸液置PDA培養(yǎng)基，涂布，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，取出用20W紫外燈照射，照射距離20cm，照射時(shí)間分別為0、3、5、10、15、20、40、60、120、180、360s，密封放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)觀察15d，及時(shí)分離出新的菌株[13]。

3)微波誘變。菌懸液制備過程同1)，取1mL菌懸液加入1.5mL EP管中，將EP管放置在冷卻后燒杯中，用微波分別處理0、10、20、30、40、50、60s，密封、4℃冷藏12h涂布培養(yǎng)，連續(xù)觀察15d，及時(shí)分離出新的菌株[14-15]。

4)復(fù)合誘變。0.4% DES處理24h后，取200μL菌懸液置PDA培養(yǎng)基涂布培養(yǎng)12h，紫外照射60s，重新放至恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)觀察15d，及時(shí)分離出新的菌株。

1.2.3穩(wěn)定性考察 挑取誘變菌株的菌絲(母代)適量，在新PDA培養(yǎng)基上劃線，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～15d，同種方法連續(xù)10代接種培養(yǎng)，觀察突變株的生長形態(tài)，以確定突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.4菌種鑒定 將誘變菌株接種至PDB培養(yǎng)基上，搖床中培養(yǎng)3～7d，吸取菌體至1.5mL EP管中，離心，棄上清，將菌體于冰浴中充分研磨，根據(jù)UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，基于18S基因序列將提取得到的DNA，采用真菌通用引物ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTC GTAACAAGG-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(1μL上、下游引物+10μL Mix+3μL DNA+6μL dd H2O)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，送至蘇州金唯智公司測序?；蛐蛄薪?jīng)Genbank數(shù)據(jù)庫Blast對比，采用MEGA7.0軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

1.2.5誘變菌株代謝產(chǎn)物的提取 挑取適量誘變菌株的菌絲轉(zhuǎn)移至500mL PDB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10～15d。將發(fā)酵液經(jīng)離心、萃取得乙酸乙酯層，濃縮得粗浸膏，備用。

1.2.6色譜條件 采用Wondasil C18 Superb(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，以水(A)-甲醇(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(0～40min，5%B～100%B；40～50min，100%B；50～60min，100%B～5%B)，流速為0.8mL/min，檢測波長為254nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量為10μL。

1.2.7生物活性測定 1)ACh E抑制活性測定。參照表2，配制總體積為700μL的反應(yīng)體系，37℃水浴260s，取200μL轉(zhuǎn)移至96孔板中，平行3個(gè)復(fù)孔。412nm處測定其OD值，按公式計(jì)算其抑制率，鹽酸多奈哌齊(Donepezil)為陽性對照。抑制率%=[(AⅡ-AⅠ)-(AⅣ-AⅢ)]/(AⅡ-AⅠ)×100%。

表2 Ellman法各組加樣量(μL)

2)體外抗氧化活性測定。參照表3加樣反應(yīng)，517nm處測定其OD值，按下列公式計(jì)算其清除率，VC為陽性對照。清除率(%)=[A陰性-(A樣品-A本底)]/A陰性。

表3 DPPH法各組加樣量(μL)

3)抗菌活性測定。將100μL指示菌的菌懸液均勻涂布在LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12～16h，將培養(yǎng)皿分為四區(qū)并放置濾紙片，每個(gè)區(qū)域分別加入誘變菌株浸膏溶液和YS-4菌株的浸膏溶液(10mg/mL)，DMSO為陰性對照，利福平和氯霉素為陽性對照，恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，分別在12、24、36、48、72h測量其抑菌圈大小。

1.2.8數(shù)據(jù)的處理與分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用MAGE 7.0中鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 YS-4真菌及其突變菌株形態(tài)圖

野生菌株YS-4經(jīng)過DES、紫外、微波以及復(fù)合誘變等方法分離得到48種菌株，經(jīng)過穩(wěn)定性考察后得到6種具有穩(wěn)定遺傳特性的突變菌株，其形態(tài)圖見圖1。

圖1 YS-4及其誘變菌株的形態(tài)圖

2.2 突變菌株的菌種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

基于18S基因序列，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。野生菌株經(jīng)誘變得到穩(wěn)定遺傳的菌株分別為聚多曲霉(Aspergillussydowii)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、皮落青霉(Penicilliumcrustosum)、指狀擬青霉(paecilomycesdactylethromorphus)、糙刺籃狀菌(Talaromycessp)和青霉菌(Penicilliumsp)。

圖2 誘變菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 突變菌株代謝產(chǎn)物的HPLC分析

與野生菌株YS-4粗提物的HPLC圖譜相比，在波長254nm下，突變菌株YB-1和YB-17不同保留時(shí)間出現(xiàn)明顯新峰，說明其突變菌株出現(xiàn)了新的次級代謝產(chǎn)物。見圖3。

圖3 誘變菌株代謝產(chǎn)物的HPLC分析

2.4 突變菌株代謝產(chǎn)物的生物活性

2.4.1乙酰膽堿酯酶的抑制活性 采用Ellman法研究菌株代謝產(chǎn)物對ACh E的抑制活性。樣品終濃度為200μg/μL時(shí)，野生真菌YS-4的粗提物對ACh E活性抑制率為45.22%，而突變菌株YB-1、YB-17 和YB-23對ACh E抑制活性增強(qiáng)，其抑制率分別為55.86%、60.31%和49.67%， Donepezil為陽性對照，抑制率為75.50%(50μg/μL)。見圖4。

圖4 YS-4及誘變菌株代謝產(chǎn)物對AChE活性抑制作用

2.4.2抗氧化活性 采用DPPH自由基清除法研究菌株代謝產(chǎn)物的體外抗氧化活性。與YS-4相比(清除率為15.62%)，濃度為100μg/μL時(shí)，突變菌株YB-1、YB-17、YB-25對DPPH自由基的清除能力均有明顯提高，清除率分別為41.72%、36.85%和23.59%。見圖5。

圖5 YS-4及誘變菌株的代謝產(chǎn)物對DPPH自由基清除作用

2.4.3抗菌活性 與YS-4相比(抑菌圈直徑為12mm)，YB-17、YB-23和YB-24對金黃色葡萄球菌的抑制作用增強(qiáng)，其粗提物(10mg/mL)抑菌圈直徑分別為20、16和19mm，所有菌株對大腸桿菌E.coli無抑制作用。見表4。

表4 不同真菌對受試菌種的抑菌圈直徑

3 結(jié)論

通過對野生牡蠣內(nèi)生真菌YS-4誘變育種，得到6株具有穩(wěn)定遺傳特性的突變菌株，分別為聚多曲霉(Aspergillussydowii)，煙曲霉(Aspergillusfumigatus)，皮落青霉(Penicilliumcrustosum)，指狀擬青霉(Paecilomycesdactylethromorphus)，糙刺籃狀菌(Talaromycessp)和青霉菌(Penicilliumsp)。HPLC圖譜分析可知，突變菌株YB-1和YB-17的代謝產(chǎn)物更為豐富；生物活性結(jié)果表明，突變菌株YB-1、YB-17和YB-23對AchE具有良好的抑制作用，抑制率分別為55.86%、60.31%和49.67%；YB-1、YB-17和YB-25對DPPH自由基的清除能力較強(qiáng)，清除率分別達(dá)41.72%、36.85%和23.59%；YB-17、YB-23和YB-24對金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用。本研究通過誘變方法激活牡蠣內(nèi)生真菌的沉默基因簇，得到次級代謝產(chǎn)物具有良好生物活性的目標(biāo)菌株，為進(jìn)一步活性化合物的分離奠定基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。