李金輝 孫春山 劉 磊

(鄭州人民醫(yī)院，鄭州 450000)

膀胱癌是世界常見的惡性腫瘤之一，全球每年發(fā)病約100萬，居世界第9位[1]。膀胱尿路上皮癌是膀胱癌最主要的病理類型，約占90%；目前，外科手術(shù)是膀胱癌最主要的治療手段，70%～80%的非肌層浸潤性膀胱癌預(yù)后良好，但有部分患者預(yù)后并不理想[2]。非編碼RNA在膀胱癌中的意義已逐漸引起重視[3-5]。長鏈非編碼RNA(Long non-code RNA,lncRNA)MIR4435-2HG又稱AGD2、MORRBID、LINC00978和lncRNA-AWPPH，在肝癌和肺癌等多種腫瘤中異常高表達，且與患者預(yù)后不良密切相關(guān)[6-7]；然而，未見關(guān)于MIR4435-2HG和膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后關(guān)系的報道。有研究指出，MIR4435-2HG可通過靶向下調(diào)miR-128-3p表達在卵巢癌中發(fā)揮促癌作用[8]，且miR-128-3p已被證實可抑制膀胱癌細胞的侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[9]。因此，本研究通過檢測MIR4435-2HG和miR-128-3p在膀胱尿路上皮癌中的表達情況，分析兩者對患者預(yù)后的影響，旨在為膀胱尿路上皮癌臨床診斷和預(yù)后評估提供新線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年8月-2019年10月于鄭州人民醫(yī)院泌尿外科行膀胱癌切除術(shù)的膀胱尿路上皮癌患者87例，其中男51例，女36例，年齡38～72歲，平均年齡(56.97±7.21)歲。納入標(biāo)準：1)經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為膀胱尿路上皮癌；2)術(shù)前未接受任何放療、化療和靶向治療等。排除標(biāo)準：1)患有心血管疾病、肝臟系統(tǒng)疾病和合并其他腫瘤者；2)有遠端轉(zhuǎn)移的患者；3)有全身性感染者。手術(shù)獲取患者腫瘤組織樣本和距腫物邊緣>1 cm的正常膀胱黏膜組織(癌旁組織，鏡下未見癌細胞)樣本，置入凍存管后于液氮中保存?；颊咝g(shù)后均接受隨訪，隨訪截止2020年10月，隨訪時間12～36個月，平均21.5個月。本研究經(jīng)鄭州人民醫(yī)院倫理委員會批準同意，且所有參與者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

實時熒光定量PCR檢測MIR4435-2HG和miR-128-3p表達。將凍存的腫瘤組織和癌旁組織研磨粉碎后，加入Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取總RNA后，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)說明書將RNA進行反轉(zhuǎn)錄；以產(chǎn)物cDNA為模板，分別參照lnRcute LncRNA和miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明書分別以GAPDH和U6為內(nèi)參采用2-△△Ct法檢測MIR4435-2HG和miR-128-3p表達水平。其中，實驗所需引物(上海生工生物工程股份有限公司合成)如下：MIR4435-2HG正向引物為5’-GACATTCCAGACAAGCGGTG-3’，反向引物為5’-TCCACTTTGCTTGTCAGGGA-3’；miR-128-3p正向引物為5’-GGTCACAGTGAACCGGTC-3’，反向引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；GAPDH正向引物為5’-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3’，反向引物為5’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’；U6正向引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3’，反向引物為5’-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3’。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MIR4435-2HG和miR-128-3p在膀胱尿路上皮癌組織中的表達

膀胱尿路上皮癌組織中MIR4435-2HG表達水平(4.57±1.03)明顯高于癌旁組織(2.43±0.96)(t=14.176，P<0.05)，而膀胱尿路上皮癌組織miR-128-3p表達水平(0.38±0.03)明顯低于癌旁組織(0.57±0.08)(t=20.742，P<0.05)。

2.2 MIR4435-2HG和miR-128-3p表達與膀胱尿路上皮癌患者臨床病理特征的關(guān)系

以膀胱尿路上皮癌組織中MIR4435-2HG和miR-128-3p表達水平的平均值為界限，分別將87例患者分為MIR4435-2HG高表達組(44例)、MIR4435-2HG低表達組(43例)和miR-128-3p高表達組(39例)、miR-128-3p低表達組(48例)。MIR4435-2HG低表達組和MIR4435-2HG高表達組患者在病理分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而miR-128-3p低表達組和miR-128-3p高表達組患者在各資料方面均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 MIR4435-2HG和miR-128-3p與膀胱尿路上皮癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 MIR4435-2HG和miR-128-3p表達與膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后的關(guān)系

隨訪截止時，MIR4435-2HG高表達組患者中位生存期27個月，總生存率為36.68%，明顯低于MIR4435-2HG低表達組中位生存期32個月，總生存率66.80%(χ2=9.768，P<0.05)；而miR-128-3p高表達組患者中位生存期32個月，總生存率為68.17%，明顯高于miR-128-3p低表達組中位生存期27個月，總生存率39.89%(χ2=7.574，P<0.05)。見圖1。

圖1 MIR4435-2HG(A)和miR-128-3p(B)表達與膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.4 膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后因素分析

單因素COX回歸分析結(jié)果顯示，高病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、MIR4435-2HG高表達和miR-128-3p低表達是影響膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后的危險因素(P<0.05)；進一步多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、MIR4435-2HG高表達和miR-128-3p低表達是影響膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)。見表2和表3。

表2 膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后的單因素COX回歸分析

表3 膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后的多因素COX回歸分析

2.5 膀胱尿路上皮癌組織中MIR4435-2HG與miR-128-3p表達相關(guān)性分析

在膀胱尿路上皮癌組織中，MIR4435-2HG與miR-128-3p表達呈負相關(guān)(r=-0.544，P<0.05)。見圖2。

圖2 膀胱尿路上皮癌組織中MIR4435-2HG與miR-128-3p表達的相關(guān)性

3 討論

膀胱尿路上皮癌的發(fā)生是一種多因素、多步驟的復(fù)雜過程，與基因調(diào)控密切相關(guān)[5,11]。非編碼RNA是一類不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，約占人類基因組的98%，這其中包括10萬多種lncRNA和約2500種miRNA[12]。越來越多的證據(jù)顯示，在腫瘤中存在著異常表達的lncRNA和miRNA，可通過調(diào)控癌細胞生物學(xué)行為發(fā)揮致癌或抑癌作用，檢測其表達則有利于腫瘤的早期診斷和預(yù)后評估[13-14]。目前，臨床上多依靠腫瘤分級來指導(dǎo)膀胱尿路上皮癌的治療和預(yù)后，缺乏明確的分子標(biāo)志物來指導(dǎo)臨床診療。因此，尋找有效的膀胱尿路上皮癌診斷和預(yù)后評價的分子標(biāo)志物一直是臨床研究的熱點。MIR4435-2HG是一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的lncRNA。MIR4435-2HG在結(jié)直腸癌中表達上調(diào)，其高表達水平與患者TNM分期、治療前癌胚抗原水平和患者總生存率低相關(guān)，被認為是結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[15]。MIR4435-2HG在肺癌中異常高表達，與患者組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且可通過與β-catenin相互作用在癌細胞增殖和侵襲過程中發(fā)揮著重要的促進作用[16]。MIR4435-2HG在腎細胞癌中發(fā)揮著重要的致癌作用，其高表達提示預(yù)后不良[17]。MIR4435-2HG在膀胱癌組織和細胞中表達上調(diào)，且可通過海綿性吸附miR-4288促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲[18]，但其在臨床上的表達意義及與患者預(yù)后的關(guān)系并不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，MIR4435-2HG在87例膀胱尿路上皮癌組織中表達異常高于癌旁組織，且其表達水平與患者病理分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。這提示MIR4435-2HG可能參與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展過程。另外，本研究對膀胱尿路上皮癌患者進一步隨訪發(fā)現(xiàn)，MIR4435-2HG高表達患者生存率明顯低于MIR4435-2HG低表達患者，提示MIR4435-2HG與患者預(yù)后有關(guān)，MIR4435-2HG有可能成為判斷膀胱尿路上皮癌預(yù)后的生物指標(biāo)之一。

miR-128-3p是miRNA家族成員，在宮頸癌和肺癌等中表達下調(diào)，且可通過多種機制參與腫瘤的發(fā)病機制[19-20]。其在肝癌中也表達下調(diào)，通過PI3K/AKT通路調(diào)控細胞增殖與遷移而發(fā)揮抑癌作用，且miR-128-3p低表達患者有著較短的無病生存期，因此被認為是肝癌患者的預(yù)后標(biāo)志物[21]。有研究顯示，miR-128-3p在食管鱗癌中表達下調(diào)，與患者預(yù)后不良有關(guān)，且可通過靶向調(diào)控ZEB1抑制癌細胞轉(zhuǎn)移[22]?，F(xiàn)有miR-128-3p和膀胱尿路上皮癌的研究多集中在生物學(xué)功能方面[9]，其在膀胱癌臨床中的意義并不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)miR-128-3p在87例膀胱尿路上皮癌組織中異常低表達，提示miR-128-3p可能與膀胱癌惡性進展有關(guān)。此外，miR-128-3p低表達患者生存率較miR-128-3p高表達患者明顯縮短，miR-128-3p低表達與膀胱癌患者預(yù)后不良有關(guān)。lncRNA參與調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機制十分復(fù)雜，而其與miRNA相互作用是其中重要的一方面，lncRNA可通過海綿樣吸附作用競爭性結(jié)合miRNA，進而使miRNA調(diào)控基因的作用受到抑制[23]。目前，關(guān)于MIR4435-2HG的致癌作用機制的研究也多集中在其與miRNA包括miR-487a、miR-802和miR-206等的作用方面[7,24-25]。有研究通過生物信息學(xué)軟件在卵巢癌中預(yù)測發(fā)現(xiàn)，MIR4435-2HG可與miR-128-3p靶向結(jié)合，可通過下調(diào)miR-128-3p表達影響卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡而發(fā)揮促癌作用[8]。本研究進一步進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，膀胱尿路上皮癌組織中MIR4435-2HG與miR-128-3p之間存在呈負相關(guān)。MIR4435-2HG可能結(jié)合miR-128-3p抑制其表達進而參與膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展過程，但具體的調(diào)控作用及途徑還有待進一步探討。

綜上所述，膀胱尿路上皮癌組織中MIR4435-2HG表達上調(diào)，而miR-128-3p表達下調(diào)，兩者存在負相關(guān)且均與患者預(yù)后不良有關(guān)，MIR4435-2HG和miR-128-3p可能是膀胱尿路上皮癌早期診斷和預(yù)后評估的潛在靶分子。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。