劉錦裕，謝錦來(lái)，謝建兵

(福建省莆田學(xué)院附屬醫(yī)院 泌尿外科，福建 莆田 351100)

膀胱癌是我國(guó)泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，男性發(fā)病率位于全身惡性腫瘤第7位[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)2002年世界男性膀胱癌標(biāo)準(zhǔn)化死亡率約4/10萬(wàn)，女性約1.3/10萬(wàn)，男性約為女性的3～4倍[2]。膀胱癌已嚴(yán)重威脅人類的健康。組織因子途徑抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)是一種 Kunitz 型蛋白酶抑制劑，在人類心、肝、腎等正常組織中廣泛表達(dá)[3]。研究發(fā)現(xiàn)TFPI-2可降低多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力，如乳腺癌[4]、肺癌[5]、甲狀腺癌[6]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[7]等。至于TFPI-2是否可降低膀胱癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力有待進(jìn)一步研究。本研究旨在探討TFPI-2與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，并探討其可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2011年7月-2014年7月在莆田學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科確診為膀胱癌并進(jìn)行手術(shù)的患者共60例，男性45例，女性15例，年齡38～75歲，中位年齡(55.3±6.5)歲。其中非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌39例，浸潤(rùn)性膀胱癌21例，標(biāo)本均取癌組織及癌旁正常組織各1份(術(shù)后病理證實(shí))。所取標(biāo)本均放在-80 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

EliVision plus試劑盒、TFPI-2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆抗體(Vascular endothelical growth factor monodonal antibody，VEGF MCAb)、Real time PCR Master Mix(SYBR Green)、引物合成由某公司合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化

取非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織、浸潤(rùn)性膀胱癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片(連續(xù)切片3張)，免疫組化按福州EliVision plus免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。

1.3.2 Realtime PCR

用Trizol法提取非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織、浸潤(rùn)性膀胱癌和癌旁正常組織總RNA，總cDNA的合成和PCR擴(kuò)增參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。引物：TFPI-2上游引物CAGGAGCCAACAGACTACGG，下游引物AAATTGTTGGCGTTGCCCTC；VEGF上游引物CTGTCTAATGCCCTGGAGCC，下游引物ACGCGAGTCTGTGTTTTTGC；GAPDH上游引物AGATCATCAGCAATGCCTCCT，下游引物TGAGTCCTTCCACGATACCAA。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：TFPI-2：119 bp；VEGF：124 bp；GAPDH：90 bp。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s；60℃退火20 s(TFPI-2、VFGF、GAPDH)，72℃延伸40s；擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。樣品和內(nèi)參均設(shè)3個(gè)重復(fù)組。結(jié)果分析：從儀器中讀出TFPI-2、VEGF及GAPDH在以上3組中的循環(huán)閾值(cycle threshold，ct值)，ΔΔct=實(shí)驗(yàn)組Δct-對(duì)照組△ct，組織含量大小主要是根據(jù)2-ΔΔct大小判定，2-ΔΔct值越大，組織含TFPI-2 mRNA、VEGF mRNA含量越高。2-ΔΔct值>1為目的基因表達(dá)上調(diào)；<1為目的基因表達(dá)下調(diào)。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TFPI-2蛋白在癌旁正常組織、非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織、浸潤(rùn)性膀胱癌組織中的表達(dá)情況

免疫組化顯示TFPI-2主要表達(dá)部位在細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。在癌旁正常組織中TFPI-2高表達(dá)，在膀胱癌組中呈低表達(dá)或不表達(dá)。60例癌旁正常組織中，TFPI-2 蛋白表達(dá)陽(yáng)性者48例，陽(yáng)性率達(dá)80%。60例膀胱癌組織中，TFPI-2 蛋白表達(dá)陽(yáng)性者20例，陽(yáng)性率為33.33%，2組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中39例非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織中，陽(yáng)性有16例，陽(yáng)性率41.03%。21例浸潤(rùn)性膀胱癌組織中，陽(yáng)性只有4例，陽(yáng)性率19.05%，2組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1A、圖1B、圖1C。

VEGF主要表達(dá)部位在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，呈棕黃色。在正常膀胱組織中幾乎不表達(dá)，在膀胱癌組中呈高表達(dá)，尤其是在浸潤(rùn)性膀胱癌組織。60例癌旁正常組織中，VEGF全部不表達(dá)。60例膀胱癌組織中，VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性者50例，陽(yáng)性率為83.33%，2組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中39例非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織中，陽(yáng)性有31例，陽(yáng)性率79.49%。21例浸潤(rùn)性膀胱癌組織中，陽(yáng)性有19例，陽(yáng)性率90.48%，2組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1D、圖1E、圖1F。

2.2 TFPI-2mRNA、VEGF mRNA在癌旁正常組織、非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織、浸潤(rùn)性膀胱癌組織中的表達(dá)情況。

浸潤(rùn)性膀胱癌組和非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組中得TFPI-2mRNA的表達(dá)均明顯低于癌旁組，而 VEGF mRNA的表達(dá)則均明顯高于癌旁組(癌旁組VEGF mRNA幾乎不表達(dá))，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；浸潤(rùn)性膀胱癌組中，TFPI-2mRNA的表達(dá)低于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組，而VEGF mRNA的表達(dá)則高于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 TFPI-2mRNA和VEGF mRNA在不同膀胱組織中的表達(dá)比較

3 討論

膀胱腫瘤是我國(guó)泌尿外科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是一種直接威脅患者生存的疾病。手術(shù)成為膀胱腫瘤主要治療手段，還有放療、化療、介入等治療手段。盡管膀胱癌治療手段多種多樣，但仍不能改變膀胱癌復(fù)發(fā)率高的特性，尤其是浸潤(rùn)性膀胱癌，容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。故目前除了研究手術(shù)、放療、化療方案等，如何降低膀胱腫瘤術(shù)后及放化療后的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移也成為研究熱點(diǎn)之一。

TFPI-2是一種絲氨酸蛋白酶抑制物，它可抑制多種蛋白酶的活性，從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。研究發(fā)現(xiàn)它還可通過(guò)抑制新生血管的生成，從而抑制腫瘤增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移[10、11]。本研究發(fā)現(xiàn)TFPI-2在癌旁正常組織中高表達(dá)，在膀胱癌組中呈低表達(dá)或不表達(dá)，且惡性程度越高，TFPI-2表達(dá)越低。這說(shuō)明了TFPI-2可能與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與血管的生成密切相關(guān)，血管生成可為腫瘤提供養(yǎng)分并為其去除代謝廢物，是腫瘤生長(zhǎng)的必要條件[12、13]。VEGF是一種血管內(nèi)皮分裂素，可通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖從而促進(jìn)血管生成；也可通過(guò)增加血管通透性，導(dǎo)致血漿成分外滲，從而引起腫瘤轉(zhuǎn)移[14]。由此可見(jiàn)VEGF與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)VEGF在正常癌旁組織中幾乎不表達(dá)，在膀胱癌組中呈高表達(dá)，尤其是在浸潤(rùn)性膀胱癌組織中，提示VEGF可能與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本研究應(yīng)用免疫組化和realtime PCR檢測(cè)TFPI-2和VEGF在膀胱癌中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPFI-2在膀胱癌的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，且浸潤(rùn)性膀胱癌的表達(dá)低于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而VEGF的表達(dá)剛好相反，VEGF在正常癌旁組織中幾乎不表達(dá)，在膀胱癌組中呈高表達(dá)，且浸潤(rùn)性膀胱癌的表達(dá)高于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果提示TFPI-2的低表達(dá)和VEGF高表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。TFPI-2可能通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)，從而抑制膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，TFPI-2和VEGF與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有望成為判斷膀胱腫瘤生物學(xué)行為及預(yù)后的重要指標(biāo)。后期可通過(guò)TFPI-2基因轉(zhuǎn)染，甚至動(dòng)物模型的建立，來(lái)進(jìn)一步研究膀胱癌的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移機(jī)制，可為膀胱癌的基因治療提供新的靶向和治療方案。