林曉勝 張麗麗 何 燕 鄭 怡 閆 帥 李愛國

1（中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 上海201800）

2（中國科學(xué)院大學(xué) 北京100049）

3（中國科學(xué)院上海高等研究院 上海201210）

基于同步輻射光源的X射線熒光微探針技術(shù)（Synchrotron Radiation micro X-ray Fluorescence，μ-SRXRF）由于其高探測(cè)靈敏度、對(duì)樣品的低損傷性、可分析厚樣品以及可在大氣和水環(huán)境下測(cè)量等優(yōu)點(diǎn)，為研究生物樣品的化學(xué)元素分布及化學(xué)態(tài)變化提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持，在生物及環(huán)境等研究領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用［1-6］。然而，在常規(guī)μ-SRXRF實(shí)驗(yàn)中，由于探測(cè)器方向上沒有任何限制，在入射光路徑上不同深度的樣品發(fā)射出的X射線熒光（X-ray Fluorescence，XRF）都可被探測(cè)器接收，因此探測(cè)到的XRF圖像不具有深度分辨信息。為獲得深度方向的信息，通常需要對(duì)樣品進(jìn)行切片后再掃描，而切片制樣過程可能破壞樣品的真實(shí)結(jié)構(gòu)。共聚焦μ-SRXRF是一種具有深度分辨的三維元素分析方法［7-13］，其原理最先由Gibson和Kumakhov在1992年提出［14］。當(dāng)入射X射線的焦點(diǎn)與置于探測(cè)器前端的毛細(xì)管光學(xué)元件的焦點(diǎn)重疊時(shí)（即共聚焦?fàn)顟B(tài)），只有焦點(diǎn)重疊區(qū)域的樣品發(fā)射的XRF信號(hào)才能夠滿足全反射條件被探測(cè)器探測(cè)接收，以此來選擇性地采集不同深度的XRF信號(hào)。因此共聚焦μ-SRXRF在生物原位研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

此外，對(duì)于含水量較多的生物樣品，這些樣品在實(shí)驗(yàn)前期的脫水及干燥過程中很可能會(huì)導(dǎo)致其離子成分的丟失或結(jié)構(gòu)的收縮、變形甚至崩解等問題［15-17］，不能完整反映樣品的真實(shí)信息。在μ-SRXRF實(shí)驗(yàn)過程中，由于長時(shí)間受到高通量X射線的照射，生物樣品內(nèi)大量積累的熱量可能會(huì)破壞其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。為獲得可信的結(jié)果，越來越多的研究人員希望無需復(fù)雜的制樣過程就可獲得生物樣品中感興趣元素的二維/三維分布和成像信息，并希望在μ-SRXRF實(shí)驗(yàn)中能夠保持低溫檢測(cè)環(huán)境，可直接對(duì)熱敏感的含水生物樣品進(jìn)行檢測(cè)。國外如歐洲同步輻射光源（European Synchrotron Radiation Facility，ESRF）的ID16A［18］、美 國 先 進(jìn) 光 源（Advanced Photon Source，APS）的21-ID-D［19-20］和德國PETRA III的P06［21］等X射線熒光微探針光束線站都已經(jīng)發(fā)展了針對(duì)生物和環(huán)境樣品的低溫X射線熒光微探針技術(shù)。因此，在上海同步輻射光源（Shanghai Synchrotron Radiation Facility，SSRF）硬X射線微聚焦及應(yīng)用光束線站（BL15U1）發(fā)展共聚焦μ-SRXRF及低溫原位檢測(cè)技術(shù)非常必要，可以擴(kuò)展BL15U1線站的檢測(cè)分析能力，滿足生物和環(huán)境等用戶對(duì)于原位研究的需求，提高其研究結(jié)果的可信度。

1 共聚焦X射線熒光微探針技術(shù)實(shí)驗(yàn)裝置及低溫原位裝置

在上海同步輻射光源BL15U1線站搭建了共聚焦μ-SRXRF的實(shí)驗(yàn)裝置及低溫原位裝置，其示意圖及裝置實(shí)物圖如圖1和圖2所示。

圖1 同步輻射共聚焦X射線熒光微探針裝置和低溫原位裝置的示意圖Fig.1 The schematic of confocalμ-SRXRF setup and in-situ cryogenic device at BL15U1 of the SSRF

圖2 同步輻射共聚焦X射線熒光微探針實(shí)驗(yàn)裝置和低溫原位裝置的實(shí)物圖Fig.2 Physical picture of confocalμ-SRXRF and in-situ cryogenic device at BL15U1 of the SSRF

BL15U1線站采用平面波蕩器（IV-undulator）作為輻射光源，同時(shí)采用雙晶單色器（ΔE/E≈10-4）對(duì)同步輻射光進(jìn)行單色化，光子能量范圍為3.5~22.5 keV。X射線經(jīng)過超環(huán)面鏡和K-B聚焦鏡兩級(jí)聚焦后，在樣品處的光斑大小約為5.6μm×8μm（H×V）。采用日本OKEN公司的S-1329A1型電離室和S-1196A1型電離室分別監(jiān)測(cè)入射光和透射光的強(qiáng)度，由日本Hitachi High-Tech Science America公司的Vortex?-90EX硅漂移探測(cè)器（Silicon Drift Detector，SDD）和美國XIA公司的多道分析器組合的探測(cè)系統(tǒng)采集測(cè)試樣品的XRF信號(hào)。為了減少瑞利散射（Rayleigh scattering）和康普頓散射（Compton scattering）背底，探測(cè)系統(tǒng)與入射光路徑呈90°放置。樣品與入射光路徑呈45°放置，采用德國Allied Vision公司的光學(xué)顯微鏡實(shí)時(shí)觀察樣品的位置。

為限制SDD探測(cè)器的接收范圍，將美國XOS公司的多毛細(xì)管光學(xué)元件（Polycapillary X-ray optics）固定在SDD探測(cè)器前端。多毛細(xì)管光學(xué)元件的焦點(diǎn)距離為2.5 mm，在17.4 keV處的焦點(diǎn)尺寸<10μm（Full Width at Half Maximum，F(xiàn)WHM），在8.0 keV處的傳輸效率為3.1%。通過不斷地調(diào)節(jié)SDD探測(cè)器的位置，使多毛細(xì)管光學(xué)元件的焦點(diǎn)與K-B聚焦鏡的焦點(diǎn)重疊，達(dá)到共聚焦的狀態(tài)。在共聚焦?fàn)顟B(tài)下，探測(cè)系統(tǒng)接收到的XRF信號(hào)是來自共聚焦體積元內(nèi)的信號(hào)。保持共聚焦體積元的位置不變，樣品以10μm的步長沿著光學(xué)顯微鏡視野的深度方向連續(xù)移動(dòng)。當(dāng)SDD探測(cè)器從無到有探測(cè)到樣品的XRF信號(hào)時(shí)，即認(rèn)為共聚焦體積元到達(dá)樣品表面。繼續(xù)沿著光學(xué)顯微鏡視野的深度方向移動(dòng)樣品，使共聚焦體積元在樣品內(nèi)部不同深度移動(dòng)，得到不同深度的化學(xué)元素信息。后期數(shù)據(jù)處理過程中，通過重構(gòu)多個(gè)不同深度的元素分布圖像，就可以實(shí)現(xiàn)三維空間元素分布的分析。

此外，為了在共聚焦μ-SRXRF實(shí)驗(yàn)中能夠保持低溫檢測(cè)環(huán)境，采用英國Oxford Cryosystems公司的液氮低溫系統(tǒng)（Cryostream 800，77 K）保持生物樣品在大氣中處于低溫冷凍狀態(tài)。

2 共聚焦X射線熒光微探針技術(shù)在生物原位研究中的應(yīng)用

擬南芥（Arabidopsis Thaliana）是研究物種自然變異和進(jìn)化的模式植物，在植物科學(xué)研究中占據(jù)重要地位。圖3（b）是利用常規(guī)μ-SRXRF對(duì)擬南芥種子（圖3（a））進(jìn)行原位XRF掃描成像的結(jié)果。由于X射線是從樣品表面45°方向入射的，因此XRF分布圖像與圖3（a）所示的光學(xué)顯微鏡照片不能完全重合。此外，在入射光路徑上不同深度的樣品發(fā)射出的XRF信號(hào)都被探測(cè)器接收，因此該XRF分布圖像不具有深度分辨信息。盡管圖3（b）中Fe的分布顯示與整個(gè)種子胚胎的維管束有關(guān)，但其他化學(xué)元素的空間分布細(xì)節(jié)嚴(yán)重地重疊了。此外，在不使用切片操作的情況下，種子厚度的不均勻性會(huì)導(dǎo)致常規(guī)μ-SRXRF獲得的XRF分布圖像失真。圖3（c）是利用共聚焦μ-SRXRF對(duì)該擬南芥種子進(jìn)行原位XRF掃描成像的結(jié)果，共聚焦體積元在距離擬南芥種子表面約100μm深度處掃描。如圖3（c）所示，Ca、Cu和Sr在整個(gè)種子胚胎中均有分布，并在種皮中積累更高的水平。Ca的分布與Schnell Ramos等［22］采用粒子誘導(dǎo)X射線熒光分析（Particle-Induced X-ray Emission，PIXE）測(cè)得的擬南芥種子切片結(jié)果類似，而Mn和Fe在整個(gè)種子中分布并不均勻。這種特異性的聚集可能與其特定的結(jié)構(gòu)有關(guān)。Mn可在線粒體中聚集［23］，因此發(fā)芽過程中能量需求大的組織或器官中可能會(huì)聚集更多的Mn。Fe的分布顯示了胚根、下胚軸和一部分子葉的維管束。Zn均勻地分布在種子胚胎中。Mn、Fe和Zn的分布圖與Kim等［24］的研究結(jié)果類似。Ca、Zn和Sr的結(jié)果顯示了種子內(nèi)部存在供種子生長發(fā)育的空間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：利用共聚焦μ-SRXRF可以在不切片的情況下直接獲得化學(xué)元素在擬南芥種子內(nèi)部的空間分布特征，更加準(zhǔn)確地觀察化學(xué)元素在植物體組織或器官中的特異性分布狀況。

圖3 擬南芥種子的光學(xué)顯微鏡照片(a)、常規(guī)μ-SRXRF成像結(jié)果(b)和共聚焦μ-SRXRF成像結(jié)果(c)Fig.3 Optical microscopic image of Arabidopsis thaliana seed(a),the XRF imaging results of Arabidopsis thaliana seed by conventionalμ-SRXRF(b)and confocalμ-SRXRF(c)

大型蚤（Daphnia Magna）是國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)生物，廣泛地用于水生生物毒理試驗(yàn)，也是評(píng)估納米材料水生生物毒性的模式生物之一。圖4（a）是利用常規(guī)μ-SRXRF聯(lián)合低溫原位裝置對(duì)暴露在納米TiO2和As（V）中的大型蚤進(jìn)行原位XRF掃描成像的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過程中采用低溫原位裝置保持含水量較高的大型蚤處于低溫檢測(cè)環(huán)境以減少熱量對(duì)大型蚤組織和結(jié)構(gòu)的破壞。在常規(guī)μ-SRXRF實(shí)驗(yàn)中，由于探測(cè)器方向上沒有任何限制，大型蚤體表和體內(nèi)發(fā)射的XRF信號(hào)都被探測(cè)器接收，因此圖4（a）的結(jié)果不具有深度分辨信息。雖然Fe、Zn、Ti和As的信號(hào)顯示了這些化學(xué)元素主要富集在大型蚤的腸道中，但無法確定As（V）是否進(jìn)入大型蚤體內(nèi)。圖4（b）是共聚焦μ-SRXRF聯(lián)合低溫原位裝置對(duì)暴露在納米TiO2和As（V）中的大型蚤進(jìn)行原位XRF掃描成像的結(jié)果，共聚焦體積元在距離大型蚤表面約150μm深度處掃描。如圖4（b）所示，K的信號(hào)清晰地展現(xiàn)了K+在大型蚤體內(nèi)的分布。Ca的信號(hào)清晰地展現(xiàn)了大型蚤體內(nèi)鈣化骨骼的形貌，其主要與碳酸鹽和磷酸鹽物質(zhì)有關(guān)［25-26］。Fe和Zn的信號(hào)主要富集在大型蚤的腸道中，主要來源于由含有檸檬酸鐵銨和七水硫酸鋅的BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)的食物（綠藻）。Ti的信號(hào)幾乎全部聚集在腸道中，個(gè)別較強(qiáng)的Ti信號(hào)可能是大型蚤捕食到發(fā)生團(tuán)聚的納米TiO2顆粒。As的信號(hào)表明了除了吸附在大型蚤甲殼表面的As（V）外，在體內(nèi)的組織或器官也累積了少量的As（V）。As作為一種需要嚴(yán)格防控的有毒物質(zhì)，可能通過吸附于納米TiO2后經(jīng)腸道進(jìn)入生物體內(nèi)，對(duì)大型蚤產(chǎn)生不利的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：利用共聚焦μ-SRXRF聯(lián)合低溫原位裝置可以在無需脫水干燥過程直接獲得化學(xué)元素在大型蚤體內(nèi)的空間分布特征，不僅避免表面吸附或沾污引起的假性結(jié)果問題，且可以更加細(xì)致地觀察到化學(xué)元素在生物體內(nèi)部的吸收和分布特征。

圖4 常規(guī)μ-SRXRF(a)和共聚焦μ-SRXRF(b)聯(lián)合低溫原位裝置對(duì)大型蚤進(jìn)行XRF成像的結(jié)果Fig.4 The XRF imaging results of Daphnia magna by conventionalμ-SRXRF(a)and confocalμ-SRXRF(b)equipped with in-situ cryogenic device

3 結(jié)語

本工作在上海同步輻射光源硬X射線微聚焦及應(yīng)用光束線站（BL15U1）搭建了共聚焦X射線熒光微探針實(shí)驗(yàn)裝置。利用共聚焦μ-SRXRF對(duì)擬南芥種子進(jìn)行了原位XRF成像分析，直接獲得了化學(xué)元素在擬南芥種子內(nèi)部的空間分布特征，更加準(zhǔn)確地探索化學(xué)元素在植物體組織/器官中的特異性分布狀況。同時(shí)，還搭建了低溫原位裝置，利用共聚焦μ-SRXRF聯(lián)合低溫原位裝置對(duì)暴露在納米TiO2和As（V）中的大型蚤進(jìn)行了低溫環(huán)境下的原位XRF成像分析，直接獲得了化學(xué)元素在大型蚤體內(nèi)的空間分布特征，不僅避免表面吸附或沾污引起的假性結(jié)果問題，且可以更加細(xì)致地觀察到化學(xué)元素在生物體內(nèi)部的吸收和分布特征。

該裝置的空間分辨率由入射X射線的光斑大小和多毛細(xì)管光學(xué)元件的焦點(diǎn)大小決定。今后可通過縮小光斑和采用更小焦點(diǎn)尺寸的毛細(xì)管光學(xué)元件來進(jìn)一步提高空間分辨率。該裝置后續(xù)還可結(jié)合X射線近邊吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)（X-ray Absorption Near Edge Structure，XANES）實(shí)現(xiàn)低溫共聚焦XANES方法，獲得化學(xué)元素在生物體內(nèi)部的化學(xué)態(tài)變化，表征化學(xué)元素在生物體內(nèi)部的轉(zhuǎn)化和代謝過程。因此，利用共聚焦μ-SRXRF可無需切片及干燥過程直接獲得化學(xué)元素在生物體內(nèi)的真實(shí)分布信息，同時(shí)聯(lián)合低溫原位裝置可以擴(kuò)展對(duì)熱敏感的生物樣品和元素的分析，更深入了解化學(xué)元素對(duì)生物體的影響與作用，為生命和環(huán)境等研究領(lǐng)域提供強(qiáng)有力的原位表征技術(shù)。