王新強(qiáng)，吳良邦，章月紅，顧增輝

中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第903醫(yī)院骨三科，杭州 310004

骨質(zhì)疏松癥是60歲以上人群常見(jiàn)的骨代謝疾病，主要特征為骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加，增高了骨折的風(fēng)險(xiǎn)［1］。骨質(zhì)疏松癥主要發(fā)生機(jī)制是成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收動(dòng)態(tài)失衡，臨床上治療骨質(zhì)疏松癥的藥物有骨吸收抑制劑、骨形成促進(jìn)劑和骨礦化促進(jìn)劑［2］，但這些藥物的使用易引發(fā)一系列并發(fā)癥，如非典型骨折和骨壞死［1］。因此，尋找治療骨質(zhì)疏松癥的新策略尤為重要。

近年研究［3］發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）可通過(guò)分泌外泌體參與骨代謝過(guò)程，調(diào)控骨相關(guān)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等功能，并且影響骨組織周圍微環(huán)境，為骨質(zhì)疏松癥等骨代謝疾病的治療提供了新的思路。BMSC分泌的外泌體可促進(jìn)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞（MC3T3-E1細(xì)胞）的增殖和分化，促進(jìn)成骨特異性run相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）和堿性磷酸酶（Alp）的表達(dá)，促進(jìn)骨礦化沉淀［4］，但外泌體調(diào)控的分子學(xué)機(jī)制尚不清楚。本研究利用差速離心法獲得人MSC（hMSC）分泌的外泌體，觀察其對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和成骨分化的作用，并基于p38絲裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）信號(hào)通路探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

hMSC和MC3T3-E1細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)（貨號(hào)：SCSP-405和GNM15）。PBS、胎牛血清、αMEM培養(yǎng)基和0.05%胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)）；經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液（賽業(yè)生物科技有限公司，廣州）；p38MAPK抑制劑SB203580（Selleck生物科技有限公司，美國(guó)）；Alp檢測(cè)試劑盒，Alexa Fluor 488標(biāo)記的CD90、CD105、CD34和CD45抗體（Abcam公司，英國(guó)）；茜素紅、SDS-PAGE、RIAP、PMSF、磷酸酶抑制劑和PVDF膜（Solarbio Life Sciences公司，中國(guó)）；TRIzol試劑、PrimeScriptTMRT試劑盒和SYBR-Green qPCR Master Mix（TaKaRa公司，日本）；BCA試劑盒（左克生物有限公司，廣州）；一抗稀釋液、快速封閉液和二抗稀釋液（碧云天生物技術(shù)有限公司，上海）。Runx2抗體（貨號(hào)：D1L7F）、Alp抗體（貨號(hào)：3E5C7）、Ⅰ型膠原蛋白alpha1（COL1A1）抗體（貨號(hào)：E8F4L）、p38MAPK抗體（貨號(hào)：D13E1）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）抗體（貨號(hào)：D3F9）、ALIX抗體（貨號(hào)：E6P9B）、CD9抗體（貨號(hào)：D3H4P）、TSG101抗體（貨號(hào)：D1O5S）、GAPDH抗體（貨號(hào)：D16H11）和鼠抗兔二抗（貨號(hào)：7074）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，骨橋蛋白（Opn）抗體（貨號(hào)：ab228748，）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；ECL超敏發(fā)光液（四正柏生物科技有限公司，北京）。

1.2 hMSC鑒定

將hMSC接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80% ～ 90%融合后，用0.05%胰蛋白酶消化。PBS洗滌3次，500×g離心5 min后，再用PBS制成單細(xì)胞懸液。取單細(xì)胞懸液200 μL放入玻璃管中，分別加入CD90、CD105、CD34和CD45抗體，放置4℃避光孵育1 h后，再過(guò)濾去除細(xì)胞聚集體，最后流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光值。

將hMSC種于6孔板內(nèi)，待長(zhǎng)至80% ～ 90%融合后，將培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)21 d，棄去上清液，PBS洗滌3次，加入4℃多聚甲醛溶液固定15 min，PBS洗滌3次，加入茜素紅染色1 h，放入顯微鏡觀察紅色結(jié)節(jié)，并拍照記錄。

1.3 hMSC外泌體分離

將hMSC接種于100 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合后，更換為無(wú)血清不含外泌體的αMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集上清液。用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，放入超高速離心機(jī)通過(guò)差速離心法提取外泌體［5］：將過(guò)濾的上清液以3 500 r/min、離心半徑9.5 cm、離心40 min，將離心后的上清液移至新PC管內(nèi)，100 000×g離心90 min，棄去上清液；用500 μL PBS沖洗內(nèi)壁沉淀物，轉(zhuǎn)移至新EP管內(nèi)，混勻后10 000×g離心60 min；將上清液移至超離心管內(nèi)，100 000×g離心2 h，收集沉淀物。使用透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)。通過(guò)qNano平臺(tái)分析外泌體的大小和密度。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)hMSC和外泌體中蛋白質(zhì)的變化

采用裂解液（RIAP∶PMSF∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1）提取hMSC和外泌體中的總蛋白。通過(guò)BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。采用SDS-PAGE電泳分離總蛋白，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，通過(guò)快速封閉液封閉15 min后，TBST洗滌3次，每次10 min。將膜放入1∶1 000稀釋的一抗（ALIX、CD9、TSG101和GAPDH抗體）混懸液中，4℃孵育過(guò)夜。用TBST洗滌3次，每次10 min，再放入1∶4 000稀釋的二抗混懸液中，孵育2 h。TBST洗滌3次，每次10 min，采用ECL超敏發(fā)光液作為顯色液，放入化學(xué)發(fā)光成像儀（Invitorgen公司，美國(guó)）進(jìn)行蛋白顯影。通過(guò)Image J軟件分析結(jié)果，相對(duì)蛋白表達(dá)以GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 外泌體對(duì)MC3T3-1細(xì)胞增殖和成骨能力的影響

將MC3T3-E1細(xì)胞種于96孔板內(nèi)，分為4組，分別給予外泌體5 mg/L［6］干預(yù)（外泌體組）、p38MAPK抑制劑SB203580 10 μmol/L［7］干預(yù)（抑制劑組）、SB203580 10 μmol/L干預(yù)6 h后再加入外泌體5 mg/L干預(yù)（抑制劑+外泌體組），以未干預(yù)組作為對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將20 μL MTT溶液加入孔內(nèi)，在37℃孵育2 h。棄去孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO溶液，放入振蕩儀振蕩2 min，使用酶標(biāo)儀490 nm下檢測(cè)光密度（OD）值，計(jì)算與對(duì)照組的相對(duì)值作為細(xì)胞增殖的速率。每個(gè)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

將MC3T3-1接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)至40% ～ 50%融合度時(shí)，分為對(duì)照組、外泌體組、抑制劑組和抑制劑+外泌體組，每3 d換一次含10%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)基。21 d后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入4℃多聚甲醛固定15 min，加入茜素紅染色1 h，放入倒置顯微鏡觀察各組形成的紅色鈣化結(jié)節(jié)，拍照記錄。

將MC3T3-1接種于6孔板內(nèi)，分為對(duì)照組、外泌體組、抑制劑組和抑制劑+外泌體組，培養(yǎng)24 h后，以1 000 r/min，離心半徑9.5 cm，離心10 min，收集上清液。每組均取50 μL上清液放入96孔板內(nèi)，使用Alp檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。分別加入檢測(cè)緩沖液和顯色底物溶液，避光37℃孵育10 min。每孔加入100 μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定OD值，計(jì)算Alp活力。每組6個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.6 外泌體對(duì)MC3T3-1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

4組細(xì)胞干預(yù)24 h后，采用TRIzol試劑分別提取各組總RNA。以NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)各組總RNA純度和濃度后，將各組的RNA濃度調(diào)至一致，再使用PrimeScript TM RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增為cDNA（反轉(zhuǎn)錄條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s）。將目的模板cDNA、SYBR-Green qPCR Master Mix和對(duì)應(yīng)的引物（表1）混合后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，條件：95℃ 10 min預(yù)變性；95℃ 15 s，60℃ 45 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)2-△△ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。采用蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定Runx2、Alp、COL1A1、Opn、p38/p-p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量，方法同前。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab. 1 Primer sequences required for real-time fluorescent quantitative PCR

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hMSC鑒定

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，hMSC表面抗原CD90（97.09%）和CD105（99.32%）呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34（2.92%）和CD45（1.45%）呈陰性表達(dá)，符合BMSC的表面抗原特征（圖1a ～ d）。茜素紅染色結(jié)果顯示，hMSC能形成礦化結(jié)節(jié)，具有誘導(dǎo)成骨能力（圖1e）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)和茜素紅染色鑒定hMSCFig. 1 Identification of hMSC by flow cytometry and Alizarin Red staining

2.2 外泌體特征

在透射電子顯微鏡下可見(jiàn)hMSC分泌的外泌體呈球形囊泡，形態(tài)為圓形或典型的杯形（圖2a），其直徑為40 ～ 160 nm（圖2b）。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與hMSC比較，外泌體中的ALIX、CD9和TSG101的表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2c）。

圖2 hMSC分泌的外泌體特征Fig. 2 Characteristics of exosomes secreted by hMSC

2.3 外泌體對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞中p38MAPK信號(hào)通路的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，抑制劑組和抑制劑+外泌體組中p-p38/p38MAPK的蛋白表達(dá)量比值降低，外泌體組中的p-p38/p38MAPK的蛋白表達(dá)量比值增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖3）；與抑制劑組相比，抑制劑+外泌體組的p-p38/p38MAPK的蛋白表達(dá)量比值無(wú)明顯變化（P＞ 0.05，圖3）；與外泌體組比較，抑制劑+外泌體組的p-p38/p38MAPK的蛋白表達(dá)量比值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖3）。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)外泌體對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞中p38MAPK信號(hào)通路的影響Fig. 3 Effect of exosomes on p38MAPK signaling pathway in MC3T3-E1 cells detected by Western blotting

2.4 外泌體對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，抑制劑組和抑制劑+外泌體組中成骨相關(guān)因子Alp、Runx2、COL1A1和Opn的mRNA和蛋白表達(dá)量降低，而外泌體組中Alp、Runx2、COL1A1和Opn的mRNA和蛋白表達(dá)量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖4a、b）；與抑制劑組比較，抑制劑+外泌體組Alp、Runx2、COL1A1和Opn的mRNA和蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化（P＞ 0.05，圖4a、b）；與外泌體組比較，抑制劑+外泌體組Alp、Runx2、COL1A1和Opn的mRNA和蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖4a、b）。

茜素紅染色和Alp檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，抑制劑組和抑制劑+外泌體組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少、Alp活力降低，而外泌體組的礦化結(jié)節(jié)和Alp活力增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖4c ～ e）；與抑制劑組比較，抑制劑+外泌體組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量和Alp活力無(wú)明顯變化（P＞ 0.05，圖4c ～ e）；與外泌體組比較，抑制劑+外泌體組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少、Alp活力降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖4c ～ e）。

圖4 hMSC外泌體對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞骨形成的影響Fig. 4 Effect of exosomes from hMSC on MC3T3-E1 cells osteogenesis

2.5 外泌體對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，抑制劑組和抑制劑+外泌體組的OD值降低，而外泌體組OD值增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖5）；與抑制劑組比較，抑制劑+外泌體組OD值無(wú)明顯變化（P＞ 0.05，圖5）；與外泌體組比較，抑制劑+外泌體組OD值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖5）。

圖5 MTT檢測(cè)外泌體對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響Fig. 5 Effect of exosomes on MC3T3-E1 cells proliferation detected by MTT assay

3 討 論

目前，全世界大約有2億人罹患骨質(zhì)疏松癥，其發(fā)病率已躍居世界常見(jiàn)病的第7位［8］。骨質(zhì)疏松癥及其并發(fā)癥（骨折、疼痛和致殘等）對(duì)人類健康構(gòu)成了極大威脅［9］。因此，尋找確切有效的防治方案顯得非常重要。干細(xì)胞治療的發(fā)展為骨質(zhì)疏松癥的治療帶來(lái)新的希望。hMSC容易獲得，且具有很強(qiáng)的自我更新和多向分化能力，其能定向形成成骨細(xì)胞，因此成為“種子細(xì)胞”［10］。有研究［11］顯示，hMSC直接注入鼠體內(nèi)后，能使去勢(shì)大鼠的骨密度增加，可成為骨質(zhì)疏松癥治療的新型策略。本研究茜素紅染色結(jié)果顯示，hMSC可誘導(dǎo)形成骨細(xì)胞，說(shuō)明hMSC具有成骨分化能力。

然而，hMSC在治療過(guò)程中有免疫排斥防疫及收集過(guò)程中細(xì)胞受到污染等問(wèn)題，尋找一種易獲得、性狀穩(wěn)定、免疫原性和修復(fù)效果好的干細(xì)胞尤為重要［12］。近年來(lái)，有研究［13］表明，hMSC能分泌出直徑30 ～ 160 nm的脂質(zhì)雙分子層細(xì)胞外囊泡，即外泌體，囊內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸。本研究采用差速離心法分離出hMSC分泌的外泌體，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示外泌體中ALIX、CD9和TSG101的表達(dá)量較hMSC增加。以外泌體干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞后，細(xì)胞中成骨分化相關(guān)因子Alp、Runx2、COL1A1和Opn的mRNA和蛋白表達(dá)量增加，礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增多，ALP活力和細(xì)胞增殖能力增高，表明外泌體能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化和增殖。

有研究［1］表明，p38MAPK信號(hào)通路對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞向成骨細(xì)胞特異性分化起著重要的正向調(diào)節(jié)作用，抑制p38MAPK信號(hào)通路會(huì)使MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化受阻。本研究結(jié)果顯示，p38MAPK抑制劑干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞后，成骨分化相關(guān)因子Alp、Runx2、COL1A1和Opn蛋白和mRNA表達(dá)量受到抑制，礦化結(jié)節(jié)數(shù)量、Alp活力和細(xì)胞增殖能力也明顯降低，也證實(shí)p38MAPK信號(hào)通路正向調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化和增殖。本研究結(jié)果顯示，外泌體干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞后，p-p38/p38MAPK蛋白表達(dá)量比值增加，說(shuō)明外泌體調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)；阻斷MC3T3-E1細(xì)胞中p38MAPK信號(hào)通路后，再用外泌體干預(yù)，細(xì)胞中成骨分化相關(guān)因子Alp、Runx2、COL1A1和Opn的mRNA和蛋白表達(dá)量、礦化結(jié)節(jié)數(shù)量、Alp活力和細(xì)胞增殖能力與抑制劑組無(wú)差異，說(shuō)明外泌體通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化和增殖。

綜上所述，hMSC分泌的外泌體能夠促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化和增殖，其調(diào)控機(jī)制可能是通過(guò)激活p38MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。