胡 曉，楊 蕊

（1.內江市種豬場，四川 內江 641007；2.西南大學動物科學學院，重慶 榮昌 402460）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又名豬藍耳病，是20世紀80年代出現(xiàn)的一種新型高致病性傳染病。該病在1987年最早發(fā)現(xiàn)于美國。2007年1月我國將其列為一類動物疫病［1］。豬藍耳病在各個豬場之間廣泛傳播，有的豬場使用疫苗，而有的未使用，但均有一些豬場發(fā)病，主要引起繁殖母豬生產(chǎn)性能嚴重下降和仔豬的呼吸道癥狀，生長發(fā)育不良，甚至繼發(fā)細菌性傳染病，如副豬、傳胸等，給豬場造成了嚴重的經(jīng)濟損失。本試驗以四川某豬場未進行藍耳病疫苗免疫的3～4月齡架子豬為研究對象，采集血液樣本235 份分離血清，用間接ELISA 法檢測豬藍耳病抗體，同時根據(jù)豬藍耳病病毒ORF6 基因設計引物，采集19 份血液樣本進行RT-PCR檢測?，F(xiàn)將檢測結果報告如下：

1 試驗材料

1.1 被檢血清及血液樣本的采集 血清樣本采集：隨機選擇四川某豬場未進行藍耳病疫苗免疫的3～4月齡架子豬，前腔靜脈采血2～5 mL，共采集235 份，放入離心管中，室溫下靜置2～4 h，待血液凝固血清析出后，以3 000 r/min 離心分離血清，于-20 ℃保存待檢。

血液樣本采集：使用醫(yī)用真空抗凝采血管，隨機采集未免疫的架子豬前腔靜脈血液2～5 mL，共采集19份，置4～8 ℃保存待檢。

1.2 試劑 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒，山東綠都生物科技有限公司生產(chǎn)（批號：2018010136）；RNA基因組提取試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)（批號：20170503202）。

2 方法

2.1 豬血清藍耳病ELISA抗體檢測

2.1.1 樣品準備 將保存的待測血清取出，室溫靜置30 min，用試劑盒樣品稀釋液對血清樣品進行40倍稀釋，陰、陽性對照進行4倍稀釋。

2.1.2 試劑準備 將10×濃縮洗滌液在使用前恢復至室溫，有沉淀的等到其沉淀溶解，然后用蒸餾水進行10 倍稀釋（即10 μL 濃縮洗滌液加入90 μL的蒸餾水）。

2.1.3 操作步驟 將試劑盒取出，待其恢復至室溫。取出抗原包被板，根據(jù)樣品數(shù)拆分出需要的孔數(shù)，并對樣品位置進行標記和記錄，在相應孔的位置上加入稀釋好的樣品100 μL。各取100 μL 陰、陽性對照加入到抗原包被板中，每次檢測各設兩孔對照。加樣完成后，37℃孵育30min。將各孔的廢液棄去，每孔加入稀釋好的洗滌液200 μL洗板，重復此操作5次，每次2～3 min。倒掉洗滌液后將孔中殘留的液體拍干，每孔加入酶標二抗100 μL，37 ℃孵育30 min。再將孔中液體棄去，加入洗滌液洗板，重復5 次，拍干，每孔加入100 μL TMB 底物液。37 ℃孵育15 min 后，用移液槍在板條上每孔加50 μL 的終止液，立刻于450 nm波長處用酶標儀測定各孔的吸光值。

2.1.4 結果判斷（按試劑盒說明書進行）豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的陰陽性需通過計算每個樣品的S/P值來判斷。

計算方法：樣本S/P 值＝（樣本OD 值－陰性值的平均值）/（陽性值的平均值－陰性值的平均值）。

若樣品S/P 值≥0.25，則判定為抗體陽性；若樣品S/P值≤0.20，則判定為抗體陰性；若0.20≤樣品S/P值≤0.25，則判定為可疑。

2.2 藍耳病RT-PCR檢測

2.2.1 藍耳病病毒ORF6 基因引物合成 根據(jù)已知的ORF6 基因引物序列，送上海生工生物公司合成（見表1）。

表1 ORF6基因引物

2.2.2 豬藍耳病病毒RNA 的提取 將保存的待測液取出加入100～200 μL 氯仿，用力搖勻。將加好氯仿的血液樣品以12 000 r/min 冷凍離心15 min，吸取上清液移入到新的去RNA 酶離心管中，加入0.25 mL異丙醇，輕柔地翻轉幾次將其搖勻，在冰盒上靜置35 min后以12 000 r/min冷凍離心15 min，棄去上清液取400 μL 用75%的酒精進行三次洗滌，盡量去除離心管內的異丙醇等其他物質。用移液槍把離心管內剩余的液體盡量吸干凈，打開離心管蓋放冰盒上10 min 待酒精揮發(fā)晾干，根據(jù)沉淀的多少加入20～40 μL 的去RNA 酶水，懸浮靜置片刻待其溶解后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 豬藍耳病病毒RNA 的反轉錄 將上一步獲得的RNA作為模板，根據(jù)實驗室制定的反轉錄條件配制反轉錄體系。在PCR儀上進行反轉錄，經(jīng)過30 ℃退火反應，42 ℃延伸反應，99 ℃變性反應后獲得豬藍耳病病毒cDNA。反轉錄體系見表2，反轉錄條件見表3。

表2 反轉錄體系

表3 反轉錄條件

2.2.4 ORF6基因PCR擴增反應體系及條件 將以上反轉錄產(chǎn)物作為模板，用上、下游引物擴增目的基因片段，再添加Taq DNA酶、dNTP于PCR反應管中，用ddH2O 配平反應體系。然后將PCR反應管置于PCR擴增儀中，發(fā)生預變性、變性、退火、延伸、總延伸反應，同時經(jīng)過30 個循環(huán)后，得到PCR產(chǎn)物。反應體系及條件見表4。

表4 PCR反應體系及條件

2.2.5 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 取0.4 g 瓊脂糖加入40 mL 水配制成濃度為1%的凝膠，在微波爐上熔至清澈透明的溶液狀。冷卻到60 ℃左右，加入EB 染料，搖勻，倒入事先安裝好的水平電泳槽內，凝膠厚度一般為3～5 mm，等到凝膠完全凝固后，室溫下放置30 min。根據(jù)樣品量選用梳子，在梳子齒附近加入少量電泳緩沖液，后緩慢輕輕地向上拔掉梳子，將凝膠放入電泳槽中，用移液器吸取樣品注入孔內。給電泳儀通上電，30 min 后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結果。

3 試驗結果

3.1 豬血清藍耳病ELISA 抗體檢測結果 對未免疫的235 份血清樣品進行ELISA 抗體檢測，結果得出陽性149份，陰性52份，可疑34份，陽性率為63.4%。

3.2 豬藍耳病RT-PCR 擴增結果 利用RTPCR方法對19份血液樣本進行藍耳病病毒檢測，結果顯示：19 份樣本中只有367-8 號樣本為陽性，其余18份樣本均為陰性，陽性率為5.26%（見表5）。

表5 豬藍耳病RT-PCR擴增結果

4 討論

4.1 Albina 等［2］用PRRSV 接種豬肺泡巨噬細胞（PAMs）培養(yǎng)病毒抗原，首次建立了檢測PRRSV抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗，其特異性和敏感性高于過氧化物酶單層試驗（IPMA）和間接免疫熒光法（IFA）。本試驗也采用ELISA 方法對未免疫架子豬的血清進行（PRRSV）抗體檢測。結果陽性有149份，陽性率為63.4%。劉琳［3］對中西部部分地區(qū)的未免疫規(guī)?；i場進行PRRSV ELISA 抗體檢測，得出陽性率為84.46%；郝中香等［4］對四川省某個未免疫規(guī)?；i場的70 份血清進行PRRSV ELISA抗體檢測，結果陽性率為90%。本試驗對PRRSV的陽性檢出率均低于上述報道，說明該場豬藍耳病感染沒有上述報道的嚴重，但陽性率仍然較高，達到63.40%，應引起豬場的高度重視。

4.2 RT-PCR 法被廣泛應用于豬藍耳病病毒的檢測，目前已成為實驗室診斷藍耳病毒的主要手段。其主要優(yōu)點是特異性強、靈敏度高，不用進行病毒分離鑒定，省時、省力。但是在臨床實踐中，越來越多的藍耳病病毒開放閱讀框（ORF）出現(xiàn)變異情況，針對不同開放閱讀框設計的引物的特異性不強，RT-PCR 診斷結果的差異較大。在整個藍耳病病毒基因組中，以ORF6 最為保守，可作為分子生物學鑒定的重要依據(jù)。因此，本試驗選用ORF6 基因設計引物，對采集的血液樣本進行RT-PCR 擴增，結果得出陽性率為5.26%。漆信橋［5］對四川省各地送檢的100 份血清樣本進行藍耳病毒RT-PCR 檢測，得出陽性率為34%；蔣劉柱［6］對四川綿陽地區(qū)部分疑似發(fā)病豬場的78 份樣本進行藍耳病毒RT-PCR 檢測，得出陽性率為35.90%。本試驗結果與上述報道相比，陽性檢出率較低，其原因可能與檢測樣本較少，缺乏代表性，或感染時間較長，病毒血癥狀消失有關。