劉 名,王 蔚*,侯玉明,艾紅軍

(1.中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 附屬口腔醫(yī)院,遼寧省口腔疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽 110002;2.紹興市中心醫(yī)院,浙江 紹興 312000)

近年來粉塵污染越來越引起人們的關(guān)注,長期接觸粉塵的作業(yè)人員,當(dāng)吸入的粉塵量達(dá)到一定數(shù)量時(shí)即可引發(fā)塵肺病、鼻炎、咽炎、支氣管炎、皮疹、眼結(jié)膜損害等[1-2]。粉塵污染同時(shí)也存在于口腔行業(yè),診療過程中牙體組織的切除、修復(fù)材料的調(diào)磨,氣槍、水槍、高速手機(jī)及低速手機(jī)產(chǎn)生的氣霧、飛沫、塵埃等均會(huì)對(duì)周圍環(huán)境造成污染[3]。

鈷鉻鉬合金(商品名:維他靈Vitallium)、二氧化鋯(zirconiumdioxide, ZrO2)全瓷、PMMA(polymethyl methacrylate)樹脂等修復(fù)材料在口腔領(lǐng)域廣泛應(yīng)用,Vitallium主要應(yīng)用于可摘局部義齒金屬支架,ZrO2全瓷主要應(yīng)用于單冠、嵌體冠及固定橋的修復(fù),而PMMA樹脂為全口義齒及基托的重要組成部分,修復(fù)體材料在制作及調(diào)磨過程中會(huì)產(chǎn)生不同形狀及大小的粉塵。Vitallium粉塵顆粒主要由鈷、鉻、鉬、鐵組成,其中鈷鉻鉬的合金含量高達(dá)97%以上,研究表明,長期的鈷鉻鉬暴露會(huì)引起以化痰、流涕為主的呼吸道疾病及肺組織損傷甚至肺纖維化[4-6]。ZrO2組粉塵顆粒的主要元素為硅、氧、鉀、鋁、鈉,主要成分為二氧化硅,長期吸人二氧化硅粉塵會(huì)引起肺部組織的慢性疾病,有研究表明口腔修復(fù)診室中飾面瓷粉塵的時(shí)間加權(quán)平均容許濃度為0.393 mg/m2,超出國家安全范圍[2];且已有齒科二氧化硅致矽肺、肺部多發(fā)性肉芽腫伴淀粉樣沉積的病例報(bào)道[7-9]。PMMA組的粉塵顆粒主要元素為碳和氧,為有機(jī)粉塵,長期暴露于PMMA環(huán)境下可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生皮膚炎癥、刺激眼睛或粘膜、過敏性皮炎、哮喘、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病及過敏性肺炎等呼吸系統(tǒng)損傷[10-12]。

目前關(guān)于齒科研磨粉塵對(duì)健康影響的研究多局限于病例報(bào)道及流行病學(xué)調(diào)查,針對(duì)口腔修復(fù)診室,調(diào)磨、修改義齒過程中產(chǎn)生的粉塵污染問題研究較少,尚缺乏建立統(tǒng)一的動(dòng)物模型進(jìn)行系統(tǒng)的定性定量的分析研究,本研究使用掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)及激光粒度分析儀(particulate size description analyser,PSDA)作為檢測(cè)手段分析齒科研磨粉塵及精細(xì)研磨粉塵顆粒的表面形態(tài)及粒徑大小,通過非暴露式氣管染塵法建立齒科粉塵大鼠染塵模型,用吉姆薩染色(Giemsa)及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)染塵大鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中炎癥細(xì)胞的數(shù)量變化及白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6),白細(xì)胞介素-16(interleukin-16,IL-16)水平的變化,同時(shí)應(yīng)用HE染色觀察肺組織切片病理改變,旨在探討齒科粉塵對(duì)大鼠肺組織是否產(chǎn)生潛在影響,為今后進(jìn)一步研究齒科粉塵暴露對(duì)機(jī)體健康影響提供理論基礎(chǔ),同時(shí)也為齒科臨床防塵保護(hù)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)Wistar大鼠,8周齡,63只,體重(250±10)g,由沈陽陸軍總院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(遼)2015-0001],飼養(yǎng)于沈陽陸軍總院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(遼)2018-0008],實(shí)驗(yàn)研究過程遵守“3R”原則,并通過沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)倫理審查(2015042)。

1.2 主要試劑與儀器

甲苯(國藥公司,中國);蘇木精(國藥公司,中國);曙紅Y,醇溶(國藥公司,中國);大鼠白介素酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海臥宏,中國)。Ⅱ型自凝模型粉及義齒基托樹脂液劑(上海珊瑚齒科材料有限公司,中國);Vitallium金屬(登氏柏公司,美國);ZrO2體瓷(VITA公司,德國);SSX-550掃描電子顯微鏡(島津公司,日本);電子顯微鏡(LUMPUS公司,日本);能量分散光譜儀(島津公司,日本);Master sizer Macro激光粒度分析儀(Malvern公司,英國);-30℃恒冷低溫切片機(jī)(Cleica,德國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 齒科研磨粉塵的制備

將Vitallium金屬、ZrO2體瓷、PMMA樹脂制備成14 mm×14 mm×3 mm的實(shí)驗(yàn)?zāi)K,用金剛砂車針調(diào)磨處理,收集調(diào)磨后的粉塵顆粒各10 g,平均分為兩組,隨機(jī)選取其中一組粉塵,分別在瑪瑙研缽中研磨2 h致粉塵顆粒變小。

1.3.2 掃描電子顯微鏡觀察

取齒科研磨粉塵顆粒各樣本,分別固定于載物臺(tái)上真空中噴鍍金膜,應(yīng)用SEM對(duì)各組樣本進(jìn)行觀察檢測(cè)。

1.3.3 激光粒度分析儀檢測(cè)

取齒科研磨粉塵顆粒各樣本,分別置于激光粒度分析儀的樣品槽內(nèi),在網(wǎng)兜處加入鋼球后進(jìn)行PSDA測(cè)量分析。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將大鼠隨機(jī)分成7組,每組又分為三個(gè)時(shí)間點(diǎn)共9只:對(duì)照組(N,不染塵,生理鹽水組)、實(shí)驗(yàn)組齒科材料顆粒未研磨PMMA組(A1)、未研磨Vitallium組(B1)、未研磨ZrO2組(C1)、和精細(xì)研磨PMMA組(A2)、精細(xì)研磨Vitallium組(B2)、精細(xì)研磨ZrO2組(C2),每組的實(shí)驗(yàn)周期均為3周、6周、12周。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)大鼠非暴露式氣管染塵

將未研磨組與精細(xì)研磨組粉塵,分別溶于生理鹽水中配成濃度5 g/100 mL懸液,高溫高壓滅菌,加入800000 U青霉素備用。將大鼠麻醉、固定、氣管插管,插入穿刺針至主支氣管上方約1 cm處,回抽注射器可見氣泡且回抽時(shí)無阻力,確認(rèn)已插入氣管內(nèi),將1 mL實(shí)驗(yàn)組懸液及對(duì)照組不染塵生理鹽水分別打進(jìn)大鼠雙肺中,染塵后的大鼠,應(yīng)盡快從染塵架上取下來,并給予心肺復(fù)蘇。

1.3.6 實(shí)驗(yàn)大鼠肺泡灌洗液收集及細(xì)胞計(jì)數(shù)

分別于術(shù)后3周、6周、12周,大鼠進(jìn)行麻醉處死,分離氣管至肺組織完全暴露,在氣管離心端做一橫行切口,用注射器吸取2 mL預(yù)冷的生理鹽水,通過導(dǎo)管以較小的壓力將鹽水緩慢注入肺內(nèi),見肺逐漸膨隆、蒼白,立即緩慢回抽灌洗液,再將所得液體緩緩注回肺內(nèi),反復(fù)2次,置于離心管中冷凍離心2000 r/min 10 min,分離上清液和細(xì)胞,使用0.1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞,吹勻后,吸取10μL細(xì)胞懸液,滴加在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上,顯微鏡下行白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù);另吸取10μL細(xì)胞懸液,制成細(xì)胞涂片,甲醇固定后進(jìn)行Giemsa液染色,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),并進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.3.7 ELISA檢測(cè)肺泡灌洗液中IL-6、IL-16濃度

按照ELISA試劑盒說明書,依次梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品蛋白,并進(jìn)行加樣、溫育、洗滌、加酶、再次溫育、洗滌、顯色、終止,最后在450 nm波長測(cè)定各孔吸光度(OD值),并用空白孔調(diào)零,以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),調(diào)零后的OD值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品濃度。

1.3.8 肺組織HE染色

打開大鼠胸腔,將大鼠全肺取出將肺剔除氣管、支氣管結(jié)締組織及心臟,在生理鹽水內(nèi)漂洗1次,用濾紙吸干。將整個(gè)肺用10%中性緩沖福爾馬林液固定,石蠟包埋,切片厚度為5μm,HE染色,普通光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 SEM觀察結(jié)果

六組不同齒科粉塵顆粒的表面形態(tài)有明顯差異(圖1),PMMA組(圖1A1、A2)顆粒呈團(tuán)塊狀,大小不一,尺寸相差較大,表面形態(tài)不規(guī)則;Vitallium組(圖1B1、B2)顆粒較大,形狀不規(guī)則,呈薄片狀、卷曲波紋狀結(jié)構(gòu);ZrO2組(圖1C1、C2)粉塵顆粒相對(duì)較小,邊緣銳利,呈團(tuán)塊狀不規(guī)則結(jié)構(gòu)。精細(xì)研磨后粉塵顆粒明顯變小,除PMMA精細(xì)研磨組(圖1A2)粉塵表面圓鈍外其余兩組形態(tài)無明顯改變。

圖1 齒科材料研磨粉塵顆粒的SEM觀察Note.A1,PMMA non-grinding group.A2,PMMA fine grinding group.B1,Vitallium non-grinding group.B2,Vitallium fine grinding group.C1,ZrO2 non-grinding group.C2,ZrO2 fine grinding group.Figure 1 SEM observation of dental dust particles

2.2 激光粒度分析結(jié)果

三組不同齒科材料及精細(xì)研磨后粉塵顆粒的粒徑分布結(jié)果(表1、圖2),三種齒科研磨粉塵的粒徑分布均不同,且分布范圍較為廣泛,精細(xì)研磨后粉塵粒徑不同程度減小。

表1 未研磨及精細(xì)研磨后粉塵顆粒的粒徑分布(%)Table 1 Particle size distribution of non-grinding dust and fine grinding dust

圖2 未研磨及精細(xì)研磨后粉塵顆粒的粒徑分布曲線Note.A1,PMMA non-grinding group.A2,PMMA fine grinding group.B1,Vitallium non-grinding group.B2,Vitallium fine grinding group.C1,ZrO2 non-grinding group.C2,ZrO2 fine grinding group.Figure 2 Particle size distribution curves of non-grinding dust and fine grinding dust

2.3 支氣管肺泡灌洗液的炎癥細(xì)胞染色圖片及計(jì)數(shù)

2.3.1 大鼠BALF中炎癥細(xì)胞Giemsa染色圖片

如圖3所示,紅色箭頭所示為中性粒細(xì)胞,其特點(diǎn)為細(xì)胞圓形,胞漿粉紅色,核形不一,細(xì)胞核常染成深紫紅色;綠色箭頭所示為巨噬細(xì)胞,其特點(diǎn)為胞體圓形,胞質(zhì)疏松、淡染,呈淡藍(lán)色;黃色箭頭所示為淋巴細(xì)胞,其特點(diǎn)為細(xì)胞核占細(xì)胞體積大且致密,胞漿極少,常染成深藍(lán)色至藍(lán)色。與不染塵生理鹽水的對(duì)照組相比,未研磨及精細(xì)研磨染塵組在3周、6周、12周的BALF中白細(xì)胞總數(shù)均明顯增高,且隨染塵時(shí)間的延長,細(xì)胞數(shù)量的增加越明顯。

圖3 不同觀察時(shí)點(diǎn)各染塵組及對(duì)照組Giemsa染色圖Note.N,Control group.A1,PMMA non-grinding group.A2,PMMA fine grinding group.B1,Vitallium non-grinding group.B2,Vitallium fine grinding group.C1,ZrO2 non-grinding group.C2,ZrO2 fine grinding group.Red arrow,Neutrophil.Green arrow,macrophage.Yellow arrow,lymphocyte.Figure 3 Giemsa staining in dust exposed group and control group at different observation time points

2.3.2 大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)的改變

將Giemsa染色結(jié)果進(jìn)行白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)后,如圖4所示,與不染塵生理鹽水的對(duì)照組比,未研磨及精細(xì)研磨染塵組在3周、6周、12周的BALF中白細(xì)胞總數(shù)均明顯增高,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),且隨染塵時(shí)間的延長,細(xì)胞數(shù)量的增加越明顯;與未研磨組比,從第6周起,除12周C2組外其余各精細(xì)研磨組白細(xì)胞數(shù)量均明顯高于未研磨組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 各組大鼠BALF白細(xì)胞總數(shù)變化情況Note.N,Control group.A1,PMMA non-grinding group.A2,PMMA fine grinding group.B1,Vitallium non-grinding group.B2,Vitallium fine grinding group.C1,ZrO2 non-grinding group.C2,ZrO2 fine grinding group.Dust group compared with the control group,*P＜0.05.Fine grinding group compared with the non grinding group,#P＜0.05.The same as below.Figure 4 Total number of white blood cells in BALF of rats in each group

2.3.3 大鼠BALF中巨噬細(xì)胞數(shù)量改變

將Giemsa染色結(jié)果進(jìn)行巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)后,如圖5所示,與對(duì)照組相比,研磨及精細(xì)研磨染塵組在3周、6周、12周的BALF中巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增高,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與未研磨組相比,從第6周開始,除12周C2組外其余各精細(xì)研磨組巨噬細(xì)胞數(shù)量均明顯高于未研磨組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖5 各組大鼠BALF巨噬細(xì)胞總數(shù)變化情況Figure 5 Total number of macrophages in BALF of rats in each group

2.4 支氣管肺泡灌洗液中IL-6、IL-16含量

2.4.1 大鼠BALF中IL-6含量

如圖6所示,與對(duì)照組相比,染塵組BALF中IL-6含量均增高,12周時(shí)明顯增高,除6周A1,A2組外,其余組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與未研磨組相比,精細(xì)研磨組在各時(shí)間點(diǎn)BALF中IL-6含量均增高,12周時(shí)B2組相比于B1組,C2組相比于C1組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖6 各組大鼠BALF中IL-6含量Figure 6 IL-6 content in BALF of rats in each group

2.4.2 大鼠BALF中IL-16含量

如圖7所示,與對(duì)照組相比,染塵組BALF中IL-16含量均增高,除6周A1,A2組外,其余組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與未研磨組相比,精細(xì)研磨組在各時(shí)間點(diǎn)BALF中IL-16含量均增高,12周時(shí)B2組相比于B1組,C2組相比于C1組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖7 各組大鼠BALF中IL-16含量Figure 7 IL-16 content in BALF of rats in each group

2.5 肺組織切片病理變化

HE染色結(jié)果如圖8所示,對(duì)照組(圖8A)肺組織3周時(shí)有少量炎細(xì)胞浸潤,結(jié)構(gòu)無明顯改變,6周及12周肺組織結(jié)構(gòu)完整,清晰,肺泡壁連續(xù)。而各染塵組(圖8B、8C、8D)3周時(shí)可見少量炎細(xì)胞浸潤,6周炎細(xì)胞浸潤增多,肺泡間隔增寬,肺泡壁被破壞,12周肺組織破壞明顯,肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤,纖維化形成;其中,C2組在6周即出現(xiàn)纖維樣改變。

圖8 不同觀察時(shí)點(diǎn)各染塵組及對(duì)照組肺組織變化Note.A,N,Control group.B,A1,PMMA non-grinding group.A2,PMMA fine grinding group.C,B1,Vitallium non-grinding group.B2,Vitallium fine grinding group.D,C1,ZrO2 non-grinding group.C2,ZrO2 fine grinding group.Figure 8 Changes of lung tissue in dust exposed group and control group at different observation time points

3 討論

不同粒徑的粉塵引發(fā)的機(jī)體生物學(xué)毒性差異顯著,粉塵粒徑大小決定了其在人體呼吸系統(tǒng)內(nèi)沉積的位置及對(duì)人體健康的危害程度[13-14]。研究表明,大于10μm的粉塵可沉積在鼻咽和氣管支氣管的呼吸道區(qū)域,10~0.1μm的粉塵有90%可沉積于人體呼吸道和肺泡上,5~0.5μm的粉塵沉積率隨粒徑的減小而逐漸降低,而0.4μm以下的粉塵隨粒徑減小沉積率增大,其中粒徑小于2.5μm的粉塵主要沉積在肺泡,更易導(dǎo)致機(jī)體的損傷[15-16]。鑒于粉塵收集過程中環(huán)境無法達(dá)到絕對(duì)密閉,打磨過程中產(chǎn)生的小粒徑粉塵,易懸浮在空氣中無法收集,且懸浮于空氣中的小粒徑粉塵顆粒更易被吸入,故本實(shí)驗(yàn)采用研磨精細(xì)研磨收集的粉塵,以模擬臨床上產(chǎn)生的小粒徑粉塵,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,精細(xì)研磨后Vitallium及ZrO2粉塵較研磨前,對(duì)大鼠肺組織炎性損傷更強(qiáng)。

中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的遷移和活化為肺部損傷的主要炎癥性免疫反應(yīng),支氣管肺泡灌洗液中粒細(xì)胞的增多,被認(rèn)為與肺纖維化密切相關(guān),它的大量出現(xiàn)是肺細(xì)胞損傷的標(biāo)志[17-19],巨噬細(xì)胞是粉塵作用的主要靶細(xì)胞,巨噬細(xì)胞的活躍在肺損傷以及纖維化過程中發(fā)揮重要作用[20]。本實(shí)驗(yàn)中大鼠染塵后白細(xì)胞及巨噬細(xì)胞數(shù)量高于對(duì)照組(P＜0.05),除了12周C2組外,從6周開始精細(xì)研磨組的白細(xì)胞及巨噬細(xì)胞含量均高于未研磨組,其中12周B2組炎癥反應(yīng)最為明顯,說明Vitallium粉塵研磨后致炎作用更強(qiáng),而C2組白細(xì)胞及巨噬細(xì)胞數(shù)量在6周時(shí)明顯高于C1組,但12周時(shí)低于C1組,表明C2組染塵后期炎細(xì)胞表達(dá)有所降低,可能與其早期就有纖維化的形成有關(guān),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與HE染色中C2組(圖7)在早期就觀察到纖維組織形成結(jié)果一致,并提示精細(xì)研磨后ZrO2粉塵對(duì)大鼠肺組織早期炎性作用明顯。

隨著炎癥的發(fā)展,巨噬細(xì)胞吞噬粉塵顆粒,細(xì)胞活化并產(chǎn)生大量炎性因子,白介素作為一種重要的細(xì)胞因子,在調(diào)控塵肺炎癥和纖維化過程中發(fā)揮了重要的作用,其中IL-6能促使黏附分子浸潤到肺中,誘導(dǎo)膠原的合成,抑制膠原的降解[21],研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞因子IL-6在患有肺纖維化的小鼠和人類中明顯升高[22],IL-6等促炎細(xì)胞因子的增加以及中性粒細(xì)胞內(nèi)流是肺囊性纖維化炎癥的顯著早期特征[23]。IL-16又稱淋巴細(xì)胞趨化因子,Zhou等[24]發(fā)現(xiàn)IL-16在小鼠肺損傷及纖維化過程中明顯增高,Glass等[25]發(fā)現(xiàn),在博來霉素引起的大鼠肺纖維化中IL-16發(fā)揮了重要作用,可以作為一種肺纖維化的候選指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中染塵大鼠BALF中IL-6與IL-16含量變化趨勢(shì)一致,各染塵組12周IL-6與IL-16的含量較3周、6周時(shí)增加更明顯,可能與12周時(shí),肺組織結(jié)構(gòu)逐漸纖維化有關(guān)[23-25],IL-6與IL-16的變化說明3種齒科粉塵對(duì)大鼠肺組織均有損傷,可導(dǎo)致大鼠早期肺炎癥反應(yīng)及早期纖維化改變,與HE染色結(jié)果相符。12周時(shí)Vitallium及ZrO2粉塵精細(xì)研磨組與未研磨組相比,IL-6與IL-16含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明Vitallium及ZrO2粉塵經(jīng)精細(xì)研磨后對(duì)大鼠肺組織的損傷作用及早期纖維化作用增強(qiáng)。

綜上所述,Vitallium金屬、ZrO2全瓷、PMMA樹脂3種齒科粉塵研磨前后,均能引起染塵大鼠肺組織炎性損傷,齒科臨床醫(yī)師長期暴露于齒科粉塵顆粒環(huán)境下可能會(huì)引起肺組織炎癥甚至損傷,金屬及瓷粉粉塵粒徑越小其致病力可能越強(qiáng),具體損傷機(jī)制及程度,有待進(jìn)一步研究。