宋韶鶴,苗晉鑫,王 崢,張春敭,苗明三

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州 450000;2.河南中醫(yī)藥大學(xué),鄭州 450046;3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州 450052)

食管癌(esophageal cancer,EC)是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率分別居全球惡性腫瘤的第8位和第6位,且逐年上升和趨于年輕化[1]。我國(guó)是食管癌高發(fā)地區(qū),食管癌發(fā)病率和死亡率均居世界首位,且新發(fā)病例占據(jù)世界新發(fā)食管癌病例一半以上[2]。食管癌主要有兩種病理組織類型,食管腺癌(esophageal adeno-carcinoma,EAC)和食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinaoma,ESCC)[3],我國(guó)食管癌類型主要是食管鱗癌[4]。盡管現(xiàn)代治療技術(shù)取得了新的進(jìn)展,但是食管癌預(yù)后仍然很差,5年生存率不足20%[5-6]?，F(xiàn)今,中藥防治腫瘤受到更多關(guān)注,臨床研究顯示中藥能顯著提高食管癌患者免疫能力、逆轉(zhuǎn)化療藥物的耐藥性以及改善預(yù)后[7-8]。但是,中藥防治食管癌的分子機(jī)制尚不完全清楚。因此,了解這些機(jī)制對(duì)中藥改善食管癌患者的預(yù)后至關(guān)重要。食管癌小鼠模型是研究EC發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療腫瘤策略進(jìn)行臨床前測(cè)試重要的實(shí)驗(yàn)工具。本文回顧了目前常用的EC小鼠模型,包括化學(xué)誘導(dǎo)性食管癌模型、移植性食管癌模型、基因工程小鼠模型。對(duì)每種EC小鼠模型的制備方法、模型特點(diǎn)及使用范圍進(jìn)行闡述和比較,為食管癌小鼠模型的發(fā)展和中醫(yī)藥防治食管癌的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 誘發(fā)性食管癌小鼠模型

誘發(fā)性食管癌小鼠模型多為致癌因素與動(dòng)物的食管直接或間接接觸,使食管發(fā)生癌變,形成食管癌動(dòng)物模型?；瘜W(xué)法是誘發(fā)動(dòng)物食管癌常用的方法之一,通過(guò)化學(xué)致癌物使小鼠致癌,建立化學(xué)誘導(dǎo)小鼠食管癌模型。化學(xué)致癌物的劑量、給藥方案、小鼠品系和年齡等諸多因素影響化學(xué)致癌物誘發(fā)腫瘤發(fā)生率。亞硝胺類致癌物是食管癌誘發(fā)模型的誘癌劑,但是相關(guān)法律規(guī)定亞硝胺類化學(xué)物不在用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本文重點(diǎn)介紹,4-硝基喹啉-N-氧化物(4-NQO)誘發(fā)小鼠食管癌以及致癌物結(jié)合轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究食管癌。

4-NQO是一種水溶性的喹啉衍生物,在體內(nèi)4-NQO主要在還原酶的作用下引起DNA單鏈斷裂、堿基缺失和氧化堿基等DNA的損傷而產(chǎn)生癌變。由于食管分布較多的4-NQO還原酶,所以食管是4-NQO作用的主要靶器官之一。Tang等[9]首先用100μg/mL的4-NQO放入水中,使C57BL/6或CBA小鼠自由飲水16周,然后用正常水繼續(xù)喂養(yǎng)12周,28周病理組織觀察所有的小鼠食管出現(xiàn)扁平的鱗狀異型增生,外生性乳頭鱗狀腫瘤和浸潤(rùn)性鱗狀細(xì)胞癌等食管鱗癌特征。杜展等[10]用同樣的方法建立食管癌模型,利用食管拉網(wǎng)的方法檢測(cè)12周的小鼠食管,病理組織學(xué)發(fā)現(xiàn)食管上皮不典型增生,且分別在第16、20和24周觀察到浸潤(rùn)性食管鱗癌的發(fā)生。研究人員利用復(fù)方化濁潤(rùn)燥降氣方能有效減輕4-NQO誘導(dǎo)的小鼠食管癌前病變模型的病理?yè)p害程度,確定復(fù)方化濁潤(rùn)燥降氣方能夠預(yù)防和治療小鼠食管癌前病變[11]。Zheng等[12]在飲水中用18μg/mL 4-NQO處理雌雄各8只129J/C57B6/L小鼠8周,然后換成常規(guī)飲用水處理10周,結(jié)果在第18周結(jié)束時(shí),小鼠食管既有腺癌又有鱗狀細(xì)胞癌兩種類型,且雄性小鼠對(duì)ESCC的腫瘤發(fā)生更敏感。呂翠田等[13]利用六君子湯對(duì)4-NQO誘導(dǎo)的食管癌小鼠干預(yù),六君子湯組小鼠活動(dòng)較正常,體重下降不明顯;與模型組相比,六君子湯組顯著提高CD4+/CD8+T細(xì)胞比例,提高IL-10等細(xì)胞因子水平提升機(jī)體免疫功能,糾正CD4+/CD8+T細(xì)胞比例改善免疫功能失衡及免疫抑制。

許多基因工程小鼠對(duì)4-NQO誘導(dǎo)的食管癌變表現(xiàn)出更高的敏感性。王立群等[14]利用4-NQO誘導(dǎo)SLC39A5基因敲除的C57BL/6小鼠和野生C57BL/6小鼠食管癌模型的成瘤情況,SLC39A5基因敲除小鼠誘導(dǎo)成瘤率低于野生小鼠,確定SLC39A5基因?qū)κ彻馨┌l(fā)生有影響。另外,miR-31過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型和Cyclin D1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠,Nrf2基因敲除小鼠模型和p53突變小鼠模型結(jié)合4-NQO飲水誘導(dǎo)更易于誘發(fā)食管鱗狀細(xì)胞癌[15]。以上研究提示,誘發(fā)性食管癌模型制備方法穩(wěn)定,致癌部位集中在上消化道,成模率高,模擬了食管癌動(dòng)態(tài)發(fā)展過(guò)程,有助于食管癌變機(jī)制與形態(tài)學(xué)的研究。但是化學(xué)誘導(dǎo)的食管癌病變演變迅速和成瘤部位難確定,需要控制造模時(shí)間。

2 移植性食管癌小鼠模型

移植性食管癌小鼠模型是將食管癌組織或細(xì)胞系接種于小鼠體內(nèi)形成食管癌動(dòng)物模型。根據(jù)不同的移植部位,分為異位移植(皮下或腹腔)與原位移植(食管)[16-17];根據(jù)不同的移植腫瘤處理方式,分為細(xì)胞移植和組織塊移植。同種移植(動(dòng)物之間)模型在食管癌中研究很少,我們不做闡述。異種移植(人與動(dòng)物之間)食管癌小鼠模型是目前應(yīng)用最多的食管癌動(dòng)物模型,主要將人食管癌細(xì)胞或人食管癌組織接種于免疫缺陷小鼠而建立的模型。本文主要介紹皮下異種移植瘤模型與原位異種移植瘤模型。

2.1 皮下異種移植瘤模型

皮下異種移植瘤是指將人的食管癌細(xì)胞系或患者食管癌組織接種于免疫缺陷小鼠的皮下,使免疫缺陷小鼠皮下形成腫瘤。多種人食管鱗癌細(xì)胞株KYSE-270、KYSE-70、KYSE-30以及食管腺癌細(xì)胞株OACM5.1和SK-GT-4等用于皮下細(xì)胞系異種移植(cell-line-derived xenograft,CDX)模型的建立[18]。彭海燕等[19]將食管鱗癌Eca109細(xì)胞接種裸鼠皮下,建立食管鱗癌移植瘤模型,體內(nèi)評(píng)價(jià)槲寄生堿抑制食管癌移植瘤生長(zhǎng)和延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期。利用Eca109建立裸鼠皮下異種移植瘤模型評(píng)價(jià)啟膈化痰合劑對(duì)順鉑治療小鼠有增效作用[20]。Crescenzi等[21]將1×106食管鱗癌Kyse-30細(xì)胞皮下接種重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠雙背外側(cè),成功建立了ESCC皮下移植瘤模型。Ma等[22]利用食管Eca109細(xì)胞皮下異種移植裸鼠建立食管癌小鼠模型,通過(guò)體內(nèi)模型闡明雙氫青蒿素(青蒿素衍生物)可能通過(guò)細(xì)胞阻滯誘導(dǎo)自噬。柏文等[23]利用綠色熒光蛋白(GFP)和熒光素酶(Luc)雙標(biāo)記ECA109細(xì)胞建立光學(xué)EC腫瘤模型,動(dòng)態(tài)觀察ECA109食管癌細(xì)胞在裸鼠皮下生長(zhǎng)過(guò)程。雖然遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是EC的常見(jiàn)現(xiàn)象,但是極少有研究報(bào)道食管癌皮下異種移植模型發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。Liu等[24]比較了8種食管癌細(xì)胞分別接種4種不同類型的免疫缺陷小鼠,發(fā)現(xiàn)5×106的食管腺癌FLO-1細(xì)胞皮下接種12只NOD-SCID IL-2RγKO(NSG)小鼠和5只NOD-SCID小鼠均能皮下成瘤,但只有11只NSG小鼠發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移。細(xì)胞系移植皮下腫瘤生長(zhǎng)速度快且可以直接評(píng)估腫瘤的生長(zhǎng),但是細(xì)胞系缺乏腫瘤異質(zhì)性,無(wú)法反應(yīng)有限數(shù)量細(xì)胞引起的人類腫瘤發(fā)展等局限性。

由于皮下CDX移植模型的局限性,研究人員開(kāi)發(fā)患者來(lái)源的異種移植(patient-derived tumor xenograft,PDX)模型用于腫瘤的研究。Zou等[25]利用EC患者手術(shù)切除的新鮮食管鱗癌組織皮下植于SCID小鼠,成功建立ESCC PDX移植小鼠模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ESCC PDX在組織病理學(xué)特征和化學(xué)敏感性與原發(fā)性腫瘤高度吻合。PDX保留了人類腫瘤的原始結(jié)構(gòu)和基質(zhì)成分,并保留了人腫瘤的異質(zhì)性,產(chǎn)生PDX的原始組織可以在體內(nèi)連續(xù)擴(kuò)增等優(yōu)勢(shì)。但是較長(zhǎng)的模型建立時(shí)間和需要免疫缺陷宿主限制了該動(dòng)物模型的擴(kuò)大應(yīng)用。

2.2 原位異種移植瘤模型

皮下移植瘤模型不是自然形成的腫瘤,難以模擬人類食管癌原位生長(zhǎng)的情況以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特征,與皮下模型相比,原位移植模型是研究EC更好的選擇。原位移植是在食管接種人的食管癌細(xì)胞或組織,數(shù)周后腫瘤形成并發(fā)生腫瘤侵襲及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。Gros等[26]利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法獲得GFP穩(wěn)定表達(dá)的人食管腺癌PT1590細(xì)胞,將PT1590-GFP細(xì)胞皮下注射裸鼠,腫瘤發(fā)生后無(wú)菌切除、破碎,通過(guò)手術(shù)將1 mm3的腫瘤塊植入小鼠腹部食管胞漿,建立模擬EAC患者原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)以及肝、肺和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型。另有研究利用熒光素酶標(biāo)記人食管鱗癌TE8細(xì)胞,2×106細(xì)胞注射裸鼠腹段食管,利用小動(dòng)物活體成像發(fā)現(xiàn)3周開(kāi)始出現(xiàn)食管腫瘤,表明成功建立了ESCC原位移植模型[27]。有報(bào)道利用生物發(fā)光成像技術(shù)建立ESCC原位移植模型,用于評(píng)價(jià)藥物作用[28]。原位移植模型模擬了患者食管癌發(fā)生的局部和轉(zhuǎn)移特征,且能夠短期內(nèi)檢測(cè)藥物的療效及治療策略。但是由于解剖部位特殊和移植手術(shù)的復(fù)雜,此模型應(yīng)用受到限制。另外,由于是免疫缺陷小鼠,無(wú)法研究腫瘤與宿主相關(guān)因素。

3 基因工程食管癌小鼠模型

誘發(fā)性食管癌小鼠模型是研究環(huán)境因素的必要?jiǎng)游锬Ｐ?而腫瘤的發(fā)生和發(fā)展還受體內(nèi)多基因的變化和多因素的累積等綜合影響。因此,需要基因工程小鼠模型的建立,該模型加強(qiáng)了對(duì)癌癥生物學(xué)的理解,可用于明確基因功能以及鑒別新的癌癥基因和腫瘤生物標(biāo)志物在食管癌的作用,提高對(duì)食管癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)[29]。基因編輯技術(shù)可構(gòu)建基因敲入和敲除以及條件/誘導(dǎo)動(dòng)物模型[30-31]。本文主要闡述轉(zhuǎn)基因食管癌小鼠模型和基因敲除食管癌小鼠模型(表1)。

表1 化學(xué)誘導(dǎo)和基因工程改造的食管癌小鼠模型Table 1 Comparison of mouse models of esophageal cancer

3.1 轉(zhuǎn)基因食管癌小鼠模型

不同組織和細(xì)胞的特異性啟動(dòng)子已被用于研究食管功能。皰疹病毒(EBV)的ED-L2啟動(dòng)子在上皮細(xì)胞中表達(dá),尤其在食管的基底層的分化細(xì)胞中更具活性。E D-L2在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中靶向細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1),導(dǎo)致食管鱗狀細(xì)胞發(fā)育不良和食管的癌前病變[35]。此小鼠模型具有嚴(yán)重的不典型增生特點(diǎn),其核細(xì)胞質(zhì)比例異常,導(dǎo)致口腔和食道發(fā)育異常,這是癌癥的重要前兆。與p53基因缺失的小鼠雜交的ED-L2/Cyclin D1小鼠發(fā)生食管鱗癌,其中約三分之一的小鼠發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[32]。Tetreault等[33]采用ED-L2啟動(dòng)子在小鼠食管上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Krüppel樣因子4(Klf4)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,建立轉(zhuǎn)基因食管癌小鼠模型。該小鼠模型出現(xiàn)食管鱗狀上皮不典型增生和鱗狀細(xì)胞癌。除了轉(zhuǎn)基因ESCC小鼠模型,研究人員還開(kāi)發(fā)了轉(zhuǎn)基因EAC小鼠模型。Quante等[34]構(gòu)建ED-L2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞因子1β(IL-1β)在食管過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠,發(fā)現(xiàn)IL-1β過(guò)表達(dá)的小鼠在6個(gè)月時(shí)出現(xiàn)中度炎癥,在12~15個(gè)月時(shí)出現(xiàn)巴雷特化生,到20~22個(gè)月時(shí),小鼠會(huì)發(fā)展為高度不典型增生或食管腺癌。這些轉(zhuǎn)基因小鼠模型可以準(zhǔn)確地概括人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)的遺傳改變,并研究相關(guān)基因與食管癌發(fā)生的相互作用。

3.2 基因敲除食管癌小鼠模型

Stairs等[35]使用ED-L2啟動(dòng)子和條件性敲除p120-catenin基因的小鼠,在9~12個(gè)月時(shí)會(huì)導(dǎo)致食管、前胃和口腔發(fā)生不典型增生和浸潤(rùn)性鱗狀細(xì)胞癌的形成。最早在L2Cre;p120ctnloxP/loxP小鼠4月齡時(shí),即可發(fā)生食管癌浸潤(rùn)。p120-catenin基因敲除小鼠模型概括了人類的ESCC特征,同時(shí)驗(yàn)證了p120-catenin的抑癌作用。研究提示,該模型為食管和口腔鱗狀細(xì)胞癌早期診斷與治療策略提供新的動(dòng)物模型。

4 其他

食管癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型報(bào)道數(shù)量有限。靜脈內(nèi)注射癌細(xì)胞是通常用于癌細(xì)胞進(jìn)入遠(yuǎn)端器官的造模方法。Wang等[36]通過(guò)小鼠尾靜脈注射1×106食管鱗癌KYSE150細(xì)胞建立食管癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型,發(fā)現(xiàn)注射腫瘤細(xì)胞35 d后出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。在肺轉(zhuǎn)移模型中,云南藤黃提取的天然化合物oblongifolin C能有效抑制肺轉(zhuǎn)移[36]。另一項(xiàng)研究將5×106YES-2食管鱗癌細(xì)胞腹腔注射SCID小鼠,導(dǎo)致食管鱗癌細(xì)胞在腹膜腔中定植并產(chǎn)生血性腹水,建立腹膜轉(zhuǎn)移小鼠模型[37]。該模型用于評(píng)價(jià)三萜類化合物和抗癌藥物的組合治療效果,結(jié)果表明三萜類化合物增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對(duì)食管癌的化療作用。這些模型雖然不能模擬發(fā)生在患者上的完整轉(zhuǎn)移過(guò)程和可能掩蓋對(duì)轉(zhuǎn)移生物學(xué)的理解,但是可用于評(píng)價(jià)抗轉(zhuǎn)移中藥及其化學(xué)成分的驗(yàn)證。

5 結(jié)論與展望

中醫(yī)藥對(duì)改善食管癌患者生存質(zhì)量,提高生存預(yù)后有較好的作用。食管癌小鼠模型對(duì)中醫(yī)理論的實(shí)踐和中藥抗食管癌的評(píng)價(jià)至關(guān)重要。比較分析食管癌小鼠模型特征發(fā)現(xiàn)(表2),誘發(fā)性食管癌小鼠模型能很好模擬人類食管癌發(fā)生和發(fā)展病理過(guò)程,是良好的食管癌及其癌前病變的誘發(fā)性食管癌模型,用于研究特定化學(xué)物對(duì)食管的致癌作用及多種中醫(yī)藥(化濁潤(rùn)燥降氣方、六君子湯)抗食管癌及癌前病變的研究[13,38];移植性食管癌小鼠模型較好模擬食管癌的主要臨床特征,可用于研究食管癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移研究以及為食管癌開(kāi)發(fā)新的療法,為臨床實(shí)踐做出貢獻(xiàn);基因工程食管癌小鼠模型可用于研究特定基因功能對(duì)食管癌的影響,以及食管癌發(fā)生的細(xì)胞與分子機(jī)制,有助于了解腫瘤生物學(xué)特性。移植性小鼠模型是腫瘤研究、開(kāi)發(fā)和評(píng)價(jià)中醫(yī)藥抗腫瘤應(yīng)用最多的動(dòng)物模型[39-42]。皮下移植模型易操作、成瘤快和成功率高,但較少的轉(zhuǎn)移限制其應(yīng)用;原位移植模型模擬食管癌體內(nèi)發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過(guò)程,符合食管癌臨床實(shí)際。以上常見(jiàn)的食管癌小鼠模型各具特色,應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的小鼠模型。最大化的發(fā)揮食管癌小鼠模型的潛力,多種模型相結(jié)合,更好地了解食管癌發(fā)病機(jī)理及中藥防治抗腫瘤的分子機(jī)制。隨著對(duì)食管癌研究的不斷深入和技術(shù)的進(jìn)步,食管癌小鼠模型能更好的模擬人類患者食管癌,探索食管癌發(fā)病及中藥治療機(jī)制。為食管癌小鼠模型的開(kāi)發(fā)及抗食管癌中藥的評(píng)價(jià)提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

表2 食管癌小鼠模型Table 2 Mouse models of esophageal cancer