蘇紅見,喬亞紅*,安云霞,韓 利

(1.河南省胸科醫(yī)院呼吸與危重癥二病區(qū),鄭州 450003;2.河南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,鄭州 450003)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種氣流受限疾病,表現(xiàn)為氣流受阻不可逆,并呈進(jìn)行性變化,且肺、氣管、支氣管因有害物質(zhì)導(dǎo)致的慢性炎癥疾病[1]。吸煙是COPD發(fā)生的最主要原因,生物燃料的大量采集和消耗亦促進(jìn)COPD發(fā)生[2]。目前尚無根治COPD的有效方法,二甲雙胍(metformin,Met)作為經(jīng)典的降壓藥,是臨床上2型糖尿病的首選藥物[3];隨著研究深入,Met還有抗炎、抗氧化、保護(hù)心血管系統(tǒng)等功效,在多發(fā)性硬化癥中能夠降低炎癥因子白介素-6的表達(dá)[4];在COPD中能減輕肺部炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激,從而改善肺功能[5],但針對(duì)其具體作用機(jī)制尚不清楚。微小RNA(microRNA,miRNA)可影響其他物質(zhì)水平而發(fā)揮抗氧化和抗炎作用,已成為臨床上最具潛力的生物標(biāo)志物[6],且Met能夠調(diào)控miRNA的表達(dá)從而影響多囊卵巢綜合癥患者卵丘顆粒細(xì)胞增殖和凋亡,從而影響疾病[7]。推測(cè)Met可能影響miRNA水平而影響疾病。本文建立COPD大鼠模型,Met處理觀察對(duì)COPD的影響,并觀察miR-34a高表達(dá)是否影響其作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

54只SPF級(jí)SD大鼠,雄性、9周齡,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2018-0021],在河南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心暫養(yǎng)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[SYXK(豫)2019-0001],體重(250±10)g。將動(dòng)物置于溫度(24.5±0.5)℃、濕度(50±5)%、12 h光照/12 h黑暗環(huán)境中飼養(yǎng),正常飲食,通風(fēng)良好。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核并通過(20190017),實(shí)驗(yàn)符合3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)試劑盒(Solarbio公司,貨號(hào)分別為:L8880-10 mg、L9406);鹽酸Met片(悅康藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H-20184075);agomir NC、miR-34a agomir均購(gòu)自廣州銳博生物科技公司;引物由莖環(huán)法+染料法設(shè)計(jì)、上海生工生物工程有限公司合成;wright染色試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):DM0004);大鼠白介素(interleukin,IL)-6、IL-8、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、一抗兔抗沉默信息調(diào)節(jié)因子1(sirtuin 1,sirt1)(英國(guó)abcam公司,貨號(hào)分別為:ab213777、ab108869、ab188865、ab263899、ab110304)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)儀(賽默飛世爾,型號(hào):PikoREAL);蛋白凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Bad公司,型號(hào):170-8200)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物建模及分組

參照文獻(xiàn)[8]制備COPD模型:將44只大鼠放置在點(diǎn)燃8支香煙的煙熏箱中煙熏,每天煙熏30 min,持續(xù)30 d,并在第1、14、28天經(jīng)氣道滴注2 mL LPS溶液(鹽水溶解為1 g/L LPS),氣道滴注當(dāng)日不進(jìn)行煙熏。造模過程中死亡4只,其余40只大鼠隨機(jī)分為模型(model)組、Met組、Met+陰性對(duì)照(Met+agomir NC)組、Met+miR-34a高表達(dá)(Met+miR-34a agomir)組,每組10只。另取10只大鼠在第1、14、28天經(jīng)氣道滴注2 mL生理鹽水為對(duì)照(control)組。模型處理后第2天Met組每天灌胃230 mg/kg Met[5],Met+陰性對(duì)照組灌胃230 mg/kg Met、尾靜脈注射1μmol/L agomir NC,Met+miR-34a高表達(dá)組灌胃230 mg/kg Met、尾靜脈注射1μmol/L miR-34a agomir,每天1次、連續(xù)2周。

1.3.2 樣品收集

實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)所有大鼠稱重,觀察大鼠情況。麻醉大鼠切開胸腔,暴露出心臟,心臟取血約5 mL;右主支氣管結(jié)扎,套管針在隆突后穿刺進(jìn)入左肺,2 mL生理鹽水灌洗左肺,緩慢回抽,每次回抽約1.5 mL液體,反復(fù)灌洗3次,對(duì)支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)細(xì)胞計(jì)數(shù)。取右肺,部分置于4%多聚甲醛中固定;部分置于-80℃冰箱保存待檢。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)肺組織中miR-34a水平

-80℃取部分肺組織,RNA提取試劑盒提取總RNA、cDNA合成試劑盒合成第一條鏈cDNA,qRTPCR儀對(duì)miR-34a、U6擴(kuò)增。引物序列miR-34a F:5’-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTG-3’、R:5’-GGCAG TATACTTGCTGATTGCTT-3’;U6 F:5’-CTCGCTTC GGCAGCACA-3’、R:5’-AACGCTTCACGAATTTG CGT-3’。上樣體系20μL:cDNA(50 ng/μL)1μL,F/R(10μmol/L)(0.5/0.5)μL,2×Hi SYBR Green QPCR Mix 10μL,ddH2O 8.0μL。反應(yīng)條件:95℃、5 min;94℃、50 s,55.6℃、40 s,40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCT法計(jì)算肺組織中miR-34a水平。

1.3.4 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類

4℃、1200 r/min離心BALF 10 min,離心后取細(xì)胞沉渣,PBS重懸后檢測(cè)白細(xì)胞總數(shù)。取部分細(xì)胞沉渣,調(diào)整濃度后wright染色,計(jì)數(shù)每200個(gè)白細(xì)胞中的中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比例。

1.3.5 HE檢測(cè)肺組織形態(tài)

4%多聚甲醛中固定的肺組織,脫水后石蠟包埋,切片(厚度:6μm)。經(jīng)蘇木精染色、伊紅復(fù)染后顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)。

1.3.6 ELISA檢測(cè)血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平

心臟血室溫靜置2 h,3000 r/min室溫離心10 min,取血清,ELISA試劑盒檢測(cè)血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平。

1.3.7 Western blot檢測(cè)肺組織中sirt1蛋白水平

-80℃冰箱中取部分肺組織,冰上研磨并裂解,4℃、16000 r/min離心20 min,上清為總蛋白,凝膠電泳分離蛋白、PVDF膜轉(zhuǎn)膜;5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;對(duì)應(yīng)加入一抗sirt1、GAPDH,4℃孵育過夜;加入對(duì)應(yīng)二抗,室溫孵育2 h。蛋白凝膠成像儀拍照和灰度分析。

1.3.8 雙熒光素酶鑒定miR-34a與sirt1的靶向關(guān)系

TargetScan查找sirt1 mRNA的3′UTR與miR-34a結(jié)合位點(diǎn)。設(shè)計(jì)合成sirt1的野生型(sirt13′UTR WT)和突變型(sirt13′UTR MUT),分別與miR-34a mimic或miR-34a mimic NC共轉(zhuǎn)染至293 T細(xì)胞,雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較行單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Met對(duì)大鼠一般情況影響

實(shí)驗(yàn)前,對(duì)照組、模型組、Met組、Met+陰性對(duì)照組、Met+miR-34a高表達(dá)組體重分別為(246.16±8.16)g、(245.76±6.97)g、(246.58±7.43)g、(251.16±7.91)g、(247.33±6.93)g,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)照組、模型組、Met組、Met+陰性對(duì)照組、Met+miR-34a高表達(dá)組體重分別為(316.15±16.59)g、(271.19±19.45)g、(306.11±11.36)g、(305.91±10.67)g、(284.73±9.73)g,與對(duì)照組比,模型組體重降低(P＜0.05);與模型組相比,Met組、Met+陰性對(duì)照組體重升高(P＜0.05);分別與Met組、Met+陰性對(duì)照組比,Met+miR-34a高表達(dá)組體重降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

對(duì)照組大鼠飲食飲水正常,毛發(fā)潤(rùn)澤、色澤度好,無口鼻分泌物、無咳嗽現(xiàn)象,且反應(yīng)敏捷、呼吸平穩(wěn);模型組大鼠飲食飲水減少,毛色干枯、缺少光澤,有口鼻分泌物、咳嗽出現(xiàn),反應(yīng)遲鈍、呼吸急促;Met組和Met+陰性對(duì)照組大鼠飲食飲水量相較于模型組增加,口鼻分泌物減少、咳嗽減輕,反應(yīng)欠敏感,呼吸出現(xiàn)急促現(xiàn)象但不明顯;Met+miR-34a高表達(dá)組狀況介于模型組和Met組之間。

2.2 Met對(duì)大鼠肺組織中miR-34a的影響

RNA鑒定結(jié)果見圖1。對(duì)照組、模型組、Met組、Met+陰性對(duì)照組、Met+miR-34a高表達(dá)組肺組織中miR-34a水平分別為1.01±0.13、2.49±0.06、1.46±0.15、1.84±0.16、2.15±0.21,與對(duì)照組比,模型組肺組織中miR-34a水平升高(P＜0.05);與模型組比,Met組、Met+陰性對(duì)照組肺組織中miR-34a水平降低(P＜0.05);分別與Met組、Met+陰性對(duì)照組比,Met+miR-34a高表達(dá)組肺組織中miR-34a水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 5組大鼠肺組織RNA 1%瓊脂糖膠凝膠電泳Note.A,Control group.B,Model group.C,Met group.D,Met+agomir NC group.E,Met+miR-34a agomir group.(The same as below)Figure 1 Lung tissue RNA 1% agarose gel electrophoresis of 5 groups of rats

2.3 Met對(duì)大鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

與對(duì)照組相比,模型組BALF中白細(xì)胞數(shù)量,中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比例升高,單核-巨噬細(xì)胞比例降低(P＜0.05);與模型組相比,Met組、Met+陰性對(duì)照組BALF中白細(xì)胞數(shù)量,中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比例降低,單核-巨噬細(xì)胞比例升高(P＜0.05);分別與Met組、Met+陰性對(duì)照組相比,Met+miR-34a高表達(dá)組BALF中白細(xì)胞數(shù)量,中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比例升高,單核-巨噬細(xì)胞比例降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2、圖3。

圖2 5組大鼠BALF中wright染色結(jié)果Figure 2 Wright staining results in BALF of 5 groups of rats

圖3 5組大鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)比較Note.Compared with control group,*P＜0.05.Compared with model group,#P＜0.05.Compared with Met group,△P＜0.05.Compared with Met+antagomic NC group,▲P＜0.05.Figure 3 Comparison of cell counts in BALF of 5 groups of rats

2.4 Met對(duì)大鼠肺組織形態(tài)影響

對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡排列整齊均勻,無明顯間隔破壞。模型組大鼠肺組織氣管及支氣管粘液腺增多,腺管擴(kuò)張,氣道平滑肌肥大,支氣管黏膜上皮細(xì)胞纖毛粘連,小氣道平滑肌增生及纖維化,管腔內(nèi)可見不同程度粘液栓及大量炎性細(xì)胞,肺泡管、肺泡囊、肺泡膨脹,肺泡融合,肺泡簡(jiǎn)單化,形成肺大泡。Met組與Met+陰性對(duì)照組類似,肺泡結(jié)構(gòu)有所緩解,炎癥現(xiàn)象不明顯;Met+miR-34a高表達(dá)組肺泡結(jié)構(gòu)與模型組類似。見圖4。

圖4 5組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)情況Figure 4 Morphology of the lung tissues of the 5 groups of rats

2.5 Met對(duì)大鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平的影響

與對(duì)照組相比,模型組血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平升高(P＜0.05);與模型組相比,Met組、Met+陰性對(duì)照組血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平降低(P＜0.05);分別與Met組、Met+陰性對(duì)照組相比,Met+miR-34a高表達(dá)組血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 5組大鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平比較(pg/mL)Table 1 Comparison of serum levels of IL-6,IL-8,IL-1βand TNF-αin the 5 groups of rats

2.6 Met對(duì)大鼠肺組織中sirt1蛋白的影響

對(duì)照組、模型組、Met組、Met+陰性對(duì)照組、Met+miR-34a高表達(dá)組肺組織中sirt1水平分別為1.16±0.21、0.11±0.02、0.86±0.06、0.84±0.08、0.36±0.04,與對(duì)照組相比,模型組肺組織中sirt1蛋白水平降低(P＜0.05);與模型組相比,Met組、Met+陰性對(duì)照組肺組織中sirt1蛋白水平升高(P＜0.05);分別與Met組、Met+陰性對(duì)照組相比,Met+miR-34a高表達(dá)組肺組織中sirt1蛋白水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖5。

圖5 5組大鼠肺組織中sirt1蛋白表達(dá)情況Figure 5 Protein expression of sirt1 in the lung tissues of the 5 groups of rats

2.7 雙熒光素酶驗(yàn)證miR-34a與sirt1的靶向關(guān)系

Targetscan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,sirt1基因3′UTR區(qū)存在與miR-34a結(jié)合位點(diǎn),見圖6。熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證二者的靶向關(guān)系。miR-34a NC+3′UTR-WT、miR-34a mimic+3′UTR-WT、miR-34a NC+3′UTRMUT、miR-34a mimic+3′UTR-MUT的熒光素酶相對(duì)活性分別為1.02±0.11、0.43±0.04、0.98±0.08、0.99±0.08,與miR-34a NC+3′UTR-WT組相比,miR-34a+3′UTR-WT組細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性下降(P＜0.05)。

圖6 sirt1與miR-34a結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)Figure 6 Prediction of the binding site of sirt1 and miR-34a

3 討論

COPD會(huì)造成大鼠體重減輕、飲食飲水減少,毛色干枯,口鼻中出現(xiàn)分泌物、出現(xiàn)咳嗽等現(xiàn)象,鑒定BALF,發(fā)現(xiàn)BALF中白細(xì)胞數(shù)量,中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比例升高,單核-巨噬細(xì)胞比例降低;提示COPD中出現(xiàn)明顯的炎癥現(xiàn)象。COPD長(zhǎng)期慢性炎癥可影響肺實(shí)質(zhì)和周圍呼吸道,炎癥主要特征為肺泡巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等淋巴樣細(xì)胞數(shù)量增加,促進(jìn)分泌多種促炎性介質(zhì),包括細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子和脂質(zhì)介質(zhì)的分泌,從而加速DNA損傷、促進(jìn)細(xì)胞衰老,加重疾病[9-10]。而Met具有抗炎作用,在百草枯誘發(fā)的急性肺損傷中可降低血漿及肺組織中IL-6、TNF-α水平,并減輕肺組織病理?yè)p傷[11]。本研究中使用Met后可緩解肺組織氣管及支氣管粘液腺增多、炎性細(xì)胞過多現(xiàn)象,從而減輕肺泡管、肺泡囊、肺泡膨脹,肺泡逐漸恢復(fù)。但具體作用機(jī)制尚不清楚。

miRNA可普遍存在于真核細(xì)胞中,進(jìn)化上高度保守,具有組織和時(shí)序特異性,在慢性氣道炎癥性疾病哮喘中參與氣道炎癥調(diào)節(jié),與基質(zhì)金屬蛋白酶、炎癥反應(yīng)、一系列信號(hào)通路關(guān)系密切,且通過改變miRNA在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)水平可改變氣道嗜酸性粒細(xì)胞、氣道黏液分泌、Th1/Th2細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)情況,從而影響疾病[12]。miR-29b通過靶向溴結(jié)構(gòu)域蛋白4可調(diào)節(jié)香煙提取物誘導(dǎo)的IL-8表達(dá),從而參與COPD的氣道炎癥,且血漿miR-29b可以作為COPD疾病嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物[13]。miR-34包括miR-34a、miR-34b、miR-34c,與肺的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,與肺支氣管發(fā)育不良、COPD、肺癌、肺動(dòng)脈高壓等肺部疾病關(guān)系密切[14],上調(diào)miR-34c-5p可降低動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性和降低由于COPD升高引起的呼吸頻率及氣道阻力以及BALF中IL-8和TNF-α的水平升高現(xiàn)象,從而緩解炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡破裂、肺泡腔擴(kuò)大和膠原纖維沉積增加,平均線性截距增加和平均肺泡數(shù)降低現(xiàn)象[15]。在本研究中模型組肺組織中miR-34a水平上調(diào),miR-34a在COPD中表達(dá)上調(diào),與肺功能關(guān)系密切,可能是肺功能損傷的直接指標(biāo)[16]。miR-34a與氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)關(guān)系密切,miR-34a水平升高明顯加重機(jī)體氧化應(yīng)激損傷、促進(jìn)炎癥反應(yīng)[17]。miR-34a需要調(diào)控靶基因發(fā)揮生物學(xué)作用,研究發(fā)現(xiàn),在潰瘍性結(jié)腸炎中miR-34a水平升高可抑制靶基因sirt1的表達(dá)從而加重氧化應(yīng)激、促進(jìn)炎癥損傷[18]。sirt1被稱為長(zhǎng)壽基因,在吸煙者體中sirt1水平降低可誘導(dǎo)金屬蛋白酶抑制劑-1乙酰化進(jìn)而加重肺損傷[19]。上調(diào)sirt1的表達(dá)來減輕香煙煙霧引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,從而預(yù)防COPD[20-21]。表明在COPD中煙熏可誘導(dǎo)miR-34a上調(diào),促進(jìn)分泌多種促炎性介質(zhì),包括IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α等的分泌從而加重炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡破裂、肺泡腔擴(kuò)大和膠原纖維沉積增加現(xiàn)象,從而加重疾病。而使用Met后炎癥因子水平降低,肺泡破裂、肺泡腔擴(kuò)大現(xiàn)象得以緩解。添加miR-34a逆轉(zhuǎn)Met作用,提示Met可能通過下調(diào)miR-34a表達(dá)輕炎癥水平,實(shí)現(xiàn)對(duì)COPD大鼠的保護(hù)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miR-34a與sirt1存在靶向關(guān)系,提示Met下調(diào)miR-34a的表達(dá),從而促進(jìn)sirt1的表達(dá),進(jìn)而減輕因香煙煙霧引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,減緩疾病。

綜上所述,Met通過下調(diào)miR-34a實(shí)現(xiàn)對(duì)COPD氣道炎癥的緩解,本文首次驗(yàn)證了COPD中Met與miR-34a的關(guān)系。但miR-34a靶基因較多,亦可能影響別的靶基因發(fā)揮作用,也將成為進(jìn)一步研究重點(diǎn)。