陳明杰，曹夢(mèng)園，王晨豫，閆雪琪，齊亞銀

石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000

0 引言

近年來(lái)，隨著人們生活質(zhì)量的提高，居民對(duì)乳制品的需求逐年增長(zhǎng)，但隨之而來(lái)的食品安全問(wèn)題也越來(lái)越受到人們的重視[1]。

目前，乳房炎仍然是奶牛養(yǎng)殖過(guò)程中最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的疾病之一，在我國(guó)的發(fā)病率達(dá)到了60.0%～70.0%，每年給我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失[2，3]。預(yù)防乳房炎對(duì)提升我國(guó)乳制品質(zhì)量安全水平具有重大意義[4]。奶牛乳房炎主要有兩種常見(jiàn)致病菌：一是傳染性病原菌，包括無(wú)乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌等；二是環(huán)境性病原菌，包括大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌等[5]。

奶牛乳房炎也會(huì)給牧場(chǎng)帶來(lái)很多損失，如導(dǎo)致牛奶廢棄、奶牛淘汰、用藥后的藥物殘留，乳制品品質(zhì)下降等[6]。因此，對(duì)乳房炎致病菌進(jìn)行分離鑒定并提供相應(yīng)的治療，預(yù)防方案十分必要[7]。

本試驗(yàn)為查明某規(guī)模牧場(chǎng)奶牛乳房炎致病菌，首先采集乳房炎奶樣，然后結(jié)合常規(guī)微生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)室診斷方法，對(duì)該場(chǎng)的乳房炎致病菌進(jìn)行分離鑒定及藥物敏感試驗(yàn)（以下簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”），并給出臨床用藥建議[8]，以期為奶牛乳房炎臨床治療及預(yù)防提供指導(dǎo)意見(jiàn)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2021年4月，在新疆某牧場(chǎng)采集40 頭患有乳房炎奶牛的奶樣，經(jīng)4 ℃保存運(yùn)輸。

1.2 主要試劑及藥品

肉湯（LB）培養(yǎng)基、LB瓊脂（上海生工生物工程股份有限公司）；無(wú)菌脫纖維綿羊血（德寧生物）；甘露醇高鹽瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；革蘭氏染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；藥敏試紙選擇為：磺胺嘧啶、頭孢喹肟、青霉素、林可霉素、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、林可霉素、卡那霉素、氨芐西林、強(qiáng)力霉素、頭孢噻吩、阿莫西林和環(huán)丙沙星等（杭州濱和微生物試劑有限公司）；DNA marker（南京諾維贊）；DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.3 乳房炎菌株的篩選及鑒定

1.3.1 菌株篩選

試驗(yàn)全程無(wú)菌操作，取一環(huán)乳樣接于LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過(guò)夜。將渾濁菌液采用環(huán)線手法分別接種在甘露醇高鹽平板、麥康凱平板、血瓊脂平板上，37 ℃溫箱培養(yǎng)18～24 h。觀察不同平板上的菌落形態(tài)。挑取麥康凱平板上紅色、邊緣光、濕潤(rùn)的菌落；血瓊脂平板上溶血的菌落；甘露醇高鹽平板上黃色的單個(gè)菌落（該菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基顏色也發(fā)黃），進(jìn)行涂片，染色鏡檢。同時(shí)將上述疑似菌株再進(jìn)行分離純化。

1.3.2 分離菌株的鑒定

對(duì)分離菌株進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）鑒定。按照全式金提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌DNA并保存?zhèn)溆谩Ｋx大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌引物如表1。

表1 引物序列

1.4 分離菌株的藥敏試驗(yàn)

1.4.1 分離菌株的藥敏表型檢測(cè)

把經(jīng)過(guò)分離得到的大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌分別接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，用生理鹽水將菌液濃度調(diào)節(jié)至（1～2）×10 CFU/mL。按紙片法的操作，吸取適量菌液涂布在瓊脂平板上，取出不同藥敏紙片，貼于瓊脂表面，不同藥敏紙片的間距至少24 mm。將平板置于溫箱培養(yǎng)24 h后，測(cè)量瓊脂上的抑菌環(huán)直徑。

評(píng)判結(jié)果參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)（CLSI2008）。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株的初步鑒定及生長(zhǎng)形態(tài)

菌液劃線于麥康凱平板上的菌落形態(tài)為紅色、邊緣光、濕潤(rùn)的菌落；大腸桿菌經(jīng)革蘭氏染色后，發(fā)現(xiàn)中等大小的革蘭氏陰性桿菌（圖1）。

圖1 大腸桿菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)結(jié)構(gòu)

菌液劃線于血瓊脂平板上的菌落形態(tài)為白色，菌落周?chē)霈F(xiàn)溶血環(huán)；經(jīng)革蘭氏染色后呈現(xiàn)陽(yáng)性球菌，鏈狀排布（圖2）。

圖2 鏈球菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)結(jié)構(gòu)

菌液劃線于甘露醇高鹽平板上的菌落形態(tài)為黃色，菌落周?chē)纬梢粋€(gè)黃色圓圈，符合金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)特性；該菌經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下呈球型，排列呈葡萄串狀，無(wú)芽孢、鞭毛，無(wú)莢膜（圖3）。

圖3 金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.2 PCR 鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物大小與預(yù)期一致，分別為264 bp、330 bp和1466 bp（圖4、5）。

圖4 大腸桿菌PCR 結(jié)果

2.3 藥敏表型檢測(cè)結(jié)果

大腸桿菌藥敏結(jié)果：對(duì)頭孢吡肟、頭孢曲松敏感的占80.0%，對(duì)恩諾沙星敏感的占50.0%，對(duì)多西環(huán)素敏感的占50.0%。

金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果：對(duì)頭孢吡肟敏感的占71.4%，對(duì)多西環(huán)素敏感的占90.0%，對(duì)頭孢曲松敏感的占81.4%，對(duì)卡那霉素敏感的占35.7%，對(duì)林可霉素敏感的占50.0%，對(duì)青霉素敏感的占46.4%。

鏈球菌藥敏結(jié)果：對(duì)頭孢吡肟敏感的占80.0%，對(duì)頭孢曲松敏感的占50.0%，對(duì)多西環(huán)素敏感的占80.0%，對(duì)卡那霉素敏感的占50.0%，對(duì)環(huán)丙沙星敏感的占20.0%。

圖5 鏈球菌、金黃色葡萄球菌PCR 結(jié)果

3 討論

引起奶牛乳房炎的病原菌種類繁多，其主要致病菌是大腸桿菌、鏈球菌以及金黃色葡萄球菌。此次共采集乳樣40 份，36 份分離出病原菌，分離率達(dá)到90.0%，其中大腸桿菌4 株，鏈球菌4 株，金黃色葡萄球菌28 株。

細(xì)菌分離和鑒定是乳房炎防治技術(shù)研究的基礎(chǔ)。本次分離結(jié)果以金黃色葡萄球菌為主，其次是大腸桿菌和鏈球菌。本試驗(yàn)的藥敏結(jié)果顯示，頭孢吡肟、頭孢曲松效果最好，可為該牧場(chǎng)臨床用藥提供一定的指導(dǎo)依據(jù)。為避免耐藥性，建議在進(jìn)行奶牛乳房炎治療時(shí)采取輪換用藥。