于 翠，李 欣，朱志賢，董朝霞，莫榮利，李 勇，鄧 文，熊 超，胡興明

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，湖北 武漢 430064）

硝化作用是連接固氮作用與反硝化作用的中間環(huán)節(jié)，不僅決定著植物對氮素的利用效率，還與過量氮肥投入導(dǎo)致的土壤酸化等一系列生態(tài)環(huán)境問題密切相關(guān)［1］。而氨氧化細(xì)菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）參與的氨氧化過程，是硝化作用的首個反應(yīng)過程，也是限制整個硝化作用反應(yīng)速度的重要過程［2］。研究結(jié)果表明，土壤環(huán)境因子的變化如pH 值、有機(jī)質(zhì)、施肥管理措施、土壤類型等的改變對土壤氨氧化微生物類群有特異選擇性［3-5］。國內(nèi)外大量研究表明，AOB 和AOA 對于施肥與pH 值等環(huán)境變化的響應(yīng)不同［6-9］。對湖南祁陽酸性紅壤研究表明，雖然AOB 與AOA的豐度都與土樣的硝化潛勢有非常顯著的正相關(guān)性，然而只有AOA 群落結(jié)構(gòu)受土壤pH 影響顯著［6］。內(nèi)蒙古草原上長期施用氮肥而導(dǎo)致酸化的土壤很大程度上改變了AOB的群落組成，而對AOA的群落組成影響較?。?0］。同時，Shen 等［11］研究表明，在堿性土壤中，土壤的pH 值和AOB的豐度呈顯著負(fù)相 關(guān)（r=-0.612，P＜0.01），而AOA 豐度和土壤pH 值沒有顯著相關(guān)性。但也有研究結(jié)果表明，不同施肥處理之間的AOA 和AOB 豐度不同，AOA amoA 基因的拷貝數(shù)量高于AOB amoA 基因［7，12-13］。然而，Nyberg 等［14］研究表明施肥不會引起氨氧化微生物群落組成的任何變化。以上研究說明，在不同生境、不同植物類型AOB 和AOA的群落結(jié)構(gòu)和活性對環(huán)境條件變化的響應(yīng)都存在差異，對土壤硝化作用的貢獻(xiàn)也不一樣，進(jìn)一步認(rèn)識兩類微生物在不同植物系統(tǒng)中的生態(tài)特點和它們在功能活性上的變化規(guī)律，對認(rèn)識氮循環(huán)具有重要意義。

湖北省是我國中部地區(qū)重要的蠶桑主產(chǎn)區(qū)，現(xiàn)有桑園面積約2 萬hm2，但桑園立地條件普遍較差，多處于山坡地帶，桑樹產(chǎn)葉量較低，蠶農(nóng)為了得到足量桑葉滿足養(yǎng)蠶需求，長期施用氮肥以增加產(chǎn)葉量。雖然氮肥的施入可提高桑樹的產(chǎn)葉量，但長期的超量施用也造成桑園土壤酸化現(xiàn)象嚴(yán)重（pH值小于5.5），土壤環(huán)境惡化，氮肥利用率逐漸下降，最終導(dǎo)致桑葉產(chǎn)量降低，品質(zhì)變劣，養(yǎng)蠶成績差。土壤酸化等環(huán)境因子發(fā)生改變會直接導(dǎo)致土壤微生物群落多樣性的改變［13］，尤其是土壤中功能微生物（氨氧化微生物）多樣性的變化［6，13］。近年來，國內(nèi)外研究者報道了pH 對于AOB 和AOA的影響［6-10］，但長期偏施氮肥引起桑園土壤酸化對土壤AOB 和AOA 種群結(jié)構(gòu)的影響尚未見研究報道，本文利用Real-time PCR 和PCR-DGGE 技術(shù)對以上問題進(jìn)行深入研究，為桑園氮素的有效管理及調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 桑園施肥處理及土壤樣品采集

試驗地位于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所的桑樹資源圃（30°35′N，114°37′E，海拔50 m），具有典型的亞熱帶季風(fēng)性氣候，平均年降水量為1269 mm，平均溫度為15.8～17.5℃。試驗桑樹品種為湖桑32 號，分別定植于1982、1997 和2010年，定植株行距為0.5 m×1.7 m。每個處理小區(qū)面積30 m2，重復(fù)種植4 個小區(qū)，自定植以來統(tǒng)一施用化肥尿素，施用量450 kg·hm-2氮素（N），肥料分2次施入，春季施入40%，夏伐后施入60%，施肥方式為溝施，施肥后覆土，以未施肥桑園田埂土壤為對照。

于2014 和2015 年5、7、11 月，采用“S”形5 點取樣法取施肥4 年（4Y）、17 年（17Y）、32年（32Y）和對照0 年（0Y）0～20 cm 土層土壤并分別混勻，記錄取樣點GPS 信息，共3 次采集，每次4 份樣品。一部分土樣（約100 g）用液氮速凍后置于-20℃保存，以供后續(xù)土壤微生物分子生物學(xué)研究；另一部分土樣則自然風(fēng)干，用于土壤理化性質(zhì)分析。土壤硝態(tài)氮的測定采用酚二磺酸比色法，土壤銨態(tài)氮測定采用納氏試劑比色法，土壤潛在硝化速率（PNR）測定采用格里斯試劑比色法，土壤有機(jī)質(zhì)測定采用重鉻酸鉀容量法［15］。

1.2 土壤DNA 提取和Rt-PCR 定量分析

每個施肥處理組取5 g 土樣，按照e.Z.N.A Soil DNA Kit 試劑盒（Omega Bio-Tec，USA）的操作步驟，提取土壤微生物總DNA。AOB 和AOA amoA基因采用iCycler iQ5 擴(kuò)增儀（Bio-Rad，USA）進(jìn)行熒光定量PCR 測定。表2 中列出了所用引物和TaqMan 探針的濃度。AOA amoA 基因擴(kuò)增體系為20 μL，包括10 μL SYBR?Premix Ex TaqTM（Takara，Japan），2 μL 牛血清白蛋白（25 mg·mL-1），正反引物各0.5 μL（10 μmol·L-1），DNA 稀釋液2 μL（1～10 ng）作為模板。氨氧化古菌amoA基因定量采用SYBR?Premix Ex TaqTM（TaKaRa）。AOB amoA 基因擴(kuò)增體系為25 μL，2.5U HotStar Taq DNA 聚合酶（Qiagen，Valencia，CA），正反引物各0.5 μL（10 μmol·L-1），DNA 稀釋液2 μL（1～10 ng）作為模板。數(shù)據(jù)分析采用iCycler 軟件（version 1.0.1384.0 CR）。定量PCR 及標(biāo)準(zhǔn)曲線測定采用He 等［6］和Shen 等［11］研究方法，PCR 效率為90%～100%，r2為0.98～0.99。

1.3 PCR 擴(kuò)增和變性梯度凝膠電泳（DGGE）

以提取的土壤微生物總DNA 為模板，分別利用AOB 與AOA amoA 基因的特異性引物對土壤樣品的AOB 與AOA的amoA 基因進(jìn)行擴(kuò)增［16］（表1），引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。擴(kuò)增體系為30 μL，包括：2×Es Taq MasterMix 15 μL，正反引物各10 μmol·L-11.2 μL，DNA 模板3 μL，RNase-Free Water 9.6 μL。擴(kuò)增完成后，取5 μL的PCR 產(chǎn)物，利用1%瓊脂糖膠對AOB 和AOA的amoA 基因進(jìn)行檢測。AOB 和AOA amoA基因擴(kuò)展的反應(yīng)程序見表1。

表1 變性梯度凝膠電泳（DGGE）和實時熒光定量PCR 擴(kuò)增引物、探針序列以及反應(yīng)程序

采用Bio-Rad D Gene 系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）分離PCR 產(chǎn)物。AOA amoA基因PCR 產(chǎn)物的分離采用8%聚丙烯酰胺凝膠，15%～55%變性梯度；AOB amoA 基因PCR 產(chǎn)物分離采用6%聚丙烯酰胺凝膠，30%～60%變性梯度，DGGE 電泳緩沖液為1×TAE。AOB 目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物分離的電壓80 V，電泳時間14 h；AOA 目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物分離的電壓先是200 V、10 min，然后是80 V、16 h。DGGE 電泳結(jié)束后，利用SYBR Green 核酸染料染色后，立即用Gel DOCTMXR+型號凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）成像和拍照。

1.4 克隆和測序及序列分析

將不同土壤樣品的主要DGGE 條帶切膠并進(jìn)行克隆和測序分析。以回收好的DNA 條帶溶液為模板，分別用引物amoA1F/amoA2R 和arch amoAF/arch amoAR 進(jìn)行再擴(kuò)增，按照純化試劑盒的操作步驟將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的PCR 產(chǎn)物連接到pMDTM18-T vector（Promega，USA）載體上，將連接好的反應(yīng)液加入到融好的DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過37℃培養(yǎng)后，根據(jù)藍(lán)白篩選的原理，挑取陽性克隆子，進(jìn)行菌落PCR 鑒定，挑取驗證的陽性克隆子接于LB 培養(yǎng)液，同時按照氨芐（10 mg·mL-1）：培養(yǎng)液為1∶1000 加入氨芐抗生素，于37℃搖床上震蕩過夜培養(yǎng)，然后送到擎科生物科技有限公司測序。將測序得到的amoA基因序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫，AOB 數(shù)據(jù)庫登錄號為KX036835-KX036853，AOA 數(shù)據(jù)庫登錄號為KX036800-KX036814。

運 用CHECK-CHIMERA 程序在RDP 在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行嵌合體檢驗，去除嵌合及怪異序列。所有獲得序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，由BLAST 去掉同源性對比相同的結(jié)果，選取文庫中amoA 基因序列和已知環(huán)境樣品進(jìn)行分析，共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用MEGA 5.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

獲得的DGGE 圖譜采用Quantity one 4.6.2（Bio-Rad）軟件對其進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分別對電泳條帶多少、條帶密度和多樣性3 個方面進(jìn)行分析。參照郭正剛等［17］的方法，采用Shannon 多樣性指數(shù)（H）、Pielou 均勻度指數(shù)（E）分析DGGE 圖譜。計算公式如下：H=-∑PilnPi，E=H/lnS。

式中，Pi=Ni/N，Ni為屬i的單菌落數(shù)量，N 為土樣中總單菌落數(shù)量，S 為屬i 所在土樣中屬的數(shù)目。

定量PCR 基因拷貝數(shù)均進(jìn)行以10 為底數(shù)的對數(shù)轉(zhuǎn)換。采用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA）、Tukcy 多重比較試驗，用Pearson 相關(guān)分析進(jìn)行氨氧化微生物多樣性指數(shù)與土壤理化指標(biāo)間的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮肥施用年限桑園土壤理化特性變化

氮肥對桑園土壤pH、有機(jī)質(zhì)、NH4+-N、NO3--N、潛在硝化速率等指標(biāo)的影響因氮肥施用年限不同而異（表2）。隨著氮肥施用年限的增加，桑園土壤pH、有機(jī)質(zhì)含量、NO3--N 含量、潛在硝化速率等指標(biāo)呈下降趨勢，而NH4+-N 含量呈升高趨勢。4Y土壤pH、有機(jī)質(zhì)含量、NO3--N 含量和潛在硝化速率顯著高于17Y 和32Y 土壤（P＜0.05）。

表2 氮肥施用不同年限桑園土壤的理化特性

2.2 不同氮肥施用年限桑園土壤AOB 和AOA 豐度比較

4Y 土壤中檢測出的AOB 豐度最高，其次是0Y 土壤（圖1A）。32Y 土壤中AOB的豐度最低，4Y 土壤AOB 豐度是32Y 土壤的21～76 倍。17Y土壤和32Y 土壤AOB 豐度無顯著差異。AOA 豐度對氮肥的反應(yīng)與AOB 不同，4Y、17Y 和32Y 土壤AOA 豐度比0Y 土壤高（圖1B），且32Y 和0Y 土壤之間達(dá)顯著差異水平，而2014 和2015 年5 和11 月4Y、17Y 和32Y 土壤間比 較無顯著 差異。AOB 和AOA amoA 基因拷貝數(shù)差異顯著，各處理AOB amoA 基因拷貝數(shù)為6.46×105～8.32×107·g-1干土，顯著高于AOB amoA 基因拷貝數(shù)1.70×104～1.20×105·g-1干土。AOB 與AOA amoA基因拷貝數(shù)的比值最高可達(dá)4894，表明氮肥施用年限顯著影響AOB amoA 基因的拷貝數(shù)（P＜0.01），而采樣時間對其沒有明顯影響（表3）。取樣時間顯著影響AOA amoA 基因的拷貝（P＜0.01），氮肥施用年限對其影響不顯著（表3）。

表3 氮肥施用和取樣時期對氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌amoA 基因拷貝數(shù)和DGGE 多樣性指數(shù)影響的顯著性分析

2.3 不同氮肥施用年限桑園土壤AOB 和AOA 種群結(jié)構(gòu)變化

DGGE 譜帶分析表明，AOB 與AOA 種群結(jié)構(gòu)對氮肥施用年限的反應(yīng)明顯不同（圖2）。對于AOB，DGGE 圖譜分析檢測到15 條豐度較高AOB目的基因條帶，條帶1 和2 是0Y 土壤特有條帶，條帶4～11 在4Y 土壤亮度較高，而在其他氮肥施用年限土壤中亮度較弱或沒有檢測到。條帶12 是17Y 土壤特有條帶，條帶14 和15 是32Y 土壤特有條帶。對于AOA，不同氮肥施用年限土壤AOA 種群差異明顯（圖2B），條帶5～11 在4Y 土壤亮度較高，而在其他處理中沒有檢測到，條帶13、14和15 在32Y 土壤亮度較高。

2.4 不同氮肥施用年限桑園土壤氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌種群結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)變化

各取樣時間4Y 土壤AOB 多樣性指數(shù)顯著高于其他氮肥施用年限處理土壤（P＜0.05）（除了2014年11 月17Y 土壤），而32Y 和0Y 土壤AOB的多樣性指數(shù)顯著低于4Y 和17Y 土壤（P＜0.05）。但是對于AOA，各取樣時間0Y 土壤AOA 多樣性指數(shù)低于其他處理土壤，2014 年7 月，各處理間土壤AOA 多樣性指數(shù)差異不顯著，而其他取樣時間4Y、17Y 和32Y 土壤間AOA 多樣性指數(shù)沒有顯著差異（除了2014 年11 月取樣），此外，11 月AOA多樣性指數(shù)明顯高于其他采樣時間（2014 年0Y 土壤除外）（表4）。主成分分析表明，主成分1（PC1）與主成分2（PC2）分別解釋了AOB 群落DGGE 條帶48.65%和23.34%的變異，AOA 群落DGGE 條帶45.02%和23.90%的變異，共解釋了總變異的71.99%（AOB）和68.92%（AOA）（圖3）。主成分荷載量分析表明AOB 不同施肥處理土壤間離散距離較近，這表明，氮肥施用年限對AOB 種群結(jié)構(gòu)影響比取樣時間明顯。然而，對于AOA 而言，相同取樣時間的處理間離散距離較近（除0Y 土壤），這表明取樣時間對AOA 種群結(jié)構(gòu)的影響比氮肥施用年限顯著（圖3）。ANOVA 分析表明，氮肥施用年限對AOB amoA 基因的多樣性指數(shù)影響顯著（P＜0.01），而對于AOA amoA 基因多樣性指數(shù)，氮肥施用年限和取樣時間對其均有一定的影響（表3）。

表4 氮肥施用不同年限桑園土壤氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌群落基于DGGE 條帶的多樣性指數(shù)比較

2.5 氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌 DGGE 條帶克隆測序和聚類分析

對有代表性的15 個AOB DGGE 條帶進(jìn)行切膠和測序，同NCBI 數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對，BLAST 結(jié)果表明，AOB 回收的條帶序列與不可培養(yǎng)氨氧化細(xì)菌的同源性為99%到100%。聚類分析表明，所分離到的AOB amoA 基因與Nitrosospira和Nitrosomonas 兩個屬的同源性最高，被定義為兩大簇3a 和3c（圖4），關(guān)于AOB 聚類的分類在He等［6］、Nyberg 等［14］的研究中已進(jìn)行了初步定義。0Y 土壤中檢測到的條帶1 和條帶2 與Nitrosomonas聚為一簇，條帶8 與施肥的紅土聚為一類，屬于3a集群。而其他大部分DGGE 條帶均與Nitrosospira菌屬歸為一類，屬于3c 集群。

AOA 系統(tǒng)發(fā)育分析表明，切膠測序的15 個條帶與從已研究土壤中選的6 個克隆被分成2 個類群，被定義為集群W 和Y（圖5）。8 個AOA 序列被歸為集群Y，其他條帶序列被歸為群集W。17Y和32Y 土壤中條帶14、條帶15 與NCBI 中酸性土壤序列聚為一類，屬于W2 集群。

2.6 土壤理化因子與土壤氨氧化微生物種群豐度相關(guān)性

長期偏施氮肥桑園土壤AOB 和AOA amoA基因豐度和種群結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)與土壤理化因子（pH、有機(jī)質(zhì)、NH4+-N、NO3--N、潛在硝化速率）之間的相關(guān)性分析表明，AOB amoA 基因豐度和多樣性指數(shù)與土壤潛在硝化速率呈顯著正相關(guān)關(guān)系（R=0.604 和0.515，P＜0.05），而AOA 與潛在硝化速率相關(guān)性不顯著。AOB amoA 基因豐度和多樣性指數(shù)與土壤有機(jī)質(zhì)（R=-0.512 和-0.451，P＜0.05）和pH（R=-0.602 和-0.535，P＜0.05）值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而AOA amoA 基因豐度和多樣性指數(shù)與土壤pH 值和有機(jī)質(zhì)相關(guān)性不顯著（表5）。

表5 桑園土壤氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌amoA 基因豐度和群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性

3 小結(jié)與討論

3.1 長期偏施氮肥對桑園土壤氨氧化微生物豐度的影響

施用氮肥不僅能夠改善土壤中氮素的有效性，同時也會改變與硝化作用密切相關(guān)的AOB 和AOA的種群結(jié)構(gòu)和豐度［4-7］。本研究中AOB amoA 基因拷貝數(shù)較高（6.46×105·g-1干土至8.32×107·g-1干 土），顯著高于AOA（amoA 基因拷貝 數(shù)1.70×104·g-1干土至1.20×105·g-1干土），表明AOB 和AOA 在硝化作用中發(fā)揮潛在的重要性不同，此結(jié)果與前人的研究結(jié)果不一致，劉靈芝等［7］和Li 等［18］發(fā)現(xiàn)AOA amoA 基因拷貝數(shù)顯著高于AOB amoA 基因拷貝數(shù)。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)氮肥施用4 年土壤中AOB 豐度顯著高于其他氮肥施用年限桑園土壤，此與Chen 等［19］報道的結(jié)果相一致，氮肥施用5 年顯著增加AOB 豐度；然而，長期施用氮肥顯著降低了AOB 豐度，氮肥施用17 年和32年桑園土壤AOB 豐度顯著低于4 年土壤，此結(jié)果與前人研究報告不一致，Chen 等［20］研究表明氮肥施用19 年稻田土壤與其他施肥處理土壤相比AOB豐度沒有顯著差異，而He 等［6］報道長期（17 年）施用氮肥刺激了土壤環(huán)境中AOB 豐度增長。對于以上相關(guān)研究結(jié)果不一致的一個可能的解釋是，長期施用氮肥導(dǎo)致土壤pH 值或有機(jī)質(zhì)含量發(fā)生變化（表2），而植物種類不同，其土壤中AOB 及AOA對土壤pH 值或有機(jī)物質(zhì)等土壤環(huán)境變化的響應(yīng)可能不同所致。

長期施用氮肥會導(dǎo)致土壤酸化［21］。本研究中，氮肥施用17 和32 年桑園土壤pH 值和有機(jī)物含量顯著降低，此結(jié)果與氮肥施用70 年Brunisol 土壤研究相一致［22］，也和氮肥施用16 年的稻田土壤一致［6］。本研究2014 和2015 年兩年結(jié)果一致表明，17Y 和32Y 土壤AOB 種群豐度較低，相應(yīng)土壤pH值和有機(jī)質(zhì)含量也低，這表明，土壤pH 值或有機(jī)物含量可能是調(diào)控土壤中AOB 豐度的重要因素，土壤pH 降低或有機(jī)質(zhì)含量的減少可能降低AOB 豐度。而與AOB 相比較，長期施用氮肥對AOA 豐度無顯著影響，AOA 豐度和pH 值之間無顯著相關(guān)性；DGGE 主成分分析也表明，取樣時間對AOA 種群結(jié)構(gòu)影響顯著，而氮肥的施用年限對其影響不顯著（圖3）。前人研究表明［23-24］，AOA 種群結(jié)構(gòu)主要受土壤類型的影響，而肥料種類對其影響效果較小。此結(jié)果與He 等［6］和Leininger 等［12］的研究結(jié)果不一致，其研究結(jié)果表明在酸性土壤中AOA 豐度受土壤pH 值影響較大。相關(guān)研究結(jié)果不一致的原因可能是作物品種、土壤類型、肥料種類和土壤理化性質(zhì)的不同導(dǎo)致的。

3.2 長期偏施氮肥對桑園土壤氨氧化微生物種群的影響

AOB amoA 基因序列的聚類分析表明，Nitrosospira或Nitrosospira 屬兩個集群在不同氮肥施用年限處理土壤中占主導(dǎo)地位，這與前人研究報道較一致［6，25］，Nitrosospira 是農(nóng)業(yè)施肥土壤中最常見的一類硝化細(xì) 菌［6］。雖 然Nitrosospira 集 群1 和2 已 經(jīng)被證明存在于水稻酸性紅土或施肥旱地土壤［26-27］，但是這些集群在本研究中沒有檢測到，表明長期施用氮肥的桑園土壤可能具有獨特的amoA 基因譜系。本研究中AOA 序列被分成兩種不同的集群（W 集群和Y 集群）。集群W 和集群Y 中的序列主要與6 種不同的土壤及Nitrososphaera 密切相關(guān)［6，28］。值得注意的是，從NCBI 中提取的酸性土壤序列與17Y 和32Y 土壤中分離的序列聚為同一類群W2 類群，這表明長期施用氮肥改變了AOA種群組成，17Y 或32Y 土壤AOA 類群可能和栽植地塊較酸土壤AOA 類群類似。

總之，長期偏施氮肥能夠引起桑園土壤酸化。AOB 和AOA 種群結(jié)構(gòu)及豐度對氮肥的反應(yīng)不同，長期施用氮肥對AOB 種群結(jié)構(gòu)和豐度影響較大，取樣時期對其影響較小，而長期施用氮肥對AOA豐度影響較小，對AOA 種群結(jié)構(gòu)影響較大。