趙佳佳 木尼熱·艾海提 張宇潔 楊俊玲 葉紅霞 許 忠

烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，新疆烏魯木齊 830000

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是一種神經(jīng)衰退性疾病，通常表現(xiàn)為運動遲緩，自主活動受限，集中體現(xiàn)在感覺、認(rèn)知和睡眠障礙等方面[1]。此病通常發(fā)生在中腦黑質(zhì)紋狀體區(qū)域，主要是多巴胺缺失[2]，目前，發(fā)病原因和機制尚不清楚。臨床西藥治療主要應(yīng)用左旋多巴，使用該藥后雖然能減輕患者的臨床癥狀，但并不能從根源上阻止神經(jīng)退化，且有較大的副作用[3]。近年來，中藥及其復(fù)方制劑在治療PD的神經(jīng)保護方面開展了大量研究，并獲得了成效[4-6]，已成為PD 防治藥物開發(fā)的熱點。

但是中醫(yī)臨床用藥多是個人經(jīng)驗總結(jié)，雖然療效顯著，但對PD的治療機制并不能明確解釋。因此，本研究運用生物信息學(xué)分析，篩選出PD 關(guān)鍵致病基因和信號通路，同時預(yù)測潛在治療中藥，為PD的發(fā)生機制和中藥治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 PD 差異表達基因的獲取

通過GEO 數(shù)據(jù)庫檢索PD 患者和健康人的基因表達信息，運用GEO2R 分析PD 組和健康對照組間的基因差異，將P <0.05，F(xiàn)C>1 倍的基因納入差異表達基因，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫，檢索PD 相關(guān)基因，兩個結(jié)果中共有基因為PD的顯著差異基因。

1.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interactions，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

用PPI 網(wǎng)絡(luò)分析基因或蛋白間的相互作用，通過String 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，將得到的PPI 信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖可視化。

1.3 靶點功能通路注釋

經(jīng)過GO 和KEGG 分析可知差異基因功能，進而分析其在疾病中的作用機制。將差異基因?qū)隡etascape 數(shù)據(jù)庫，選定物種為“homo sapiens”，校正名稱，所有的名稱都必須使用官方名稱。設(shè)定閾值P ＜0.05，進行分析，并對富集分析結(jié)果進行可視化。

1.4 靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖

使用Cytoscape 軟件，構(gòu)建靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖，以展現(xiàn)通路的關(guān)鍵基因。

1.5 潛在治療中藥篩選

運用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）和Coremine Medical 信息檢索平臺，輸入PD的關(guān)鍵基因，檢索出與該基因相關(guān)的潛在治療的中藥和化合物。

1.6 靶點-化合物分子對接

從PBD 數(shù)據(jù)庫中下載關(guān)鍵基因晶體結(jié)構(gòu)，與活性化合物進行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因篩選結(jié)果

按照篩選條件，得到基因表達譜系列（GSE22491）、（GSE54536），包括13例PD 患者和15 名健康對照標(biāo)本，經(jīng)GEO2R 分析，共獲取1610 個差異基因，其中上調(diào)基因1159 個，下調(diào)基因451 個；與GeneCards 數(shù)據(jù)庫中PD 相關(guān)基因取交集，最終篩選出576 個顯著差異基因，包括上調(diào)基因428 個，下調(diào)基因148 個，繪制韋恩圖和火山圖，具體見圖1。

圖1 顯著差異基因的韋恩圖和火山圖

2.2 靶點基因PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

在String 中輸入428 個上調(diào)基因，148 個下調(diào)基因，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，其等級值由節(jié)點的大小來代表。顯著上調(diào)基因：SRC、HSP90AA1、EGF、MMP9、FOS等；下調(diào)基因：TNF、CXCR4、CD19、FCGR2A、FCGR2B 等。見圖2。

圖2 靶點基因PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO 富集和KEGG 通路分析

使用Metascape 對上調(diào)差異基因進行GO 富集和

KEGG 通路分析，得到P <0.05的GO 條目1515 個，生物過程（biological process，BP）條目1265 個，細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目122 個，分子功能（molecular function，MF）條目128 個，部分顯著條目見圖3。KEGG 通路條目242 個，PI3K-Akt 信號通路得分最高，其次是MAPK 信號通路。見圖4（封四）。

圖3 GO 富集分析

使用Metascape 對下調(diào)差異基因進行GO 富集和KEGG 通路分析，得到P <0.05的GO 條目546 個，BP 條目452 個，MF 條目53 個，CC 條目41 個，部分顯著條目見圖3。KEGG 通路條目104 個，Tight junction信號通路得分最高，其次是Cancer、Neuroactive ligandreceptor interaction 信號通路。見圖5（封四）。

2.4 靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape 繪制通路網(wǎng)絡(luò)圖，圈代表通路，圈內(nèi)代表靶點基因，形狀越大代表富集越顯著。上調(diào)核心基因：SRC、MAPK14、ABL1、PRKCB、HSP90AA1 等，下調(diào)核心基因：GRIN1、CHRNA7、NOS1、GRIN2D、BCL2等，具體見圖6。

圖6 靶點基因-信號通路圖網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 潛在治療中藥篩選

結(jié)合PPI 分析結(jié)果和靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果，主要顯著基因有SRC、MAPK14、HSP90AA1、TNF、CXCR4、GRIN1。將其輸入TCMSP、Coremine Medical中，超過4 個基因共同關(guān)聯(lián)的中藥有30 味，前三位為虎杖、雷公藤、沙棘，具體見表1。

表1 潛在治療中藥頻數(shù)分布

2.6 靶點-化合物分子對接

將顯著基因SRC、MAPK14、HSP90AA1、TNF、CXCR4、GRIN1 輸入TCMSP、Coremine Medical 檢索口服生物利用度最高的潛在化合物，并進行分子對接，結(jié)果見表2、圖7。

圖7 顯著基因分子對接

表2 分子對接信息表

3 討論

結(jié)合PPI 網(wǎng)絡(luò)分析和靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果，主要顯著基因SRC的基因產(chǎn)物c-SRC 在多種腫瘤細(xì)胞中可過度表達并高度激活，與MAPK 和PI3K/Akt 信號途徑密切相關(guān)。HSP90AA1 參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與折疊，在保護細(xì)胞免受化療、缺氧等應(yīng)激損傷中發(fā)揮重要作用[7-8]。MAPK14 可促進炎癥因子的調(diào)控激活，宿主細(xì)胞可通過蛋白抑制MAPK14 從而抑制病毒，并且與細(xì)胞分化、增殖、免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)[9]。TNF 參與細(xì)胞的凋亡、生長、炎癥反應(yīng)和免疫功能等[10]。CXCR4 趨化因子受體在急性炎癥反應(yīng)過程中通過快速募集到炎癥部位參與構(gòu)成急性炎癥的第一道防線[11]。

KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)Neuroactive ligand-receptor interaction 信號通路，該通路是質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號通路相關(guān)受體和配體的集合，其中受體基因Chrm3 上調(diào)會增強膽堿能功能，與促進學(xué)習(xí)和提高記憶能力有關(guān)[12]。Tight junctions 信號通路能緊密連接表皮細(xì)胞，防止機械損傷和體外有害物質(zhì)入侵，調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)及炎癥細(xì)胞的選擇性滲透[13]。PI3K-Akt 信號通路參與細(xì)胞代謝、生存和死亡，該通路激活受阻與腦梗死、PD 等疾病的發(fā)生均密切相關(guān)[14]。使用PI3K 抑制劑wortmannin 可阻斷PI3K/Akt 通路，解除p-GSK-3β，加重多巴胺神經(jīng)元凋亡[15]。MAPK 信號通路可有效抑制神經(jīng)元損傷和死亡[16-18]，是PD 類疾病發(fā)病的主要信號通路。

潛在治療中藥虎杖的藥理實驗顯示[19-20]，其可有效抗菌抗病毒、擴張血管降低血壓、抗血栓、抗炎鎮(zhèn)痛及調(diào)節(jié)代謝等，在心血管方面療效顯著?；⒄戎邪邹继J醇及白藜蘆醇脂質(zhì)體對PD 模型大鼠黑質(zhì)細(xì)胞具有明顯的保護作用。潛在治療中藥雷公藤具有活血化瘀、殺蟲消炎、降低血黏度、改善微循環(huán)等作用，并且雷公藤內(nèi)酯對1-甲基-4-苯基-吡啶PD 大鼠模型具有神經(jīng)保護作用[21]。潛在治療中藥沙棘具有祛痰止咳、消食化滯、活血散瘀的功效，能增強免疫，抗腫瘤，抑制血栓、改善心腦血管功能等。針對PD 患者不同程度的瘀血阻絡(luò)，均可明顯改善[22-23]。

化合物L(fēng)-絲氨酸在細(xì)胞膜及神經(jīng)細(xì)胞鞘形成等過程中發(fā)揮重要作用[24]。酪氨酸在甲狀腺機能亢進等疾病治療中有重要作用。雷公藤甲素具有抗老年性癡呆癥作用，有效抑制Aβ 誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì)的釋放，減輕Aβ 所致的大腦皮質(zhì)膽堿能纖維損害，改善學(xué)習(xí)記憶能力[25]?？Х纫蛟谥委熒窠?jīng)衰弱和昏迷復(fù)蘇作用顯著，有助于改善PD 患者的運動能力[26]。

綜上所述，本研究從生物信息學(xué)角度系統(tǒng)分析了PD的病理機制和潛在治療中藥。通過SRC、MAPK14、TNF、CXCR4、GRIN1 等靶點作用，調(diào)控PI3K-Akt、MAPK、Tight junction 等信號通路來達到治療目的，為PD的臨床治療提供參考依據(jù)。